生物膜不仅是细胞和细胞器的基本结构，还在分隔、调节分子运输和信号传导中扮演核心角色。细胞穿膜肽（CPP）是一类能够在不引起细胞毒性的情况下穿透细胞膜的短阳离子肽，与同样作用于膜的抗菌肽（AMP）同属膜活性肽（MAPs）家族。尽管实验研究广泛，但对其在分子水平的作用机制理解尚不充分。分子动力学（MD）模拟作为一种强大的工具，能够在原子分辨率下研究肽与膜的相互作用，但受限于计算资源，传统MD难以捕获这些复杂过程。为此，多种增强采样技术应运而生。
CPP历史
对MAPs的早期研究揭示了某些天然肽序列具有破坏生物膜的能力，例如蜂毒中的蜂毒肽（melittin）、电压依赖性成孔肽阿拉霉素（alamethicin）以及从两栖动物皮肤中分离的抗菌肽爪蟾抗菌肽（magainin）。这些在20世纪80年代被广泛表征的肽主要通过成孔等机制改变膜通透性，而非非细胞毒性的跨膜转运。这一概念区分为此后识别和理解CPP奠定了基础。1988年，人类免疫缺陷病毒（HIV）-1的反式激活因子（TAT）蛋白被发现具有穿越细胞膜的能力，其穿膜活性被定位在一个富含赖氨酸和精氨酸的短序列上，即TAT CPP。1991年，在黑腹果蝇的触角足蛋白中也观察到了类似现象，其穿膜能力源于蛋白质的第三α螺旋，该片段后来被命名为penetratin。自此，CPP领域快速发展，数据库中已验证的CPP条目数量逐年激增。
分类
CPP可根据其物理化学性质、来源和结构特征进行分类。根据理化性质，主要分为四类：阳离子型、两亲性、疏水性和刺激响应型CPP。阳离子CPP（如聚精氨酸Arg9、TAT、penetratin）富含带正电的精氨酸和赖氨酸，易于与带负电的细胞膜表面相互作用。两亲性CPP（如模型两亲肽MAP、转运肽10（TP10）、Pep-1）同时具有亲水和疏水部分，可分为初级、二级α螺旋、二级β折叠和富含脯氨酸的亚类。疏水性CPP（如卡波西肉瘤成纤维细胞生长因子K-FGF、易位肽2 TP2）主要依赖疏水相互作用跨膜。刺激响应型CPP（如pH（低）插入肽、富含组氨酸的合成肽LAH4-L1）则在酸性条件（如肿瘤微环境）下表现出膜活性。此外，也存在阴离子型CPP（如SAP10、LE10、p28）的报道。
根据来源或设计，CPP可分为天然（如TAT、penetratin）、嵌合或合成（如transportan、Pep-1）三类。除了常见的线性结构，为提高对蛋白酶降解的抵抗力，还开发出了环状、订书肽和树枝状结构等修饰形式。
进入机制
CPP进入哺乳动物细胞膜的机制一直是研究和争论的焦点，主要包括能量非依赖性和能量依赖性途径。能量非依赖性途径涉及直接跨膜易位，主要有倒置胶束模型、地毯模型、膜变薄模型和孔形成模型（如桶状和环形孔）。其中，倒置胶束模型认为静电作用诱导膜曲率局部变化形成倒置胶束包裹肽；孔形成模型则认为肽在膜上聚集形成水通道；地毯模型则描述了肽平行排列于膜表面，达到临界浓度后破坏局部脂质排列。
能量依赖性途径则依赖于囊泡形成的内吞作用，包括巨胞饮作用、网格蛋白介导的内吞作用（CME）、小窝蛋白介导的内吞作用（CvME）以及不依赖于网格蛋白和小窝蛋白的内吞途径。具体采用哪种机制取决于肽的理化性质、浓度、所携带的货物性质以及靶膜组成等多种因素。例如，富含精氨酸的肽（如TAT、Arg9）主要依赖内吞途径，而penetratin在低浓度时通过能量非依赖过程跨膜，高浓度时则转为内吞摄取。跨膜电位（ΔΨ）也被认为有利于瞬时孔的形成，是促进易位的重要因素。
计算技术
实验方法（如光谱学、显微术）在阐明CPP结构、行为和膜相互作用方面发挥了重要作用，但在解析原子尺度细节或捕捉动态瞬态事件方面存在局限。计算建模，特别是分子动力学（MD）模拟，提供了原子层面的见解，成为实验研究的有力补充。然而，CPP的跨膜过程发生在秒到分钟级别，远超传统MD（cMD）通常能达到的微秒尺度。为此，发展了一系列增强采样技术来克服这一限制。
本文综述了研究CPP的主要MD方法。牵引分子动力学（SMD）及其改进的自适应版本（aSMD）通过施加外力牵引肽跨膜，可用于计算自由能面或平均力势（PMF）。元动力学（MetD）利用有限的集体变量（CVs）重建系统自由能面。伞形采样（US）将反应坐标划分为重叠窗口以采样不利构型。副本交换分子动力学（REMD）通过在不同热力学条件下并行模拟多个副本并交换以提高采样效率。加权系综（WE）方法将构象空间离散化，运行多条平行轨迹以探索稀有但生物学相关的转变。此外，高温MD（HT-MD）、膜张力MD（MT-MD）、粗粒度MD（CG-MD）以及隐式膜模型（IMM）等策略也被用于促进或加速对肽跨膜过程的研究。然而，这些方法各有优缺点，例如SMD/US依赖外部偏置可能扭曲自然动力学，CG-MD牺牲了原子细节，IMM1仅适用于α螺旋肽且无法明确表示膜-肽相互作用。
新提出的方法
为应对传统方法的局限性，我们课题组提出了两种专门的模拟策略：结合常规MD的自适应牵引MD（aSMD+cMD）框架和计算电生理学（CompEL）方法。
aSMD+cMD协议既能定量估算自由能（通过PMF计算），也能定性评估肽易位后的膜扰动。在该混合工作流中，首先使用aSMD主动牵引肽穿过脂质双分子层，计算与膜易位相关的PMF。随后的cMD模拟则捕捉肽-膜系统的松弛和重组，提供原子分辨率的详细结构和动力学信息。该技术使我们能够监测肽跨膜易位的每个主要阶段：从与膜外叶上部区域的初始结合（分配），到向膜疏水核心的推进（插入），再到可能引发跨膜孔形成的扰动。
计算电生理学（CompEL）方法则通过在模拟体系中施加跨膜电场，模拟生理相关的膜电位，研究电场驱动下离子的跨膜传输以及肽诱导的孔道形成，为理解在电场影响下CPP的易位行为提供了新视角。
这些方法旨在克服传统和增强采样技术的限制，同时保持原子水平的准确性和机制的可解释性，为深入理解CPP的跨膜机制及设计更有效的细胞内递送系统提供了新的计算工具。
