引言
类风湿关节炎（RA）是一种以慢性滑膜炎症和进行性关节破坏为特征的自身免疫性疾病，全球患者众多，严重影响生活质量。甲氨蝶呤（MTX）是RA的一线治疗药物，但其全身给药常导致关节靶向性不足和剂量限制性毒性。关节腔内（IA）注射作为一种靶向策略，可直接将药物递送至病变关节，但游离MTX在关节内清除迅速，疗效短暂。因此，开发能够延长关节内药物滞留、实现缓释的递送系统成为研究重点。本研究在此背景下，评估了IA注射甲氨蝶呤负载微海绵（MTX-MSP）作为一种局部治疗策略的潜力。
在病理滑膜液中的药物释放与载体降解
研究首先在病理条件下的人滑膜液（HSF）中评估了MTX-MSP的释放行为。如图1A所示，游离MTX在HSF中释放迅速，3小时内即完全释放。相比之下，MTX-MSP表现出显著的缓释特性：初始（0小时）几乎无释放（约2%），3小时仅释放43%，24小时释放68%，并在14天内实现完全释放。这种缓释行为归因于药物在微海绵多孔聚合物基质中的扩散限制。
为了阐明释放机制是否也受载体降解影响，研究进一步评估了MTX-MSP在不同介质中的质量损失。在PBS（非酶条件）中，24小时内载体质量无明显损失，表明其内在结构稳定。而在透明质酸酶（HAase）和HSF（富含酶环境）中，24小时即观察到可检测的质量损失（HSF中约23%），14天后质量损失显著增加（HSF中约65-70%）。这些结果表明，MTX-MSP的释放机制具有双重性：初期以扩散为主导，后期在酶促环境下，载体逐渐降解辅助药物释放。这种炎症响应性的降解特性，使其非常适合RA病理关节环境。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析证实，MTX主要通过氢键和静电作用等非共价相互作用载入微海绵，而未显著改变聚合物基质结构，这支持了其缓释特性和给药前的结构稳定性。
关节炎条件下的流变学评估
药物的释放和滞留受关节内环境流变学性质影响。研究通过流变学分析，评估了MTX-MSP在HSF中的行为。未稀释的病理HSF表现出典型的假塑性流体行为，即高剪切速率下粘度降低。当MTX-MSP分散在HSF中时，其在低剪切速率下的粘度和屈服应力均高于单独的HSF或空载微海绵（MSP）的混合物。这表明药物负载增强了分散体系的微观结构凝聚力，可能是由于MTX、聚合物基质与滑液成分（如透明质酸、蛋白质）之间产生了额外的物理相互作用，形成了一个更具内聚性的网络。这种强化可能进一步影响药物的扩散控制释放动力学。
振荡剪切测试进一步揭示了其粘弹性。在RA中，病理滑液往往更偏向粘性。有趣的是，MTX-MSP的加入将储能模量（G‘，弹性分量）和损耗模量（G″，粘性分量）的交叉点向更低模量方向移动，表明其部分恢复了在RA中常丧失的弹性响应。这些流变学变化发生在关节运动典型经历的剪切速率和频率范围内，支持了所观察到的流变学增强可作为预测关节内滞留的相关指标。
微海绵制剂的注射性评估
注射性是IA给药的关键。研究在25°C下评估了制剂注射前的流变特性。所有配方（PBS、MSP+PBS、MTX-MSP+PBS）的表观粘度和剪切应力均在可接受范围内。根据拟合的赫歇尔-巴尔克莱（Herschel–Bulkley）模型参数估算，所有制剂的注射力远低于1 N，表现出优异的注射器可推注性。尽管负载MTX的微海绵显示出比空载系统更高的粘度，但仍处于临床注射的舒适范围内，证实其适合通过标准针头进行IA给药。
MTX负载微海绵对人成纤维样滑膜细胞（FLSs）的体外评估
研究在从RA患者分离的原代FLSs中评估了MTX-MSP的生物相容性和抗炎功效。细胞活力实验表明，在25和50 μg/mL浓度下，无论是游离MTX还是MTX-MSP，处理24和72小时后细胞均保持活力。
在抗炎效果方面，MTX-MSP在降低关键促炎细胞因子的基因和蛋白表达水平上，优于同等浓度的游离MTX。在mRNA水平，MTX-MSP在25和50 μg/mL浓度下均能有效降低IL-6表达；对于IL-1β，游离MTX仅在50 μg/mL有效，而MTX-MSP在两个浓度下均有效；特别值得注意的是，只有25 μg/mL的MTX-MSP能显著降低TNF-α的mRNA表达，而游离MTX无效。
在蛋白水平，ELISA检测得到了类似的结果。MTX-MSP和游离MTX均能降低IL-6蛋白分泌；对于IL-1β蛋白，仅50 μg/mL的MTX-MSP和游离MTX有统计学意义的降低；而TNF-α蛋白则仅被MTX-MSP显著降低。空载MSP在所有测试浓度下均无抗炎效果。这些结果强有力地表明，MTX-MSP能更有效地抑制RA关键炎症通路，其效果并非来自载体本身，而是源于MTX的缓释和增强的细胞摄取或作用。
关节组织病理学与IA治疗的系统性影响
最后，研究在胶原诱导关节炎（CIA）大鼠模型中进行了初步体内实验，以评估治疗效果。每周对右膝关节进行IA注射，并分析双侧膝关节的组织病理学变化。
苏木精-伊红（H&E）染色显示，阳性对照组（未治疗RA大鼠）关节出现严重病变，包括软骨侵蚀、滑膜增生、炎性细胞浸润和软骨下骨结构破坏。单独使用MTX或空载MSP治疗可部分改善这些病理变化。而MTX-MSP（无论是离心后悬液还是冻干重悬制剂）联合治疗则表现出最佳的保护效果，能最大程度地保持软骨完整性，减少炎症浸润。
量化组织病理学评分（RA评分）进一步证实了这些观察。如图8所示，在治疗侧（右膝）和对侧未治疗关节（左膝），MTX-MSP治疗组均获得了最低的RA评分，表明其对双侧关节均有显著保护作用。这一发现表明，尽管治疗是局部进行的，但其效应具有系统性，可能触发了更广泛的免疫调节机制，或导致生物活性物质的循环，从而惠及未治疗的关节。
为探索系统性影响，研究检测了血清中的促炎细胞因子。结果显示，IL-1β在所有治疗组中均显著降低，在MTX-MSP组中效果最强；TNF-α仅在MTX-MSP离心组中显著降低；而IL-6和II型胶原抗体水平在各组间无显著差异。这些结果提示存在选择性且部分的全身性炎症介质调节，但这 alone 不足以完全解释显著的组织病理学改善，因此局部或组织特异性机制也做出了重要贡献。
结论
本研究证实，IA注射甲氨蝶呤负载微海绵（MTX-MSP）是治疗RA的一种有效策略。该制剂能够在病理滑膜液中实现长达14天的药物缓释，最大限度地减少突释效应，并保持载体完整性。其释放机制初期以扩散为主，后期在酶促环境下发生渐进性降解，共同促成长期药物释放。流变学研究表明MTX-MSP能与病理滑液相互作用并增强其弹性响应，同时注射性测试证实其易于临床给药。
体外实验表明，MTX-MSP在降低人FLSs中IL-6、IL-1β和TNF-α等关键促炎因子表达方面优于游离MTX。体内CIA大鼠模型实验则揭示了其双重益处：不仅在治疗关节表现出优异的局部疗效，还对侧未治疗关节产生保护作用，暗示了局部给药所能引发的全身免疫调节。
综上所述，MTX-MSP作为一种创新的生物材料递送平台，通过增强MTX的治疗特性、实现关节靶向的长效释放并可能引发有益的全身免疫调节，为RA等慢性关节炎症的持续管理提供了充满前景的新策略。
