下一代口服高效选择性KRAS G12C共价抑制剂Divarasib的发现、表征及其临床前与临床应用前景

KRAS是癌症中最常突变的致癌基因之一，靶向其G12C突变体的药物开发是肿瘤治疗领域的重要突破。本文综述了新一代口服、高效、选择性KRAS G12C共价抑制剂Divarasib (GDC-6036) 的发现与表征。该研究通过优化KRAS蛋白“后口袋”的相互作用，显著增强了抑制剂与靶点的非共价结合力，使其在体外生化、细胞及动物模型中展现出优于已获批药物Sotorasib和Adagrasib的强效、快速烷基化动力学和选择性。文章详细阐述了其作用机制、结构优化策略、药代动力学特性及临床前与早期临床数据，为KRAS G12C驱动型癌症的治疗提供了新的希望。

引言

KRAS是首批被发现的致癌基因之一，也是人类癌症中突变频率最高的基因。其中，密码子12处的突变，特别是KRAS G12C，在非小细胞肺癌、胰腺导管腺癌和结直肠腺癌等难治性癌症中极为常见。KRAS是一种GTPase，在细胞内发挥着分子开关的关键作用，调控着细胞生长和存活相关的核心信号通路。在静息状态，KRAS与GDP结合；当上游受体信号激活鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs，如Son of Sevenless (SOS)）后，KRAS会转变为GTP结合的活化状态，进而激活下游RAF、PI3K等效应蛋白，驱动肿瘤生长。致癌突变（如G12C）会减弱GTP酶激活蛋白（GAP）介导的GTP水解，导致KRAS信号异常激活。

长期以来，KRAS因其与核苷酸的高亲和力及缺乏可成药口袋而被视为“不可成药”靶点。2013年，Ostrem等人的开创性工作发现了一类可共价靶向KRAS G12C突变体、结合于“开关-II口袋”的小分子抑制剂。这类抑制剂并非直接阻断活化状态的KRAS G12C，而是结合在其失活的GDP结合状态，通过诱导开关-II螺旋的构象变化，阻止SOS对其的再激活。近年来，多个研究团队成功开发了靶向开关-II口袋的KRAS G12C共价抑制剂，其中Sotorasib和Adagrasib已获FDA加速批准用于治疗KRAS G12C突变型非小细胞肺癌。然而，单药治疗的临床获益有限，且已观察到获得性耐药。因此，开发更强效的新一代抑制剂，以期实现更快、更强、更持久的靶点抑制，或为联合用药提供更佳选择，具有重要的临床意义。

结果与讨论

本研究旨在通过优化分子与KRAS蛋白“开关-II口袋”最深区域（也称为“后口袋”）的相互作用，以提升抑制剂的效力。研究团队选择了喹唑啉支架作为起点，该支架不仅能有效填充开关-II口袋，还能通过哌嗪连接臂与丙烯酰胺弹头相连，指向Cys12，同时具备向“后口袋”区域（靠近Asp69）进行探索的合适向量。

初步设计中，在喹唑啉C7位引入异喹啉基团（化合物1）以填充“后口袋”的疏水腔，并在异喹啉C3位引入氨基，旨在同时与Asp69和Glu63形成氢键。该化合物在SOS1催化核苷酸交换的生化（IC₅₀= 41 nM）和细胞靶点占位（IC₅₀= 590 nM）实验中均显示出活性。为降低芳香环数量，研究团队用带有甲基的氨基吡啶替代了氨基异喹啉（化合物3），但导致效力显著下降。随后，将甲基扩展为三氟甲基（化合物4），其生化效力提升了近20倍，细胞效力提升了13倍。进一步在吡啶上引入一个额外的甲基，得到四取代的吡啶（化合物5），生化与细胞效力又分别提升了9倍和6倍。

化合物4与KRAS G12C的共晶结构（图1a）证实，其氨基与Asp69的羧酸根和Glu63的主链羰基形成氢键，吡啶氮原子则通过水分子介导与Arg68和Glu63主链相互作用。三氟甲基深埋于“后口袋”，与多个残基形成范德华相互作用。在优化“后口袋”基团后，研究团队进行了进一步修饰：在喹唑啉C8位引入氟原子（R₂），将哌嗪连接臂的R₃位甲基化以控制其扭转构象，并优化了抑制剂的手性构型。结合了所有这些优化的氨基吡啶化合物9a，在生化实验中达到了亚纳摩尔级的效力。最终，在喹唑啉C2位（R₄）引入脯氨醇基团，得到了化合物10，即Divarasib (GDC-6036)。其生化效力极高，通过酶滴定法测得的K_d为2.4 pM，相比化合物9a提升了近80倍。

Divarasib（化合物10）的共晶结构（图1b）揭示了其增效的分子机制。在吡啶上添加的甲基改变了相邻三氟甲基的构象，喹唑啉C8位的氟引入了轴向手性，这些变化共同优化了取代吡啶在“后口袋”中的契合度，增加了与包括Val103在内的残基的范德华接触。与化合物4相比，Divarasib的四取代吡啶能更充分地填充并扩张“后口袋”区域，与蛋白质的接触面也更广。脯氨醇与Glu62形成盐桥，导致开关-II环和相邻螺旋的位置发生偏移。哌嗪的甲基化使其构象从扭曲式转变为椅式，改变了丙烯酰胺弹头指向Cys12的轨迹。Divarasib是细胞烷基化实验中最有效的化合物（IC₅₀= 2.2 nM），在三维培养条件下的NCI-H358细胞增殖实验中，其IC₅₀更是达到了0.21 nM。

研究通过基于荧光标记肽置换的动力学实验，测定了一系列关键化合物的k_inact/K_I（催化效率），该参数与SOS交换实验中测得的效力高度相关，表明生化效力的提升是由共价催化效率的提升驱动的。为了解效力的提升是源于非共价结合力（K_I）的增强还是共价反应速率（k_inact）的加快，研究团队合成了几个关键化合物的非反应性乙酰氨类似物（11-13）。表面等离子共振（SPR）实验显示，与早期化合物相比，Divarasib的乙酰氨类似物13对KRAS G12C的亲和力（K_d= 0.63 µM）有显著提升，这与相应丙烯酰胺母体分子在k_inact/K_I上的提升倍数相似。这表明，在Divarasib的开发过程中，效力的巨大提升主要归功于对开关-II口袋非共价结合亲和力的优化。尽管共价性对总效力和选择性至关重要（化合物10与其乙酰氨类似物13在SOS交换实验中的效力相差约60万倍），但该研究证明，即使在非共价结合力得到显著改善后，共价与非共价抑制之间巨大的效力差异依然可以维持。

与已获批的KRAS G12C抑制剂Sotorasib和Adagrasib的直接比较显示，Divarasib在k_inact/K_I生化实验中效力分别是后两者的100倍以上和12倍。在三维培养的细胞烷基化实验中，Divarasib也显示出显著更强的效力（图3a）。对细胞烷基化动力学的评估显示，Divarasib的k_max/EC₅₀（细胞内的催化效率）分别是Sotorasib和Adagrasib的12倍和15倍，表明其在更低浓度下能实现更快的靶点烷基化速率（图3b）。在包含19个KRAS G12C驱动细胞系的活力实验panel中，Divarasib的几何平均IC₅₀为0.56 nM，效力分别是Adagrasib和Sotorasib的6倍和12倍，并且对非KRAS G12C细胞系（如PC-9）具有超过9200倍的选择性。通过半胱氨酸蛋白质组学实验进一步证实，在检测到的11000多个半胱氨酸位点中，Divarasib仅特异性且显著地阻断了KRAS G12C位点的反应性，显示出极高的选择性（图4）。

在药代动力学方面，Divarasib分子量为622，LogD_7.4为2.3，具有良好的溶解性（150 µM）和中等透膜性。在小鼠和食蟹猴体内表现出低至中等的清除率和分布容积，在大鼠和狗体内则清除率较高。其口服生物利用度为5%至25%。在两种KRAS G12C突变的人源肿瘤异种移植模型中，Divarasib均显示出强大的抗肿瘤活性。在高KRAS G12C依赖性的NCI-H358模型中，低至5 mg/kg的剂量即可导致肿瘤消退；在敏感性较低的NCI-H2122模型中，100 mg/kg剂量可实现肿瘤停滞。详细的药代动力学/药效学（PK/PD）研究（图6）将血浆药物暴露、肿瘤KRAS G12C烷基化水平与MAPK信号通路下游基因（DUSP6和 SPRY4）的表达抑制相关联，建立了剂量依赖性的靶点占位与通路抑制关系。

结论

本文介绍了新一代KRAS G12C抑制剂Divarasib的发现，并证明其在生化和细胞实验中，其效力与烷基化动力学均优于目前已获批的Sotorasib和Adagrasib。效力优化主要源于对KRAS“后口袋”区域吡啶基团的优化以及在喹唑啉C2位引入脯氨醇基团，从而显著增强了抑制剂与靶点的非共价结合亲和力。高亲和力结合与丙烯酰胺弹头相对于Cys12的优化定位，共同实现了开关-II口袋内高效、快速的共价键形成。Divarasib在体内模型中显示出对不同敏感性肿瘤的有效抑制，并在I期临床试验中展现出可管理的安全性特征和令人鼓舞的抗肿瘤活性。目前，Divarasib正作为单药或与其他抗癌疗法联合，在多种携带KRAS G12C突变的实体瘤患者中进行多项临床研究，为改善这类患者的治疗结局带来了新的希望。