引言
动脉粥样硬化是一种由脂质（特别是氧化低密度脂蛋白LDL）在动脉壁积累引发的慢性炎症性疾病，涉及血管和免疫细胞的复杂炎症反应。单核细胞在动脉粥样硬化形成中起关键作用，其浸润斑块并分化为巨噬细胞，摄取脂质后成为泡沫细胞，放大炎症并促进斑块生长。巨噬细胞可根据微环境信号极化为促炎的M1型或组织修复的M2型。核因子κB（NFκB）的激活（主要通过Toll样受体TLR）是促进M1表型、过表达促炎细胞因子的关键因素。NOD样受体-3（NLRP3）炎症小体通路的激活也能上调M1相关细胞因子（如IL-1β和CXCL10），并下调M2相关因子（如ArgI和CD206）。尽管脂质积累仍是斑块形成的主要驱动力，但持续的炎症微环境可能进一步增加残余心血管风险。因此，新的抗动脉粥样硬化疗法需要针对血管炎症。
前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）除了通过降解低密度脂蛋白受体（LDLR）来减少致动脉粥样化脂蛋白如LDL-C的清除外，还被认为与巨噬细胞的上调和募集有关，从而促进血管组织内的局部炎症过程。PCSK9抑制剂如阿利西尤单抗（Alirocumab）可降低血浆LDL-C和延缓斑块进展，但其对巨噬细胞的直接抗炎作用尚未完全阐明。先前研究表明，PCSK9基因沉默可通过TLR4-NFκB通路直接减少ApoE−/−小鼠动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞浸润和细胞因子水平。然而，PCSK9是否影响已建立的巨噬细胞炎症表型的维持和放大以及下游NLRP3的激活，尚未得到充分探索。
方法
人体研究
为探究PCSK9与全身性炎症的潜在关联，我们在1190名急性冠脉综合征（ACS）患者队列中量化了循环PCSK9水平及一组炎症生物标志物。患者来自马德里五家医院开展的BACS-BAMI研究。在入院时记录临床变量，并采集空腹血样进行分析。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定PCSK9，使用标准化酶法测定LDL-C浓度，并量化了包括高敏C反应蛋白（hs-CRP）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、成纤维细胞生长因子-23（FGF-23）和白细胞介素-18（IL-18）在内的促炎因子。
体内研究
使用载脂蛋白E缺陷（ApoE−/−）小鼠作为高胆固醇血症和加速动脉粥样硬化模型。给ApoE−/−小鼠（雄性，10-12周龄）喂食西方饮食15周以加速斑块进展。在西方饮食第2周，将动物随机分为对照组和治疗组（PCSK9单克隆抗体阿利西尤单抗，10 mg/kg/周，分两次皮下注射）。在第15周处死动物，收集外周血、主动脉弓、降主动脉、脾脏和肝脏。评估体重、血浆脂质谱、细胞因子。通过油红O（ORO）和CD68、CD80等免疫染色定量动脉粥样硬化病变和巨噬细胞浸润。通过流式细胞术分析外周血和脾脏中的单核细胞/巨噬细胞群。通过qPCR检测降主动脉中炎症及修复相关基因的表达。
体外研究
使用人THP-1单核细胞系，用PMA将其分化为naïve巨噬细胞（M0），然后用IFN-γ和LPS极化为M1巨噬细胞。用重组人PCSK9（hPCSK9）刺激M1巨噬细胞。使用NFκB抑制剂（parthenolide）、NLRP3抑制剂（MCC950）、TLR4抑制剂（TAK-242）和阿利西尤单抗进行预处理或共处理。通过siRNA沉默TLR4基因。通过qPCR、Western blot、免疫荧光评估基因和蛋白表达、NFκB p65核转位等。
结果
PCSK9与ACS患者促炎生物标志物的关联
在1190名ACS患者中，通过分位数回归分析，发现即使在调整了性别、年龄、BMI、LDL-C、既往他汀或依折麦布使用、冠状动脉疾病、高血压、2型糖尿病、血脂异常后，PCSK9与hsCRP和FGF-23在0.75分位数（第75百分位数）仍存在显著关联。PCSK9浓度在hsCRP和FGF-23的第三三分位数（T3）中显著升高，而与LDL-C水平无关。这些发现表明，在ACS患者中，升高的PCSK9水平与循环hsCRP和FGF-23浓度增加相关，而与LDL-C无关，支持了PCSK9在此条件下不依赖于脂质的促炎作用。
阿利西尤单抗降低ApoE−/−小鼠炎症但不影响高脂血症
喂食西方饮食15周后，ApoE−/−小鼠血浆脂质和促炎细胞因子TNF-α、IL-6水平升高。给予阿利西尤单抗13周，虽然过表达了肝脏和血浆PCSK9，但并未改变体重和脂质谱。然而，阿利西尤单抗显著降低了血清TNF-α和IL-6水平，并改变了循环单核细胞的表型：增加了抗炎的CD45+/CD11b+-Ly6Clow单核细胞比例，而促炎的Ly6Chigh单核细胞未改变。在脾脏中，阿利西尤单抗减少了促炎M1（CD45+/F4-80+/iNOS+）巨噬细胞数量，并增加了抗炎M2（CD45+/F4-80+/CD206+）巨噬细胞数量。
阿利西尤单抗减少ApoE−/−小鼠斑块病变和局部炎症
阿利西尤单抗显著减小了主动脉根部的斑块面积和脂质积累。同时，减少了斑块中CD68+巨噬细胞和CD80+M1巨噬细胞的浸润。斑块中TLR4、NLRP3和caspase-1的含量也因治疗而降低。在降主动脉，阿利西尤单抗处理后，促炎细胞因子（CXCL10、TNF-α、MCP-1）表达下降，而抗炎细胞因子（TGF-β1）和M2巨噬细胞膜标志物（CD163、CD206）表达升高。
PCSK9上调培养的M1巨噬细胞中的炎症因子
在M1巨噬细胞中，重组PCSK9刺激上调了促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、CXCL9、CXCL10）的表达，同时下调了抗炎细胞因子（CCL17、TGM2、IL-10、TGF-β1）。PCSK9在刺激3小时后诱导了NFκB p65亚基向细胞核的转位。NFκB抑制剂parthenolide预处理可减弱PCSK9诱导的IκBα磷酸化和NLRP3表达。NLRP3抑制剂MCC-950预处理可显著减轻PCSK9诱导的NLRP3表达和gasdermin-D切割。因此，PCSK9可通过激活NFκB和NLRP3炎症小体，促进M1巨噬细胞的直接促炎作用。
TLR4是PCSK9在M1巨噬细胞中促炎作用的潜在受体
TLR4拮抗剂TAK-242预处理，可显著减弱PCSK9刺激引起的p65和IκBα磷酸化，以及NLRP3和切割的gasdermin-D的表达。TLR4基因沉默也证实了这些效应。此外，PCSK9能够增加TLR4及其信号适配蛋白MyD88的表达，表明TLR4可能是PCSK9在M1巨噬细胞中产生促炎结果的关键下游介质。
阿利西尤单抗减弱PCSK9诱导的M1巨噬细胞促炎反应
阿利西尤单抗显著降低了PCSK9促成的促炎细胞因子（CXCL9、CXCL10、TNF-α、IL-1β、IL-6）表达，同时增强了抗炎细胞因子（CCL17、IL-10、TGF-β1）的表达。此外，阿利西尤单抗还减轻了PCSK9暴露后的IκBα磷酸化和NLRP3表达，并能降低TLR4转录本。总之，PCSK9可不依赖于LDL-C的降低，通过TLR4、NFκB和NLRP3信号通路诱导M1巨噬细胞的促炎作用。
讨论
本研究提供了进一步证据，表明PCSK9中和抗体阿利西尤单抗可减缓实验性动脉粥样硬化的进展，并调节巨噬细胞的产生和极化。在M1极化巨噬细胞中，PCSK9激活了TLR4-NF-κB轴和NLRP3炎症小体，从而放大了促炎反应。在ApoE−/−小鼠中，阿利西尤单抗引发了全身性抗炎表型，尽管LDL-C水平未改变，但脾脏M1巨噬细胞减少，修复性M2细胞增加，并减少了斑块面积、脂质积累和巨噬细胞（尤其是M1亚型）浸润。从机制上看，PCSK9加剧了M1表型，通过TLR4-NFκB-NLRP3通路增加促炎细胞因子的分泌。TLR4是介导PCSK9信号向NFκB和下游炎症小体激活转导不可或缺的介质。PCSK9介导的TLR4-NFκB-NLRP3-Caspase-1通路刺激可能是促进动脉粥样硬化进展的关键促炎机制。
研究局限性
本研究存在一些局限性。首先，将这些发现转化到人体仍具挑战性，因为阿利西尤单抗主要是一种降脂疗法，其免疫调节作用应被视为附加或补充作用，而非主要作用。其次，虽然数据显示PCSK9刺激后gasdermin-D/Caspase-1增加，但仍需更多研究来阐明细胞焦亡信号的程度和调控。探索代表动脉粥样硬化不同阶段的ApoE−/−小鼠模型，以及测试阿利西尤单抗的不同剂量和时间方案，可能会产生不同的抗炎/抗动脉粥样硬化反应。最后，PCSK9对其他免疫细胞（如中性粒细胞或单核细胞来源的亚型）的作用可能为动脉粥样硬化后的炎症反应增添有趣信息。
结论
在动脉粥样硬化中，PCSK9可不依赖于LDL-C水平，与促炎细胞因子同时分泌。随后，PCSK9可能加剧M1巨噬细胞中的TLR4-NF-κB-NLRP3信号轴，并减少M2表型，从而放大炎症反应，突显了其在动脉粥样硬化中不依赖于脂质的有害作用。值得注意的是，用阿利西尤单抗中和PCSK9可直接抑制这些作用，这表明了一种潜在的补充策略，可用于减轻动脉粥样硬化进展，并可能用于缓解其他炎症驱动的心血管疾病。
