背景
肾结石（Nephrolithiasis）是一项严峻的全球健康与经济挑战，其患病率不断上升且复发率极高。超过15%的男性和5%的女性在70岁前会受其影响，全球平均患病率约为10.85%。在中国大陆，肾结石总体患病率估计为4.0%。更棘手的是，该病复发率高达50%，意味着半数患者会在初次发病后十年内再次经历结石事件。大多数肾结石由草酸钙或磷酸钙晶体构成，其形成和生长的核心机制是尿液中成石盐的过饱和度增加，而天然结石抑制剂（如柠檬酸盐、镁、焦磷酸盐和尿调节蛋白）水平降低会加剧这一过程。肾结石的病因学复杂，是环境、生活方式和遗传因素共同作用的结果。研究表明，约65%的肾结石患者有家族史。双生子研究揭示了显著的遗传成分，估计遗传率超过45%。具有显著尿路结石家族史的个体风险尤其高，父母和兄弟姐妹均患病的个体发病标准化发生率比值超过50%。这些证据均强调了遗传因素在肾结石发病可能性中的巨大影响。
尽管已有六项关于尿路结石的全基因组关联研究发表，并确定了25个相关基因座，但针对中国汉族人群的遗传学研究却显示出较低的重现率。此前的关联研究发现，在其他人群中鉴定的易感位点在中国汉族人群中大多未能复现，这突显了不同族裔间肾结石存在的显著遗传异质性。因此，针对中国汉族人群开展专门的全基因组关联研究，以绘制其独特的遗传图谱，变得尤为迫切。
方法
为深入探究中国汉族人群中与钙性肾结石风险相关的遗传因素，本研究开展了多阶段全基因组关联研究。
研究对象：研究共纳入1451名钙性肾结石病例和2208名健康对照。发现阶段包括1006名病例和1200名对照，均来自复旦大学附属华山医院。所有病例均由临床医生确诊为钙性肾结石，并排除了由尿酸、鸟粪石、胱氨酸、尿酸铵结石或药物、甲状旁腺功能亢进、痛风、泌尿系统畸形引起的继发性肾结石。对照组来自同一机构的常规健康体检队列，均无自我报告的尿路结石史，并经超声检查确认为无结石。所有参与者均签署了知情同意书。
基因分型与质量控制：在发现阶段，使用Illumina Asian Screening Array (ASA) Beadchip对病例样本进行基因分型，对照样本则基于既往研究使用Illumina OmniExpress BeadChip进行分型。经过严格的质量控制（包括剔除基因分型率低于95%、存在重复或亲缘关系、性别模糊的样本，以及剔除检出率低于95%、次要等位基因频率小于0.01、对照组中哈迪-温伯格平衡检验p值小于1×10-3的单核苷酸多态性），最终有1,837,032个SNPs进入后续分析。使用IMPUTE软件和千人基因组计划中的北京汉族人群数据进行了基因型填补。
SNP选择与验证：在发现阶段，选取与钙性肾结石风险独立相关的SNP进行验证。选择标准为：每个位点有一个SNP达到p < 5 × 10-8，或每个位点至少有五个SNP达到p < 1.0 × 10-6，且标记间的连锁不平衡r2< 0.2。在验证阶段，纳入了445名独立病例和1008名对照（均为男性）。为校正性别不平衡，在逻辑回归模型中纳入了性别作为协变量。
数量性状位点分析：针对在全基因组水平显著的SNPs，分析了其与三类22个定量性状的关联，包括代谢性状（BMI、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、白蛋白、血糖）、肾脏相关性状（血清尿素、尿酸、估算肾小球滤过率、尿液pH）和电解质性状（血清钠、钾、氯、CO2、钙、镁、磷、碱性磷酸酶、甲状旁腺激素、骨化二醇）。
统计分析：使用逻辑回归模型评估SNPs与钙性肾结石风险的关系，校正年龄、性别和前两个主成分。通过荟萃分析整合发现和验证阶段结果。采用Cochran’s Q统计量和I2统计量评估异质性。全基因组显著性阈值设为p < 5.0 × 10-8，验证阶段显著性经Bonferroni校正后设为p < 3.33 × 10-3。
结果
发现阶段：在发现阶段，对1006名病例和1200名对照的分析中，有241个SNPs达到了全基因组显著性水平（p < 5.0 × 10-8），827个SNPs达到了提示性关联水平（p < 1.0 × 10-6）。主成分分析未显示显著的人群分层，Q-Q图分析显示基因组膨胀因子λ值为1.6006，连锁不平衡评分回归分析截距为1.07，表明观察到的膨胀主要归因于多基因结构而非混杂偏倚。
验证阶段：在验证阶段，对15个基因组区域的15个SNPs进行分析，其中5个位点成功复现：4q35.1的rs3736194、5q31.2的rs356450、10p13的rs17155703、14q22.1的rs10151594和18q21.2的rs55826947。荟萃分析整合了发现和验证阶段的数据。
合并分析：通过荟萃分析，三个新的SNPs在全基因组水平上达到显著关联：位于4q35.1的rs3736194（优势比OR = 0.6279, pmeta= 2.84 × 10-13）、位于5q31.2的rs356450（OR = 2.0312, pmeta= 6.09 × 10-16）和位于18q21.2的rs55826947（OR = 0.6017, pmeta= 6.29 × 10-10）。然而，位于10p13的FAM107B基因内的rs17155703和位于14q22.1的FRMD6基因上游的rs10151594未能达到全基因组显著性水平。在rs3736194和rs55826947两个位点上，两阶段研究间未发现异质性证据。
数量性状位点分析：研究发现，rs3736194的G等位基因与较高的血清二氧化碳水平显著相关（p = 0.04666）。rs356450的G等位基因与较低的血清氯离子水平相关（p = 0.02992）。rs55826947的T等位基因与较高的身体质量指数相关（p = 0.03174），并与较低的血清碱性磷酸酶水平存在提示性关联（p = 0.05634）。rs17155703的C等位基因与较低的血清白蛋白水平相关（p = 0.04223），而rs10151594的A等位基因与较高的血清白蛋白水平存在提示性关联（p = 0.05809）。
讨论
本研究首次在中国汉族人群中，通过针对钙性肾结石的两阶段全基因组关联研究，鉴定出三个与疾病风险相关的新基因座：4q35.1、5q31.2和18q21.2。
4q35.1 (SORBS2)：rs3736194是SORBS2基因（编码Sorbin和SH3结构域包含蛋白2）的一个内含子变异。SORBS2是肾小球应激纤维形成的关键成员，与糖尿病肾病的发生有关。在动脉粥样硬化中，SORBS2被证实可调节脂质诱导的炎症和泡沫细胞形成。由于肾髓质巨噬细胞负责监测和清除肾小管液及间质中的晶体颗粒，对防止结石滞留至关重要，因此推测SORBS2变异可能通过影响这些肾脏巨噬细胞的炎症表型或吞噬能力，从而改变晶体清除效率，促进肾结石形成。本研究中，rs3736194的风险等位基因与较高的血清CO2水平相关，而高血清CO2水平已知会增加磷酸钙结石的风险。这表明SORBS2的变异可能通过影响异常的血清CO2代谢来增加钙性肾结石风险。
5q31.2 (CXXC5)：rs356450是位于CXXC5基因（编码视黄酸诱导核因子）的一个内含子变异。CXXC5在2型糖尿病肥胖患者的脂肪组织中高表达，其表达变化与抵抗肥胖相关代谢疾病有关。尤为重要的是，CXXC5已被鉴定为维生素D受体（VDR）的相互作用蛋白，是VDR/维生素D反应元件介导的转录的有效且剂量依赖性的激活剂。VDR是钙稳态的主要调节因子，直接控制肠道钙吸收和肾脏钙转运相关基因的表达。VDR本身的多态性一直与钙性肾结石和骨密度疾病相关。CXXC5基因敲除小鼠表现出高骨量表型。因此，推测CXXC5与肾结石的关联是通过其对VDR信号通路的调节作用介导的，从而导致钙稳态改变和结石风险增加。
18q21.2 (MBD2)：rs55826947是MBD2基因（编码甲基化CpG结合域蛋白2）上游的一个转录本变异。MBD2是甲基化的阅读蛋白。近期研究表明，抑制MBD2可有效缓解单侧输尿管梗阻和缺血/再灌注诱导的肾纤维化进展。此外，MBD2基因被认为与肥胖和胰岛素抵抗有关。胰岛素抵抗是肥胖的核心特征，会导致肾脏氨生成受损和尿液pH值降低，从而促进草酸钙和尿酸结晶。在本研究中，MBD2的变异与较高的身体质量指数相关。流行病学研究表明，结石风险发病率随身体质量指数增加而增加。因此，推测MBD2的变异可能通过增加体重来增加钙性肾结石的风险。
其他位点：研究还观察到10p13的rs17155703和14q22.1的rs10151594与钙性肾结石存在提示性关联。rs17155703位于FAM107B基因内，其编码蛋白的功能尚不明确，该基因在肾结石发病机制中的作用有待进一步研究。rs10151594位于FRMD6基因上游，该基因编码的蛋白是Hippo激酶通路的关键激活因子，在调节细胞增殖和凋亡中起关键作用，并可能通过影响VDR与其反应元件的结合特性，调节对1,25-二羟基维生素D3的转录反应。
研究局限性：本研究存在一些局限性。首先，初始全基因组关联研究发现阶段的样本量不足以识别所有与钙性肾结石相关的潜在遗传易感位点。其次，验证阶段的对照样本使用了不同的基因分型平台，这种跨平台设计可能引入了技术变异性，影响了复制信号的一致性。最后，对所识别基因座的生物学解释在很大程度上仍是推测性的，基于间接证据。需要进一步的实验研究（包括功能分析和动物模型）来阐明这些基因参与钙性肾结石发病机制的确切机理。
结论
总之，本研究首次在中国汉族人群中进行了钙性肾结石的全基因组关联研究，鉴定出三个位于4q35.1、5q31.2和18q21.2的新易感位点。虽然需要进一步研究来阐明这些变异如何增加肾结石风险的具体分子机制，但这些发现表明，钙稳态、肾功能和代谢等因素可能在钙性肾结石的发生发展中起着重要作用。
