摘要
本研究旨在探讨“高海拔生活-低强度训练”（LHTL）模式的影响。在该模式下，小鼠被置于低氧环境中，但在常氧条件下进行训练以保持训练质量。我们分析了参与细胞代谢和氧化应激的关键蛋白质，包括缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）和抗氧化蛋白1（OXR1）。40只雄性同基因C57BL/6J小鼠被分为未训练组（N）和训练组（T），分别生活在常氧（NOR）或低氧（HYP）环境中。HYP组小鼠每天18小时被置于一个提供缺氧空气（FiO2 = 14.5%）的常压帐篷中，持续8周。包括训练在内的所有动物操作均在常氧条件下进行（FiO2 = 19.5%）。训练每周进行5次，每次40分钟，强度约为个体临界速度的80%。所有小鼠都被安乐死，以提取比目鱼肌、腓肠肌和下丘脑组织进行蛋白质分析。与单独训练相比，LHTL并未导致HIF-1α、PGC-1α或OXR1在组织中的表达显著增加；然而，观察到的行为变化——如自发体力活动减少和完成训练的能力下降——可能表明LHTL模式的要求并不简单。
1 引言
几十年来，人们一直在使用低氧环境（无论是自然高海拔还是人工环境如实验室或帐篷）来刺激适应性变化，以提高运动表现（Beidleman等人，2006；Bonne等人，2015；Bor-Kucukatay等人，2014；Chapman等人，2014；Joanny等人，2001）。尽管尚未确定最佳模型，但证据表明，从实际角度来看，“高海拔生活-低强度训练”（LHTL）模式特别有吸引力，因为训练在常氧条件下进行，而低氧暴露则发生在训练之外，通常每天至少12小时（Brugniaux等人，2006；Girard等人，2020；Levine & Stray-Gundersen，1997；Walsh & Whitham，2006）。尽管不同低氧模型在后勤和实际操作上存在差异，但一个关键问题仍然是这些方法是否真的能转化为表现的提升。要回答这个问题，可能需要超越单纯的表现结果，结合生物分子分析，因为分子适应性最终会影响到功能变化。研究生物分子反应有助于阐明细胞信号通路如何受到外部刺激的调节。这些刺激可以同时应用，如在高海拔生活并训练时，或者分别应用，如LHTL模式中。尽管在时间上分开，但LHTL刺激带来了累积的双重生理挑战，这构成了结合这些策略时的核心复杂性。这引发了一个关键问题：当目标是提高有氧健康状况时，低氧和运动训练在体内是如何相互作用的（协同还是拮抗？一种可能的观点是，低氧和运动训练是协同的，因为每种刺激都针对有氧表现的互补决定因素，如氧气输送和利用（Li等人，2020）。这一观点主要基于来自孤立途径的证据，其中低氧诱导的氧气输送改善（例如血管生成和红细胞生成）与HIF-1α信号通路相关（Dewi & Fatchiyah，2013；Hickey & Simon，2006；Maxwell & Salnikow，2004；Pugh & Ratcliffe，2003；Seagroves等人，2001；Semenza，2000，2011），而有氧训练诱导的氧气利用改善与由PGC-1α调节的线粒体通路相关（Knutti & Kralli，2001；Lin等人，2002；Sandri等人，2006；Wang等人，2017；Wu等人，1999）。虽然这在概念上是一致的，但至少有三种生化机制指向另一种观点，即当主要关注有氧代谢适应时，低氧和有氧训练可能是拮抗的（Mason等人，2007）。首先，HIF-1α和PGC-1α的激活可能会产生竞争性的细胞优先级，低氧倾向于促进糖酵解表型，而有氧训练则促进氧化表型（Horscroft & Murray，2014；Taylor & Scholz，2022；Weidemann & Johnson，2008）。因此，这些通路的同时激活可能会稀释或重新定向适应性信号，而不是加强它们。其次，低氧诱导的HIF-1α稳定可能会抑制线粒体有氧代谢，可能是通过涉及PDK1介导的丙酮酸脱氢酶（PDH）抑制的机制，这限制了底物进入三羧酸循环（De Palma等人，2007；Kim等人，2006；Kirito等人，2009；Lindholm & Rundqvist，2016；Papandreou等人，2006；Shohet & Garcia，2007；Slot等人，2014；Solaini等人，2010）。第三，氧化还原调节代表了另一个潜在的冲突层面。低氧暴露与活性氧（ROS）产生增加有关（Chen等人，2012；Clanton，2007；Dosek等人，2007；Joanny等人，2001；Magalhaes等人，2004；Maiti等人，2006；Mazure等人，2011；Park & Kehrer，1991；Radák等人，1994；Ribon等人，2016），这可能会进一步稳定HIF-1α（Bell等人，2007；Hamanaka & Chandel，2009；Poyton等人，2009；Sullivan等人，2016；Verschoor等人，2010）。尽管存在抗氧化防御机制来缓冲低氧诱导的ROS，但同时暴露于有氧训练和低氧可能会导致ROS产生的放大，从而可能建立氧化应激状态。这种情况可能会损害肌肉收缩功能和恢复能力，从而减弱有氧健康状况的改善。综合这些机制，表明低氧和有氧训练之间的相互作用比通常假设的更为复杂，而且由于缺乏在同一干预框架内结合这两种刺激的体内证据，许多提出的协同或拮抗作用仍然只是推测。鉴于使用LHTL模型的动物研究很少，关注关键和经典的调节蛋白质是合理且有意义的。虽然HIF-1α和PGC-1α是已知的代谢调节因子，但OXR1尽管有证据表明其与细胞抗氧化防御和DNA保护有关（Durand等人，2007；Jaramillo-Gutierrez等人，2010；Matsui等人，2020；Wang等人，2019；Zhang等人，2018），但仍相对较少被研究。因此，本研究的主要目的是探讨8周有氧训练对生活在常氧或低氧环境中的小鼠的HIF-1α、PGC-1α和OXR1蛋白质表达的影响。我们研究了具有不同代谢特征的小鼠骨骼肌：腓肠肌，其IIb型纤维比例较高，氧化作用较弱；以及比目鱼肌，主要含有I型和IIa型纤维（Augusto等人，2004；Hämäläinen & Pette，1993；Vechetti Jr.等人，2019）。考虑到某些组织对氧气可用性的减少更敏感（因此更容易受到低氧的影响），我们还在下丘脑中研究了相同的蛋白质，下丘脑是一个高度依赖有氧代谢并参与能量稳态的区域（Bergersen，2007；Blouet & Schwartz，2010；Elizondo-Vega等人，2015；Hillebrand等人，2002；Koob & Annau，1973；Scariot等人，2022；Todd，2014）。鉴于低氧和有氧训练结合所产生的生理需求远非简单，可能会带来能量和肌肉上的挑战，第二个目标是评估诱导的行为变化。具体来说，我们评估了动物在常氧条件下完成训练的能力。此外，我们还记录了整个干预期间的自发体力活动（SPA），因为有证据表明，在低氧生活条件下，训练引起的SPA减少可能会加剧（Orsi等人，2025）。最后，作为第三部分分析，我们研究了LHTL模式是否可以改变特定白细胞亚群的浓度，因为氧化还原失衡也可能作为触发炎症反应的信号（Bakonyi & Radak，2004；Dosek等人，2007；Eltzschig & Carmeliet，2011；Niess等人，1999；Pham等人，2021；Ranneh等人，2017）。
2 材料与方法
2.1 动物护理
使用了40只成年雄性小鼠（C57BL/6J）。在实验期间，小鼠被安置在一个环境可控的房间内，包括温度（23±1°C）、相对湿度（45%-55%）、噪音（<80分贝）和12小时的光照/黑暗周期（从6:00到17:59）。小鼠被关在商业聚乙烯笼子中（长度：40厘米，宽度：33厘米，高度：16厘米；底面积1320平方厘米），并可自由获取商业标准饲料（Nuvilab® CR-1；Nuvital，BR）。断奶小鼠来自坎皮纳斯大学的动物设施，该设施位于多学科生物研究实验室动物中心（CEMIB）。动物在标准条件下由当地动物护理设施饲养，直到成年。考虑到长期社会隔离会改变啮齿动物的代谢和行为参数（Benfato等人，2022；Goldsmith等人，1978；Moore，1968；Parker & Morinan，1986；Schipper等人，2020；Sharp等人，2002；Sun等人，2014；Weiss等人，2004），小鼠被集体饲养（每笼10只）。所有程序都得到了伦理审查委员会的批准（Comissão de Ética no Uso de Animais-CEUA-UNICAMP，协议编号5509–1/2020）。所有实验均按照相关指南和法规进行，如《欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约》（Guideline，2006）和《国家研究委员会关于实验室动物护理和使用的指南》（Guideline，2011）。
2.2 研究设计和低氧条件
啮齿动物被随机分配到两种环境条件：常氧（NOR）和低氧（HYP）。每种条件进一步分为未训练组（N）和训练组（T），共四个实验组（N-NOR，T-NOR，N-HYP，T-HYP），每组包含十只啮齿动物。动物操作在常氧条件下进行（FiO2 = 19.5%，从6:00到12:00），使用便携式分析仪（Senko SP2nd O2）监测氧气水平。HYP组每天18小时被置于常压低氧帐篷中（Colorado Altitude Training，美国），持续8周。HYP组吸入的氧气分数[FiO2]为14.5%，以模拟3000米的高度（Parati等人，2018）。8周后（干预结束时），所有小鼠都被安乐死（颈椎脱位），随后收集其组织，具体步骤在后面的“生物材料收集”部分详细描述。低氧剂量计算为暴露时间（小时）和高度（公里）的乘积（Garvican-Lewis等人，2016）。整个8周实验的总低氧剂量为3264公里·小时，如图1所示。图1描述了考虑暴露时间（小时）和高度（公里）来测量低氧剂量的方法（Garvican-Lewis等人，2016）。小鼠暴露在FiO2 = 14.5%的条件下，模拟大约3000米的高度，每天暴露18小时，因此每日低氧剂量为54公里·小时，如图1(a)所示。在每周没有训练的2天里，小鼠每天暴露在低氧环境中23小时。在这些非训练日（周末），只有在清洁笼子或称重时，小鼠才会处于常氧条件下（1小时）。每周的低氧剂量达到408公里·小时，8周实验期间，累积的低氧剂量总计为3264公里·小时。图1(b)显示低氧暴露组被置于常压帐篷中，从中午12点到早上6点。图1(c)展示了常氧（NOR）和低氧（HYP）笼子的位置，HYP笼子放在帐篷内（Colorado Altitude Training®，路易斯维尔，科罗拉多州），NOR笼子放在外面。最后，图1(d)表明低氧是通过低氧气体发生器诱导的。
2.3 临界速度（CV）的确定
小鼠接受了测试以确定它们的个体CV。在测试之前，小鼠按照先前的协议（Scariot等人，2021）进行了三天的跑步机适应期。动物在不同天进行了四次跑步测试，每次都以恒定速度跑步直到耗尽体力。根据先前的建议（Manchado-Gobatto等人，2010；Scariot等人，2019），选择不同的强度以确保耗尽时间在1到15分钟之间。耗尽时间定义为小鼠不再能够在跑步机上协调跑步的点，即使研究人员给予轻微鼓励也是如此。没有使用电刺激；相反，通过轻拍刷子来提供动力。对于每次恒定速度的测试，记录了总距离和相应的耗尽时间。然后将这些数据点绘制在距离-时间图上，并应用线性回归分析。CV被确定为斜率（即角度系数），代表动物理论上能够持续的最高恒定速度（Gaesser & Poole，1996；Hill等人，2011；Jones等人，2010）。也有人提出，CV定义了重度强度训练领域的下限，略高于无氧阈值（Gaesser & Poole，1996）。所有测试都在常氧条件下进行。
2.4 有氧训练
训练每次持续40分钟，每周安排五次，与之前的研究（Scariot等人，2019）相同。关于训练强度，小鼠以CV的80%速度跑步，这属于高强度领域（Gaesser & Poole，1996）。训练在常氧条件下进行。每次训练期间，小鼠都进行了热身和冷却活动。未训练组被适应跑步任务，以最小化训练的混淆效应。每次训练期间监测训练量（以秒计），以评估训练动物是否在完成计划训练协议方面表现出任何障碍。例如，如果每天的训练时间持续2400秒（即40分钟），那么每只动物在五次训练中预计会累积12,000秒的训练量。在6周的时间里（不包括用于评估临界速度的那些周），预计的累积训练总量将达到72,000秒。
2.5 自发体力活动（SPA）的测量
SPA是通过使用负荷传感器基于重力原理来测量的，方法如前所述（Beck等人，2016年；Biesiadecki等人，1999年；Scariot等人，2019年，2021年）。SPA包括一系列非计划性运动。对于实验室中的啮齿动物来说，SPA代表了它们在笼子环境中全天自然进行的所有行为，可能包括行走、梳理毛发、烦躁不安、站立、嗅探、挖掘、筑巢、攀爬、一般探索、寻找食物的行为以及社交互动，这些都被认为是低强度的活动。我们是在不将动物从它们的 home cage 中移出的情况下，按每个笼子来测量 SPA 的，捕捉到了所有主要和敏感的动作，如行走、梳理毛发、站立和烦躁不安（Garland Jr.等人，2011年）。SPA 是使用 Matlab® 软件根据之前描述的数学公式计算得出的（Scariot等人，2019年）。在整个研究期间（8周内），SPA 的记录频率为每秒200次，每天连续记录18小时。活动水平分别报告了光照期（从12:00到17:59）和黑暗期（从18:00到5:59）的数据。
2.6 生物样本的收集
在禁食过夜后，最后一次运动暴露48小时后，对小鼠进行了安乐死处理。选择颈椎脱位作为主要的安乐死方法，随后立即进行斩首以确保大脑活动完全停止。根据当前的推荐，颈椎脱位被认为是适用于像C57BL/6小鼠这样的小型啮齿动物的可接受物理方法（Guideline，2011年；Shomer等人，2020年）。这项技术由经验丰富的研究人员执行，以确保快速和准确的操作，从而防止颈椎脱位不完全，并最小化啮齿动物不必要的痛苦。此外，使用颈椎脱位方法消除了对麻醉剂的需求，因为麻醉剂可能会改变代谢变量（Chen等人，2020年；Giroux等人，2016年；Overmyer等人，2015年）。因此，采用非药物安乐死方法可以确保实验结果真实反映动物的生理状态，而不会引入混淆性的解释。组织（比目鱼肌、腓肠肌白色部分和下丘脑）被采集并冷冻在液氮中，储存在-80°C。
2.7 白细胞计数分析
血液在斩首后收集到含有EDTA的肝素化塑料管中。血液被轻轻混合均匀。分析由生物医学专业人士进行，样本在Sysmex XS-800i血液分析仪（Sysmex Europe GmbH，德国）中处理。测定了以下类型的白细胞浓度：淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
2.8 西部印迹（Western blot）分析
样本在冰上使用研钵与由Tris HCl、NaCl、EDTA、IGEPAL、脱氧胆酸盐、SDS组成的缓冲液以及浓度为1%的蛋白酶抑制剂（Protease Inhibitor Cocktail，产品编号P8340，Sigma-Aldrich®）和浓度为1%的磷酸酶抑制剂（Phosphatase Inhibitor Cocktail Set II，产品编号US1524625-1SET，Calbiochem®）混合均匀。样本还经过超声处理以确保细胞裂解（Q55超声仪，Qsonica®，美国）。蛋白质浓度根据制造商的说明使用Bradford试剂盒进行测量（Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate，产品编号5000006，Bio-Rad Laboratories）。样本与LDS样品缓冲液（含有1%的巯基乙醇）混合，在94°C下加热10分钟，然后加载到10%的SDS-PAGE凝胶中（Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Gel，产品编号4561036，Bio-Rad Laboratories）。电泳在Tris-甘氨酸缓冲液中进行，电压保持恒定（130伏特）持续1小时。电泳后，凝胶在Towbin缓冲液中短暂清洗5分钟。Towbin缓冲液由25 mM的Tris、192 mM的甘氨酸和20%的甲醇组成。蛋白质使用iBlot™ 2凝胶转移装置（20伏特，7分钟，产品编号IB21001）转移到PVDF膜上（Invitrogen™，iBlot™ 2 Transfer Stacks，产品编号IB24002）。这种干转移系统提供了快速且高效的蛋白质转移，有助于保持凝胶分辨率的一致性，并最小化了技术变异性。膜用总蛋白染色剂（REVERT™ Total Protein Stain，产品编号926–11,010，LI-COR）染色，并使用Odyssey Fc System的700纳米通道进行扫描（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，美国）。之后，膜在室温下用1%的牛奶-PBS（Nonfat dry milk，产品编号9999，Cell Signaling Technology®）封闭1小时。关于一级抗体，膜在室温下用5%的牛奶-PBS-Tween封闭1小时（OXR1，产品编号13514-1-AP，Proteintech）或在4°C下封闭过夜（HIF-1α alpha抗体，产品编号NB100-479，Novus Biologicals和PGC-1α alpha抗体，产品编号NBP1-04676，Novus Biologicals）。抗体结合使用预先吸附了Goat anti-Rabbit IgG H&L（IRDye 800CW，产品编号ab216773）以1:20,000的稀释度在室温下孵育1小时。荧光在800纳米处使用Odyssey Fc System检测（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，美国）。目标蛋白和总蛋白都使用Odyssey Fc LI-COR系统进行近红外荧光检测。除了避免可见光谱的干扰外，该系统还提供了宽广的线性动态范围（LDR；跨越六个数量级），使得低丰度和高丰度蛋白的定量更加准确和可靠。仅这些技术优势就足以提供比传统的化学发光方法更准确的信号检测；然而，我们进一步通过使用总蛋白染色剂对蛋白质表达进行了标准化。总蛋白染色剂不仅用于凝胶加载的视觉评估，还定量地纳入分析中，以计算每个样本的精确的泳道标准化因子。这种策略相比基于内源性管家蛋白（如GAPDH、β-actin、tubulin）的标准化方法具有显著优势（Bettencourt等人，2020年；Kirshner & Gibbs，2018年；Maloy等人，2022年）。此外，总蛋白标准化允许整合来自不同膜的数据，从而增强统计稳健性并确保更大的科学严谨性。
2.9 统计分析
数据的统计处理使用了STATISTICA软件（版本10，StatSoft, Inc.（Tulsa，美国）进行，图表的生成使用了GraphPad Prism软件（版本8.2.1）。正态性和同质性的假设分别通过Shapiro–Wilk检验和Levene检验进行测试。生物变量使用双向ANOVA进行分析，以比较训练（未训练 vs. 训练过）和环境（Normoxia vs. Hypoxia）的影响。还进行了另一个双向ANOVA，以验证训练组在几周内（1、2、3、5、6和7）完成的训练量是否发生变化。无论是否存在显著的主效应或交互效应，都使用了Fisher LSD事后检验。在所有情况下，显著性水平设定为p < 0.05。
3 结果
图2显示了在正常氧（Normoxia）和缺氧（Hypoxia）条件下维持的组别完成的训练量。ANOVA显示“周”因素有显著影响（F = 3.2，p = 0.009），表明在实验的最后几周训练量逐渐减少。这种减少主要是由处于缺氧状态的动物引起的，这一点通过显著的交互效应得到了证实。这一发现与事后比较结果一致（图2），后者显示T-HYP组在第6周和第7周的训练量显著下降。关于临界速度，事后比较结果展示在图2的D面板中。主要发现是，经过3周的训练后，无论生活在何种环境中，小鼠的有氧能力都有所提高。然而，暴露于“高负荷-低训练”模式（T-HYP组）的组别未能保持其临界速度。
图2展示了在正常氧（NOR）和缺氧（HYP）条件下维持的组别完成的训练量（以秒为单位）的热图（A面板），显示了每日值。B面板展示了每周累积的训练量（以秒为单位）。C面板显示了完成的计划训练量的百分比，绿色代表NOR组，蓝色代表HYP组。除了展示实验过程中有氧能力的进展外，D面板显示的临界速度也提供了训练强度的指示。考虑到训练强度设定为临界速度的80%，前3周的平均训练强度对于两组来说大约为14米/分钟。在第4周重新评估后，训练强度增加以符合超负荷原则，两组都达到了接近22米/分钟的值。数据以平均值和标准差的形式展示。统计分析：A和C面板显示与同一周内的N-NOR、N-HYP组相比有显著差异（p < 0.05）。#和&显示与基线和同一组内的第4周相比有显著差异（p < 0.05）。如图3所示，在整个8周期间，HYP组在黑暗时期的SPA高于NOR组（F = 12.9，p < 0.001）。根据ANOVA，与未训练组相比，训练组在黑暗时期的SPA较低（F = 110.9，p < 0.001）。在缺氧状态下保持的小鼠中，训练对减少黑暗时期SPA的影响更为明显，这通过训练和环境之间的显著交互效应得到证实（F = 22.62，p < 0.001）。关于事后比较，N-NOR组在黑暗时期的SPA显著高于T-NOR（p < 0.001）和T-HYP（p < 0.001）组。HYP组在黑暗时期的SPA显著高于N-NOR（p < 0.001）、T-NOR（p < 0.001）和T-HYP（p < 0.001）组。关于光照时期的SPA，训练（F = 0.6，p = 0.418）、环境（F = 0.0，p = 0.878）或它们的交互作用（F = 1.5，p = 0.220）均无显著效应。事后分析未检测到光照时期SPA的差异。
图3展示了在整个8周研究期间，在正常氧（NOR）和缺氧（HYP）条件下保持的未训练（N）和训练（T）组的每日SPA记录。这项分析涵盖了整个8周期间收集的所有数据，共计52个实验日。条形图以平均值和标准差的形式展示。图4展示了下丘脑（A面板）、比目鱼肌（B面板）和腓肠肌白色部分（C面板）中HIF-1α的西部印迹结果。训练（F = 0.7；p = 0.384）或环境（F = 0.93；p = 0.343）对下丘脑中的HIF-1α没有显著影响。关于比目鱼肌，根据ANOVA，HYP组的HIF-1α水平倾向于高于NOR组（F = 3.0；p = 0.095）。训练对比目鱼肌中的HIF-1α没有显著影响（F = 0.0；p = 0.943）。训练（F = 0.3；p = 0.551）或环境（F = 0.0；p = 0.773）对腓肠肌白色部分中的HIF-1α没有显著影响。我们没有发现下丘脑（F = 0.1；p = 0.671）、比目鱼肌（F = 0.1；p = 0.73）或腓肠肌白色部分（F = 0.8；p = 0.372）中HIF-1α的显著交互作用。
图4展示了在研究结束时，在正常氧（NOR）和缺氧（HYP）条件下保持的未训练（N）和训练（T）组的下丘脑（A面板）、比目鱼肌（B面板）和腓肠肌白色部分（C面板）中HIF-1α的蛋白质含量。D面板展示了一张代表性图像，确认了使用近红外荧光检测在800纳米处检测到的目标蛋白条带。相同的膜也进行了总蛋白染色，并在700纳米处扫描以标准化不同泳道间的蛋白质加载差异。总蛋白染色中的虚线表示检测到目标蛋白条带的分子量范围。条形图以平均值和标准差的形式展示（n = 7每组）。图5展示了下丘脑（A面板）、比目鱼肌（B面板）和腓肠肌白色部分（C面板）中PGC-1α的西部印迹结果。训练（F = 0.1；p = 0.714）或环境（F = 1.8；p = 0.185）对下丘脑中的PGC-1α没有显著影响。此外，训练（F = 0.1；p = 0.674）或环境（F = 0.0；p = 0.861）对腓肠肌中的PGC-1α没有显著影响。我们没有发现下丘脑（F = 1.9；p = 0.178）或腓肠肌白色部分（F = 1.0；p = 0.324）中PGC-1α的显著交互作用。
图5展示了在研究结束时，在正常氧（NOR）和缺氧（HYP）条件下保持的未训练（N）和训练（T）组的下丘脑（A面板）、比目鱼肌（B面板）和腓肠肌白色部分（C面板）中PGC-1α的蛋白质含量。图d展示了一张代表性图像，证实了使用近红外荧光检测在800纳米波长下扫描到的目标蛋白条带的检测结果。相同的膜也经过总蛋白染色，并在700纳米波长下进行扫描，以消除不同泳道间蛋白质加载量的差异。总蛋白染色中的虚线表示目标蛋白条带被检测到的分子量范围。条形图以M和SEM表示（每组n=7）。图6展示了下丘脑（图A）、比目鱼肌（图B）和白色腓肠肌（图C）中OXR1的Western blot结果。事后分析未发现组间存在显著差异；然而，根据ANOVA结果（F=4.0；p=0.055），训练组的比目鱼肌中OXR1水平倾向于高于未训练组。训练对白色腓肠肌（F=0.0；p=0.825）和下丘脑（F=0.9；p=0.337）中的OXR1没有显著影响。我们也没有发现环境对比目鱼肌（F=0.5；p=0.476）、白色腓肠肌（F=0.7；p=0.399）或下丘脑（F=0.4；p=0.498）中的OXR1有显著影响。我们也没有发现环境与比目鱼肌（F=0.3；p=0.544）、白色腓肠肌（F=2.4；p=0.129）或下丘脑（F=0.5；p=0.463）中的OXR1之间存在显著交互作用。图6在图查看器中打开。
图6显示了在研究结束时，未训练（N）和训练（T）组在下丘脑（图a）、比目鱼肌（图b）和白色腓肠肌（图c）中OXR1的蛋白质含量，这些组分别处于常氧（NOR）和缺氧（HYP）条件下。图d展示了一张代表性图像，证实了使用近红外荧光检测在800纳米波长下扫描到的目标蛋白条带的检测结果。相同的膜也经过总蛋白染色，并在700纳米波长下进行扫描，以消除不同泳道间蛋白质加载量的差异。总蛋白染色中的虚线表示目标蛋白条带被检测到的分子量范围。条形图以M和SEM表示（每组n=7）。白细胞谱型的结果显示在表1中。ANOVA表明，与训练组相比，未训练组的白细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的数量显著较低（所有单位均为mm³）。有趣的是，显著的交互作用显示，训练引起的白细胞和淋巴细胞数量减少仅发生在处于常氧条件下的小鼠中，而在缺氧条件下的小鼠中则没有观察到这种减少。相反，ANOVA检测到的显著交互作用表明，训练引起的嗜酸性粒细胞数量减少仅发生在处于缺氧条件下的小鼠中，在常氧条件下没有观察到显著效应。事后分析显示，N-HYP组的嗜酸性粒细胞数量最高。环境对比目鱼肌（F=0.5；p=0.476）、白色腓肠肌（F=0.7；p=0.399）或下丘脑（F=0.4；p=0.498）中的OXR1没有显著影响。我们也没有发现环境与比目鱼肌（F=0.3；p=0.544）、白色腓肠肌（F=2.4；p=0.129）或下丘脑（F=0.5；p=0.463）中的OXR1之间存在显著交互作用。
表1显示了在研究结束时，未训练（N）和训练（T）组在下丘脑（图a）、比目鱼肌（图b）和白色腓肠肌（图c）中OXR1的蛋白质含量，这些组分别处于常氧（NOR）和缺氧（HYP）条件下。ANOVA表明，与训练组相比，未训练组的白细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的数量显著较低（所有单位均为mm³）。有趣的是，显著的交互作用显示，训练引起的白细胞和淋巴细胞数量减少仅发生在处于常氧条件下的小鼠中，而在缺氧条件下的小鼠中则没有观察到这种减少。相反，ANOVA检测到的显著交互作用显示，训练引起的嗜酸性粒细胞数量减少仅发生在处于缺氧条件下的小鼠中，在常氧条件下没有观察到显著效应。事后分析显示，N-HYP组的嗜酸性粒细胞数量最高。环境暴露导致淋巴细胞比例增加，而单核细胞数量减少，与常氧组相比。表1提供了双向ANOVA的详细结果。
讨论：
我们的研究有助于理解高强度生活与低强度训练如何影响关键代谢元素，如HIF-1α和PGC-1α。与完全处于常氧条件下的训练小鼠相比，暴露于低强度生活与高强度训练的小鼠的SPA（自发体力活动）和训练量显著减少，这表明它们经历了更大的生理挑战。这些诱导的行为变化可能作为一种适应性反应，有助于减轻生理压力，并在抗氧化途径（如OXR1）激活之前支持肌肉恢复。我们开发了一个总结（图7），突出了本研究中检查的主要变量之间的联系，特别是与缺氧和有氧训练相关的联系。
图7展示了本研究中讨论的有氧训练和缺氧之间潜在的生理相互作用示意图。尽管在分析时没有观察到，但在缺氧暴露期间HIF-1α的稳定可能是发生的。抑制脯氨酰羟化酶（PHD）活性可以增强无氧糖酵解通量并下调氧化代谢。这种代谢转变可能是一种减少活性氧生成的策略。低强度生活与高强度训练模型可能使骨骼肌承受更大的压力，因为暴露于这种条件的小鼠表现出明显的自发体力活动减少和完成规定训练课程的能力下降。虽然从统计学角度来看这似乎是因果关系，但不应忽视可能存在一种调节机制，即向肌肉发送信号以减少其活动以防止损伤，即使在没有通常与氧化应激缓解相关的分子标志物（如PGC-1α和OXR1）可观察到的变化的情况下也是如此。在讨论这一点时，考虑HIF-1α是合适的，不仅因为它在缺氧中的重要性不可否认，而且因为某些误解已经固化成了一种普遍的看法。一个常见的例子是假设任何涉及缺氧的研究都应该发现HIF-1α蛋白的增加。然而，这种观点可能是误导性的，因为HIF-1α的检测和水平取决于多种因素，这些因素远远超出了单纯的缺氧暴露。因此，将特定实验条件下获得的HIF-1α发现普遍化可能导致概念上的错误和过于简化的解释。缺氧暴露的持续时间是一个调节HIF-1α动态的关键因素，因此在考虑这一时间维度时需要谨慎。人们经常假设在急性缺氧期间观察到的HIF-1α反应会在持续缺氧期间持续存在。然而，不应做出这样的推断，因为实验证据并不支持这一点，实验证据表明HIF-1α蛋白的急性增加本质上是短暂的，并不会持续很长时间。例如，Le Moine等人（2011）显示，暴露于低气压缺氧1周的小鼠的HIF-1α和PDK1蛋白表达明显低于仅暴露24小时的小鼠。这种减少非常显著，以至于1周后，HIF-1α和PDK1的水平几乎与常氧组无法区分。Chávez等人（2000）在大鼠中也描述了类似的时间轮廓，显示HIF-1α在缺氧初期急剧上升，但随后在第21天下降，尽管动脉氧张力持续较低。与这些体内观察结果一致，培养细胞的研究表明HIF-1α蛋白水平在持续缺氧培养1周后下降（Bartoszewska等人，2015；Ginouvès等人，2008；Ravenna等人，2014；Stiehl等人，2006）。因此，我们研究中HIF-1α的缺乏不应被解释为整个实验期间缺氧信号缺失的证据。因为HIF-1α在缺氧中的不可否认的重要性，以及某些误解已经固化成了一种普遍的看法，所以在这里讨论HIF-1α是合适的。
值得注意的是，数据以白细胞百分比表示。数据为平均值和标准差（每组n=10）。统计分析：a、b、c和d：分别与N-NOR、T-NOR、N-HYP和T-HYP相比存在显著差异（p<0.05）。符号“星号”表示显著效应或交互作用。
4. 讨论
我们的研究有助于理解高强度生活与低强度训练如何影响关键代谢元素，如HIF-1α和PGC-1α。暴露于低强度生活与高强度训练的小鼠的SPA（自发体力活动）和训练量显著减少，表明它们经历了比完全处于常氧条件下的训练小鼠更大的生理挑战。这些诱导的行为变化可能作为一种适应性反应，有助于减轻生理压力并在抗氧化途径（如OXR1）激活之前支持肌肉恢复。我们开发了一个总结（图7），突出了本研究中检查的主要变量之间的联系，特别是与缺氧和有氧训练相关的联系。
图7展示了本研究中讨论的有氧训练和缺氧之间潜在的生理相互作用示意图。尽管在分析时没有观察到，但在缺氧暴露期间HIF-1α的稳定可能是发生的。抑制脯氨酰羟化酶（PHD）活性可以增强无氧糖酵解通量并下调氧化代谢。这种代谢转变可能是一种减少活性氧生成的策略。低强度生活与高强度训练模型可能使骨骼肌承受更大的压力，因为暴露于这种条件的小鼠与在常氧条件下训练的小鼠相比，表现出明显的自发体力活动减少和完成规定训练课程的能力下降。虽然从统计学角度来看这似乎是因果关系，但不应忽视可能存在一种调节机制，即向肌肉发送信号以减少其活动以防止损伤，即使在没有通常与氧化应激缓解相关的分子标志物（如PGC-1α和OXR1）可观察到的变化的情况下也是如此。在讨论这一点时，考虑HIF-1α是合适的，不仅因为它在缺氧中的重要性不可否认，而且因为某些误解已经固化成了一种普遍的看法。一个常见的例子是假设任何涉及缺氧的研究都应该发现HIF-1α蛋白的增加。然而，这种观点可能是误导性的，因为HIF-1α的检测和水平取决于多种因素，这些因素远远超出了单纯的缺氧暴露。因此，将特定实验条件下获得的HIF-1α发现普遍化为普遍适用的结果可能导致概念上的错误和过于简化的解释。缺氧暴露的持续时间是一个调节HIF-1α动态的关键因素，因此在考虑这一时间维度时需要谨慎。人们经常假设在急性缺氧期间观察到的HIF-1α反应会在持续缺氧期间持续存在。然而，不应做出这样的推断，因为实验证据并不支持这一点，实验证据表明HIF-1α蛋白的急性增加本质上是短暂的，并不会持续很长时间。例如，Le Moine等人（2011）显示，暴露于低气压缺氧1周的小鼠的HIF-1α和PDK1蛋白表达明显低于仅暴露24小时后的小鼠。这种减少非常显著，以至于1周后，HIF-1α和PDK1的水平几乎与常氧组无法区分，尽管缺氧暴露仍在继续。Chávez等人（2000）在大鼠中也描述了类似的时间轮廓，显示HIF-1α在缺氧初期急剧上升，但随后在第21天下降，尽管动脉氧张力持续较低。与这些体内观察结果一致，培养细胞的研究表明HIF-1α蛋白水平在持续缺氧培养1周后下降（Bartoszewska等人，2015；Ginouvès等人，2008；Ravenna等人，2014；Stiehl等人，2006）。因此，我们研究中HIF-1α的缺乏不应被解释为整个实验期间缺氧信号缺失的证据。因为即使在缺氧暴露的几小时内，也会激活减弱HIF-1α稳定的机制，我们的发现是生物学上一致的，因为组织采样仅在8周后进行，远远超出了HIF-1α上调的短暂窗口。为了捕捉缺氧初期几天内HIF-1α表达的短暂增加而获取组织样本在逻辑上是不切实际的；然而，未来的研究应考虑评估非侵入性的红细胞生成激活标志物，如促红细胞生成素，因为这些可能提供对缺氧适应的更全面的理解，而这无法通过当前的实验设计实现。尽管持续缺氧暴露，HIF-1α的下降通常归因于HIF-1α的脱敏，这是一种被认为是细胞生存所必需的适应性反应。与这一观点一致，Ginouvès等人（2008）证明，在慢性缺氧下持续强制激活HIF-1α可以诱导细胞死亡。尽管这种下调的机制尚未完全阐明，但越来越多的证据表明脯氨酰羟化酶域（PHD）酶是这一过程的核心调节因子（Ginouvès等人，2008；Marxsen等人，2004；Stiehl等人，2006）。虽然PHD抑制对于确保急性缺氧期间的HIF-1α稳定是必要的，但慢性缺氧暴露与PHD（特别是PHD2和PHD3亚型）表达的增加有关。这种适应性反馈机制扩大了PHD分子的细胞池，使得即使在短暂的再氧合事件中也能快速降解HIF-1α。在我们的实验模型背景下，这一机制为我们的HIF-1α发现的一致性提供了额外的解释，因为在日常训练期间以及安乐死当天经常重新暴露于常氧条件。除了暴露持续时间外，缺氧强度也是调节HIF-1α稳定的另一个关键因素。然而，氧水平与HIF-1α反应之间的关系强烈依赖于实验模型，因此必须在体外和体内研究之间谨慎进行比较。支持HIF-1α强烈Western blot信号的大部分经典证据来自体外实验，其中细胞培养暴露于极低氧条件，氧水平降低到约1% O₂或更低（Abreu-Rodríguez等人，2011；Arsham等人，2003；Bracken等人，2006；Ginouvès等人，2008；Jewell等人，2001；Marxsen等人，2004；Namas等人，2011；Papandreou等人，2006；Wang等人，2013）。虽然细胞培养有助于阐明HIF-1α调节的分子机制，但它们在孤立和高度简化的条件下运作，与完整生物体的整合和异质性生理环境大不相同。此外，体外模型中施加的缺氧程度（约1% O₂）在体内很少遇到，通常仅限于极端情况，如严重病理状态（例如，实体肿瘤）或暴露于严重环境缺氧（Brizel等人，1995；Koong等人，2000；McKeown，2014；Vaupel等人，2002）。这种区别有助于解释为什么在体内研究中报告的HIF-1α稳定通常依赖于更严重的缺氧暴露，这些研究通常涉及接近或低于10%的吸入氧分数（Belaiba等人，2007；Chaudhary等人，2012；De Palma等人，2007；Le Moan等人，2015；Stroka等人，2001；Van Thienen等人，2016；Xu等人，2021）。虽然在急性缺氧期间观察到的HIF-1α反应会持续，但这种推断不应被做出，因为实验证据并不支持这一点。虽然PHD抑制对于确保急性缺氧期间的HIF-1α稳定是必要的，但慢性缺氧暴露与PHD（特别是PHD2和PHD3亚型）表达的增加有关。这种适应性反馈机制扩大了PHD分子的细胞池，使得即使在短暂的再氧合事件中也能快速降解HIF-1α。在我们的实验模型背景下，这一机制为我们的HIF-1α发现的一致性提供了额外的解释，因为在日常训练期间以及安乐死当天经常重新暴露于常氧条件。除了暴露持续时间外，缺氧强度也是调节HIF-1α稳定的另一个关键因素。然而，氧水平与HIF-1α反应之间的关系强烈依赖于实验模型，因此必须在体外和体内研究之间谨慎进行比较。支持HIF-1α强烈Western blot信号的大部分经典证据来自体外实验，其中细胞培养暴露于极低氧条件，氧水平降低到约1% O₂或更低（Abreu-Rodríguez等人，2011；Arsham等人，2003；Bracken等人，2006；Ginouvès等人，2008；Jewell等人，2001；Marxsen等人，2004；Namas等人，2011；Papandreou等人，2006；Wang等人，2013）。虽然细胞培养有助于阐明HIF-1α调节的分子机制，但它们在孤立和高度简化的条件下运作，与完整生物体的整合和异质性生理环境大不相同。此外，体外模型中施加的缺氧程度（约1% O₂）在体内很少遇到，通常仅限于极端情况，如严重病理状态（例如，实体肿瘤）或暴露于严重环境缺氧（Brizel等人，1995；Koong等人，2000；McKeown，2014；Vaupel等人，2002）。这种区别有助于解释为什么在体内研究中报告的HIF-1α稳定通常依赖于更严重的缺氧暴露，这些研究通常涉及接近或低于10%的吸入氧分数（Belaiba等人，2007；Chaudhary等人，2012；De Palma等人，2007；Le Moan等人，2015；Stroka等人，2001；Van Thienen等人，2016；Xu等人，2021）。虽然在严重环境缺氧下HIF-1α稳定更为明显，但这并不意味着在轻度缺氧条件下HIF-1α信号不存在。我们假设我们缺氧组中HIF-1α蛋白水平的缺乏不太可能归因于缺氧强度不足。支持这一解释的是，先前的研究报道在缺氧条件下特定组织中的HIF-1α增加（约15% O₂），与本研究中使用的条件相当（Jochmans-Lemoine等人，2016；Stroka等人，2001）。此外，即使更严重的缺氧也不一定会导致HIF-1α的持续积累，因为上述的脱敏机制。因此，使用中等强度的缺氧刺激（FiO₂=14.5%）在生理上是合适的，并且与先前的慢性啮齿动物研究一致，这些研究显示了适应性反应（Bor-Kucukatay等人，2014；Çolak等人，2021；Shi等人，2013）。人类研究进一步支持2000至3000米高度是最优的（Chapman等人，2014；Wilber等人，2007），这与本研究中使用的14.5% FiO₂一致，大约相当于3000米的高度（Parati等人，2018）。我们选择这种模拟高度因此达到了平衡，避免了极端情况，这些情况可能无效或有害。具体来说，较低的高度（<1500米）可能提供不足的缺氧刺激，而长时间暴露于非常高的高度（>4000米）与生理功能障碍增加有关。作为最后的考虑，需要强调的是，在体内缺氧研究中未能检测到HIF-1α的稳定化并不应使研究无效或削弱其可信度；相反，这突显了缺氧条件下HIF-1α生物学的复杂性。关于PGC-1α没有显著差异的结果并不令人惊讶。Martinez-Bello等人（2011年）也未能证明缺氧与训练结合对啮齿动物肌肉组织中PGC-1α蛋白水平有叠加效应。这可能是由于缺氧诱导的PGC-1α下调，从而抵消了有氧训练可能带来的任何改善。缺氧与有氧训练效应之间可能存在相互作用，加之缺乏评估这两种效应之间相互作用的研究，这突显了使用LHTL模型进行进一步探索的迫切需求。实际上，即使在单独研究缺氧的情况下，关于PGC-1α相关反应的证据也存在相当大的异质性。虽然一些研究未能证明缺氧会导致PGC-1α减少（Chaillou等人，2013年；Ferri等人，2018年），但其他研究则发现PGC-1α在缺氧条件下会下调（Gamboa & Andrade，2010年；Levett等人，2012年）。尽管PGC-1α在调节有氧代谢、线粒体生物发生和肌肉萎缩方面起着重要作用（Knutti & Kralli，2001年；Lin等人，2002年；Popov，2020年；Sandri等人，2006年；Wang等人，2017年；Wu等人，1999年），但我们对这一途径如何响应特定干预措施的理解仍存在很大空白。因此，研究保护性蛋白（如OXR1）如何保护细胞及其成分（如DNA）免受氧化损伤变得至关重要（Zhang等人，2018年）。基于此，我们假设暴露于LHTL模型（即T-HYP组）的小鼠会表现出比其他实验组更高的OXR1表达。然而，与我们的假设相反，LHTL暴露对OXR1水平没有显著影响。这使我们推测了几种可能性。一种可能的解释是，本研究中应用的常氧训练与缺氧生活的结合可能没有构成足够的生理压力来诱导OXR1上调，因为OXR1的激活可能在严重的氧化应激条件下更为明显，例如疾病、过度训练或能量需求增加时。另一种可能是，SPA和训练量的减少起到了补偿作用，使肌肉能够恢复并防止损伤，从而消除了OXR1表达变化的需要。此外，小鼠在缺氧状态下有氧代谢的减少可能会损害肌肉修复过程，因为恢复高度依赖于这一途径。这提出了一个重要的问题：在组织再生至关重要的关键恢复窗口期间，每天让动物暴露于缺氧环境中是否真的有效？尽管LHTL模型的一个关键特点是仅在不训练期间限制缺氧暴露，但在恢复特别关键的几天避免缺氧可能是必要的。例如，这可以通过肌酸激酶水平升高或肌肉酸痛的行为迹象来指导。然而，需要强调的是，这些明显的训练完成障碍仅在第五周训练后出现——在训练强度增加之后。在前三周内，训练的执行是一致且完整的。这引出了另一个问题：为什么在强度调整后，即使所有组的新工作量（设定为临界速度的80%）相同，缺氧暴露的训练小鼠仍无法完成训练？尽管我们还没有明确的答案，但似乎存在一种最佳的训练变量组合（我们尚不清楚）对于LHTL模型的成功是必要的。就身体健康而言，不能得出LHTL模型更有优势的结论，因为有氧能力的改善并没有超过那些既训练又生活在常氧环境中的小鼠。文献中建议，活性氧（ROS）的过度生成会损害肌肉功能（McGinnis等人，2014年；Reid等人，1993年），但这些效应似乎并不普遍，可能因肌肉类型而异。在这方面，比目鱼肌似乎比腓肠肌更容易受到ROS介导的氧化损伤（Yanar等人，2019年）。基于此，我们最初假设暴露于LHTL的小鼠的比目鱼肌（而非腓肠肌）中的OXR1表达会更高。尽管事后分析没有显示出统计学上的显著差异来支持这一假设，但值得注意的是，T-HYP组和N-NOR组之间的腓肠肌p值为0.452，而比目鱼肌的p值为0.064。这显然只是一个趋势，鉴于没有统计学上的显著差异，任何关于比目鱼肌对LHTL诱导的压力更敏感的猜测都纯属推测，需要进一步研究。缺氧、运动和免疫系统之间的强烈联系证明了我们研究中白细胞浓度的分析是合理的。尽管有关于高海拔暴露后白细胞变化的大量人类和动物模型研究证据（Klokker等人，1993年；Thake等人，2004年；Beidleman等人，2006年；Mariggiò等人，2010年；Al-Sweedan & Alhaj，2012年），但关于有氧训练引起的白细胞浓度变化是否会因慢性缺氧暴露而增强或抑制仍存在许多不确定性。在本研究中，与N-NOR组相比，生活在缺氧环境中的动物的总白细胞（淋巴细胞和单核细胞）减少了。这些细胞的减少可能表明它们从血液迁移到了组织中（Dhabhar等人，2012年；Rahat等人，2006年；Strehl等人，2014年），但在我们的背景下，这种解释仍停留在推测阶段。重要的是要记住，单核细胞会分化为巨噬细胞并被招募到受伤部位以帮助宿主防御。虽然这一过程对愈合是必要的，但过度的炎症反应可能会限制组织和营养物质的供应。此外，炎症细胞在这些缺氧区域积累，对趋化因子的释放起着关键作用（Bosco等人，2008年；Knighton等人，1983年；Lokmic等人，2012年）。鉴于免疫细胞在组织中的积累可能导致氧化应激（Dietrich-Muszalska等人，2012年；Rodríguez-Iturbe等人，2004年），从而创造一个不利于肌肉收缩的细胞环境，因此可以推测这种机制可能导致了T-HYP组观察到的训练量减少。然而，这种解释应谨慎对待，因为我们的结论是基于系统（血液）测量，而不是直接评估肌肉组织内的免疫细胞浸润或氧化应激。我们研究中的一个关键发现是N-HYP组（未接受训练但暴露于缺氧的小鼠）中的嗜酸性粒细胞水平增加。这与现有研究一致，表明低氧水平可以增强嗜酸性粒细胞的存活（Porter等人，2017年）。缺氧诱导的嗜酸性粒细胞增加可能代表了一种有益的适应性反应，旨在通过上调促血管生成因子（如血管内皮生长因子VEGF）来改善氧气输送（Horiuchi & Weller，1997年；Nissim Ben Efraim等人，2010年）。有趣的是，LHTL组（也暴露于缺氧的训练小鼠）中没有观察到嗜酸性粒细胞的增加。我们推测，有氧训练可能抵消了通常会上调嗜酸性粒细胞存活和招募的缺氧诱导信号机制，特别是涉及外毒素的机制（Horiuchi & Weller，1997年；Nissim Ben Efraim等人，2010年）。基于这些结果，我们认为缺氧与有氧训练之间的相互作用导致的免疫调节适应更为复杂，因此应该更彻底地进行研究，包括在不同的运动方式和哺乳动物物种中。尽管这项研究进行得非常仔细，但它仍存在某些局限性。尽管采用了高度复杂的Western blotting方法，但该研究在提供氧化代谢和氧化还原调节机制的深入表征方面仍有限。使用高级评估方法，包括高分辨率呼吸测定和详细的线粒体检测，可以更全面地探索这些途径。此外，我们没有进行体外肌肉收缩测试，这本可以为运动相关参数和SPA的体内评估提供补充信息。缺乏这些体外技术可能限制了我们确定观察到的损伤的确切来源的能力，无论是来自收缩装置的结构改变还是代谢变化。尽管没有完全阐明潜在机制，我们的发现清楚地表明，在LHTL模型下受试的啮齿动物存在显著的肌肉功能障碍。这表明，在常氧条件下结合缺氧（即使是中度的）和有氧训练所带来的挑战是巨大的，远非琐碎。另一个超出本研究范围的问题是，我们无法确定如果动物处于自然高海拔环境中，适应情况是否会不同。从我们的角度来看，选择使用常压帐篷模拟缺氧是合适的。这种方法使我们能够创建一个受控环境，模拟高海拔条件，从而能够在没有自然高海拔环境相关混淆因素（如紫外线暴露、温度变化和营养不足）的情况下研究缺氧的影响。由于我们没有测试不同的缺氧剂量或训练强度和持续时间，我们的设计无法确定最佳的缺氧暴露持续时间或程度，或最佳的训练方案以改善代谢的关键要素。研究人员已经讨论了缺氧剂量的个性化（Bertucci等人，2024年；Soo等人，2020年）。当然，运动生理学家也在讨论适当的剂量以改善运动表现（Sinex & Chapman，2015年）。我们预测，在不久的将来，个性化的缺氧方案对于设计研究项目和实施优化程序以引发生理适应和改善表现至关重要。训练设置对LHTL模型的有效性至关重要，因此我们根据每只小鼠的心率（CV）个性化了训练强度。这种方法反映了我们认识到训练设置在实现LHTL模型成功中的关键作用。尽管如此，我们的研究仍是一项初步探索，许多问题仍未得到解答。事实上，关于在动物中应用LHTL模型的研究仍处于早期阶段，据我们所知，迄今为止发表的研究不到十项（Miyazaki & Sakai，2000年；Martinez-Bello等人，2011年；Li & Wang，2013年；Çolak等人，2021年；Scariot等人，2023年）。进一步探索的关键领域包括比较连续训练与间歇训练的效果，以及理解周期化和恢复时间在优化生理结果中的作用。LHTL模型值得更多的科学关注，因为它提供了一种成本效益高且物流效率高的传统高海拔训练替代方案。模拟缺氧环境（高海拔舱/帐篷）使运动员更容易在任何地方使用缺氧模型，避免了自然高海拔环境中的某些不便，如免疫抑制和睡眠障碍（Flaherty等人，2016年；Pyne等人，2000年）。尽管缺氧应用的主要兴趣仍集中在运动生理学和运动科学领域（Viscor等人，2018年），但深入了解有氧训练生物体的缺氧反应是必要的，因为这些适应不仅影响表现，还在生物学和医学领域具有重要的意义。
5 结论
在本研究中实施的条件下——使用常压缺氧帐篷（FiO₂为14.5%），每天18小时，持续8周——LHTL模型并未导致HIF-1α、PGC-1α和OXR1在各种组织中的表达高于单独训练的情况。尽管没有观察到与氧化代谢相关的生物分子变化，但这并不意味着LHTL模型的要求微不足道。相反，诱导的行为变化——如自发性体力活动减少和完成训练的能力下降——在暴露于LHTL模型的小鼠中比那些完全在常氧环境中训练和生活的 mice 中更为明显。作者贡献
在本研究中，Scariot P.P.M.、Papoti M.、Manchado-Gobatto F.B. 和 Gobatto C.A. 提出了研究思路，设计了实验方案，并提供了资金支持。Scariot P.P.M.、Polisel E.E.C. 和 Orsi J.B. 参与了数据收集、数据分析及结果解读工作。Scariot P.P.M.、Papoti M.、Hill D.W.、Polisel E.E.C.、Manchado-Gobatto F.B. 和 Gobatto C.A. 共同参与了数据讨论，并撰写了论文稿件。所有作者都对论文进行了严格审阅，最终审阅并同意了论文的定稿版本。
资金信息
本研究部分由巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES，资助代码001）提供资金支持。同时，我们也感谢圣保罗研究基金会（FAPESP，资助项目编号2015/00272-6、2015/01362-9、2017/10201-4、2019/05115-7、2023/02728-3）以及国家科学技术发展委员会（CNPq，项目编号307395/2013-8、302827/2015-3、444434/2024-0）的资助。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
伦理声明
所有研究程序和方案均获得了伦理审查委员会（CEUA-UNICAMP，协议编号5509–1/2020）的批准。所有实验操作均遵循相关指南和法规（包括加拿大动物护理委员会指南及《实验室动物护理与使用指南》）。作者确认在科学研究过程中严格遵守了保护实验动物的法律法规和标准。
数据可用性声明
数据可应要求提供。
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