基因表达的第一个也是最关键的层面是遗传信息从DNA转录为RNA。在这个过程中，转录起始是关键步骤，影响着所有下游事件。启动子是位于转录起始位点上游的DNA序列，是RNA聚合酶(RNAP)识别和结合以启动转录的核心元件。越来越多的证据表明，许多转录单位并非由单一的启动子控制，而是由两个或多个启动子协同调控，这种组合式架构在所有生命领域中都存在。本综述重点探讨了微生物中这种组合式启动子排列如何控制基因表达，并简要比较了其他生物体中的情况。我们还探索了这些启动子结构如何作为应激相关分子（如抗生素）的传感器，并讨论了如何利用这些见解来预测先前未识别的抗生素耐药性机制。最后，概述并讨论了双启动子在合成生物学中的应用。
介绍关键参与者：RNAP、σ因子、启动子及其组合
细菌RNAP通过称为σ因子的可解离亚基识别启动子，σ因子介导转录起始。细菌启动子（核心启动子）的最小长度约为35-40 bp，通常包含两个被识别的保守元件（六聚体序列），分别称为-35和-10（针对σ70型σ因子）或-24和-12（针对σ54型σ因子）。根据启动子的方向，存在三种可能的双启动子组合。第一种是头对尾排列，也称为串联启动子，即两个启动子方向相同。经典的例子是rRNA操纵子的P1和P2启动子。第二种是尾对尾排列，启动子方向相反，也称为反向启动子。反向启动子的一种特殊类型是双向启动子，其-35或-10区域存在重叠。第三种是头对头排列，即启动子方向相对，也称为会聚启动子。在大肠杆菌中，已鉴定出173对这样的启动子对，启动子间距离为200 bp。
影响双启动子相互作用的因素
多种因素影响双启动子之间的相互作用。首先是σ因子身份。细菌含有多种类型的σ因子，其数量与生活方式的复杂性相关，单个物种中可超过100个。不同σ因子的组合通过串联启动子控制许多基因。例如，一个启动子可由持家σ因子（如枯草芽孢杆菌的σA、大肠杆菌的σ70）识别，另一个则由替代σ因子（如参与应激反应、发育程序）识别。第二个关键因素是DNA超螺旋。DNA拓扑结构对启动子活性至关重要。负超螺旋（相对于松弛的B-DNA而言的 underwinding）有利于转录泡的形成，从而驱动转录。而转录中的RNAP本身也会改变DNA拓扑结构：在移动的RNAP前方（下游），DNA变得过度缠绕，产生正超螺旋；在RNAP后方（上游），DNA变得缠绕不足，产生负超螺旋。此外，RNAP会使DNA弯曲，这可能影响紧密相邻的会聚启动子，使较强启动子的活动抑制较弱启动子的活性。虽然超螺旋在细菌中强烈影响邻近的启动子，但在真核生物中可能适用不同的情况，例如酿酒酵母中，由于保持足够水平的拓扑异构酶，超螺旋对串联和反向启动子的影响相对较小。超螺旋也受转录因子结合的影响。第三个因素是转录因子结合。转录因子结合到启动子附近或重叠的特异DNA序列上，发挥阻遏物、激活物或双重功能。例如，来自戈登氏菌的分解代谢物阻遏蛋白是一种作为阻遏物的转录因子，非对称地影响控制碳水化合物和氨基酸代谢相关基因的PmaiA和Phyd活性。而CtrA是一个激活物转录因子的例子，它通过单个结合位点激活球形红杆菌中的鞭毛启动子PfliL2和PfliF2。整合宿主因子则是具有双重作用的转录因子例子，它调节大肠杆菌中三个串联启动子（PR1-1,2,3）的相互作用，影响早期稳定期毒力因子K1荚膜的表达。第四个因素是启动子强度。在双启动子设置中，两个启动子从不相同，这导致了不对称性和转录干扰，并用于调控。如噬菌体中所发现的，较强的启动子会压制较弱启动子的活性，这在古菌、细菌和真核生物中也很常见。在哺乳动物基因组中，最近的研究估计，会聚启动子约占所有转录起始位点的25%，并产生5‘-重叠的反义RNA。
双启动子组合作为抗生素传感器
大约四分之三的抗生素是天然来源或其衍生物。由于细菌与抗生素生产者共享生态位，它们进化出了防御机制。编码这些耐药机制的基因可由双启动子排列调控。 最近的两个例子是枯草芽孢杆菌中的helD和pps基因，它们由会聚启动子对响应利福平进行调控。利福平是一种与细菌RNAP的β亚基结合并阻止RNA合成超过2-3个核苷酸的抗生素。HelD是一种解旋酶样RNAP相互作用蛋白，可从DNA上移除停滞的RNAP复合物，并通过扭曲其结合口袋来解离利福平（靶点保护）。Pps通过磷酸化使利福平失活。在控制helD和pps的会聚启动子对中，有义启动子较弱，RNAP逃逸慢，而反义启动子驱动短非编码RNA的强转录。在没有利福平时，反义启动子活性干扰有义转录。在亚抑制浓度的利福平下，由于反义启动子具有更高的RNAP通量，其更可能被利福平结合的RNAP占据。反义启动子的失活则允许有义启动子处的RNAP完成起始，转录helD和pps基因，从而增强细胞对利福平的防护。这种利福平诱导的转录增加效应显著，范围可达50至80倍。值得注意的是，至少在helD调控的情况下，当单独测试时，两个启动子并未显示出对利福平的差异敏感性。然而，也有报道称利福平对转录的差异效应，例如取决于+1位置的核苷酸特性。这也表明，每个转录周期产生大量短促流产产物的启动子，将比那些生理性核苷三磷酸允许快速过渡到利福平不敏感延伸复合物的启动子，有更多机会被利福平捕获。对于大肠杆菌中的串联启动子，有报道称利福平对每个启动子活性的差异降低会影响调控输出，但未观察到利福平依赖的转录刺激。另一方面，在耻垢分枝杆菌中，驱动RNAP大亚基基因转录的串联启动子检测到利福平引起的轻微启动子特异性刺激，但具体机制尚未完全阐明。双启动子排列也显示与转录因子结合控制抗生素耐药基因。这类转录因子的突出例子是大肠杆菌的多重抗生素耐药阻遏物和铜绿假单胞菌的AmpR。这两种转录因子都控制反向启动子对：MarR控制MarA的表达，而MarA是多重抗生素耐药和超氧化物耐药调节子的转录激活因子；AmpR则调控编码β-内酰胺酶的ampC基因。一种额外的、尚未鉴定的转录因子可能通过结合RAE参与双启动子系统中的抗生素耐药调控。RAE是一个19 bp的回文序列，在放线菌中利福平耐药相关基因的上游被发现。据推测，这种假定的转录因子与串联启动子协同作用。RAE-转录因子系统也可能在会聚启动子的背景下运作。为了验证这一假设，研究将已发表的helD/pps样会聚双启动子数据集与在RefSeq所有细菌基因组中全面搜索RAE基序的结果相结合。这两个数据集在77个细菌属中重叠出113个命中，揭示了会聚启动子相对于RAE位置的几种可能构型。 根据基因本体分类，大多数蛋白质未被归入任何类别。在已分配类别的蛋白质中，最具代表性的功能组是转运蛋白、转录调节因子和转移酶——这些蛋白质具有保护细胞抵抗利福平的强大潜力。在“其他”类别中，搜索还发现了可能间接参与耐药机制的蛋白质，如应激反应蛋白或细胞被膜蛋白。对这些蛋白质以及未分类蛋白质的研究，可能会揭示细菌抵抗抗生素的、迄今未知的新策略。
合成生物学
最后，双启动子在合成生物学中具有增强、微调和协调基因表达的潜力，特别是在蛋白质生产和代谢途径中。这些特性已被认识到，例如在枯草芽孢杆菌中，串联启动子已被用于将乙偶姻的产量提高700%。现在，综合研究正在兴起，以开发具有应用潜力的双启动子系统。有研究表征了与启动子区域两侧的两个抗生素耐药基因相结合的双向启动子库。所得的双启动子排列组合显示出广泛的活动范围。选定的组合可用于异源酶共表达或代谢工程的微调工具。然而，双启动子并不总是对工业生产目的有利，例如在大肠杆菌生产香叶醇的案例中，单启动子控制优于启动子组合。
结论
关于启动子组合的知识正在迅速扩展，增进了我们对调控系统（特别是在抗生素耐药性方面）的理解，并揭示了先前未认识到的耐药机制，对诊断和治疗具有重要意义。尽管取得了这些进展，功能上的见解仍然有限，需要对单个启动子及其组合进行大规模、系统的分析。另一个挑战是鉴定转录因子，例如结合RAE的转录因子，这为这些系统增加了另一层复杂性。因此，双启动子可以更有效地应用于合成生物学，其中额外的益处可能来自于与宿主转录网络隔离的正交调节器的开发。未来的进展将依赖于将分子见解与预测设计相结合，以阐明双启动子系统的调控逻辑，并使其能够在复杂的生物学环境中得到应用。
