5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）天然存在于微生物、植物和动物细胞中（Aiguo & Meizhi, 2019）。作为四吡咯化合物生物合成的关键前体，5-ALA是生命体中血红素和叶绿素等必需色素形成的核心分子（Bhagwat et al., 2021）。在农业领域，5-ALA可作为高效的植物生长调节剂，显著增强作物的光合作用和抗逆性（Rhaman et al., 2021; Wang et al., 2022）。在畜牧业中，它可以作为饲料添加剂来促进ATP的产生和免疫反应，从而促进动物生长（Hendawy et al., 2020）。在医学领域，5-ALA是一种高效且选择性的光敏剂，可用于肿瘤光动力治疗，具有广泛的应用前景（Heli et al., 2022; Sansaloni-Pastor & Lange, 2023）。与化学合成相比，微生物发酵生产5-ALA在成本、可扩展性和环境效益方面具有更大优势。化学合成通常依赖石油基原料和多个反应步骤，导致较高的材料和下游处理成本（Yu et al., 2015）。相比之下，发酵可以使用可再生底物（如葡萄糖），并且更兼容已建立的工业放大技术。此外，发酵通常在较温和的条件下进行，需要使用的有机溶剂较少，可能具有环境优势（Liu & Chen, 2023; Chen et al., 2024）。总体而言，这种基于微生物发酵的策略通过网络层面的代谢优化，实现了适用于大规模低成本生物制造的较高产量（Chu et al., 2023）。
5-ALA的生物合成主要通过两条不同的途径进行。C4途径（也称为Shemin途径）中，5-ALA合成酶（ALAS）催化琥珀酰-CoA和甘氨酸的缩合反应，PLP作为辅因子参与这一过程。该途径在真核生物（如动物、真菌和某些α-变形菌）中广泛存在（Yu et al., 2015）。而C5途径则从谷氨酸开始，涉及多个酶促步骤，包括tRNA酰基化、还原和转氨（Zhang et al., 2019），主要存在于植物、藻类和大多数细菌中。由于C5途径依赖于ATP和NADPH，其生产过程与细胞能量平衡、氧化还原状态和蛋白质合成紧密相关，因此较为复杂。
近年来，通过对α-变形菌资源的系统挖掘，发现了多种具有高催化活性的5-ALA合成酶。来自Sphingobium amiense和Komagataeibacter diospyri的ALAS酶在E. coli中表达后显著提高了5-ALA的产量（Wang et al., 2024; Zhou et al., 2024）。最近的研究还尝试通过共表达分子伴侣蛋白和采用稀有tRNA策略来提高ALAS在E. coli中的溶解度和活性（Bhagwat et al., 2021）。ALAS的催化活性高度依赖于辅因子PLP。5-ALA的下游转化由卟啉原合成酶（由hemB编码）催化。由于完全删除hemB会导致细胞死亡，因此精确的调控策略至关重要。最近的研究方法（如CRISPR干扰（CRISPRi）和反义RNA（asRNA）被用来适度减弱hemB的表达，从而在保持细胞活力的同时促进5-ALA的积累（Ge et al., 2021; Miscevic et al., 2021; Wang et al., 2024）。C4途径生产5-ALA需要充足的琥珀酰-CoA和甘氨酸前体。为了增加琥珀酰-CoA的供应，共表达了乌头酸酶（EcNAcnA）和ALAS，以增强三羧酸（TCA）循环的流量并进一步提高琥珀酰-CoA的生成（Shin et al., 2024）。为了提供甘氨酸，探索了甘油酸旁路途径，将碳流重新导向琥珀酰-CoA和甘氨酸的合成（Bashtani et al., 2021）。通过联合优化辅酶A和前体供应途径以及下调hemB的表达，工程菌株在批量发酵中的5-ALA产量达到了2.81 g/L（Ding et al., 2017）。此外，5-ALA的积累可能会产生活性氧（ROS），导致细胞氧化应激。为此，通过系统工程改造氧化损伤修复和ROS清除途径，菌株的耐受性得到提高，5-ALA产量增加了21.1%（Pu et al., 2023）。此外，为了调整发酵过程中的氧化还原状态和碳流平衡，实施了动态调控模块，进一步改善了5-ALA的生物合成能力（Zhou et al., 2024）。尽管在E. coli中进行的C4途径工程已经实现了与工业高细胞密度培养相匹配的5-ALA产量，但大多数报道的策略仍然依赖于基于质粒的过表达、抗生素选择和诱导剂依赖的调控。这些方法在实验室规模上有效，但往往增加了工艺复杂性和生产成本，从而限制了其工业应用。在本研究中，我们开发了一种染色体工程改造的5-ALA生产菌株，该菌株无需质粒、抗生素或外部诱导剂即可正常运行。这种设计提高了遗传稳定性，并支持可扩展且经济可行的发酵过程。
在本研究中，我们实施了系统性和模块化的基因组级代谢工程，构建了一种无需质粒的E. coli菌株，能够高效合成5-ALA（图1）。首先，利用DLKcat计算工具筛选并鉴定出来自Methylocystis属的高效5-ALA合成酶，并将其基因整合到染色体中以实现稳定表达。其次，构建了一个启动子库来调节下游基因hemB的表达水平。第三，对关键代谢途径进行理性工程改造，以优化碳流向5-ALA的转化。最后，通过转录组分析鉴定出与5-ALA合成相关的关键转录因子PspC。综上所述，通过将基因表达整合到染色体中，鉴定新的ALAS酶，筛选有效的hemB启动子，以及改造关键代谢途径和发现新的转录因子PspC，我们系统地改造了E. coli W3110菌株，得到了ALA33菌株。该菌株在可扩展的5-L发酵条件下的5-ALA产量达到了40.88 g/L，这是所有报道的无质粒、无抗生素和无诱导剂的非营养型菌株中最高的产量，证明了这一具有成本效益的生物工艺在工业应用中的巨大潜力。
