本研究旨在阐明牛乳铁蛋白（bLF）调控钌(III)配位的分子机制，并评估蛋白质引导的结合如何转化为结构和生物学效应。该蛋白质通过使用五氯钌酸钾（K2[RuCl5(H2O)）作为金属前体进行了修饰。所得到的LF–Ru系统通过光谱（荧光光谱、DLS、ATR-FTIR、SRCD）、光谱（ICP-OES）、显微镜（LM、SEM-EDS、TEM-EDS）、散射（SAXS）和电泳（SDS-PAGE）技术进行了全面研究。评估了LF和LF–100Ru对革兰氏阳性（粪肠球菌）和革兰氏阴性（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌）细菌的抗菌活性。使用鼠成纤维细胞（L929）、人肝细胞癌（HepG2）和人结直肠腺癌细胞（Caco-2）系研究了LF–Ru复合物对细胞的反应。分子对接表明，在含有组氨酸的区域，钌(III)的结合是可行的，这些区域与天然金属结合基序相关。分子动力学模拟支持了金属结合后的构象稳定性，而量子力学计算仅用于评估供体的选择性。吸附等温线更好地可以用朗缪尔模型描述，表明在低和中等负载下，钌(III)以类似饱和的方式结合到可接近的LF区域。在前体浓度最高时，BET分析结合TEM观察表明金属在蛋白质基质内有额外的二次积累。荧光淬灭表明LF–Ru系统中存在强烈的相互作用（Ka = 1.789 × 10^4 M^-1）。脱附研究表明，在模拟的胃液和肠液中孵育后，LF–100Ru仅释放了少量的金属。重要的是，在测试条件下，LF–100Ru降低了HepG2和Caco-2细胞的存活率，而对正常L929成纤维细胞的毒性相对较低。
1. 引言
蛋白质-金属相互作用在生物系统中起着重要作用，它们控制着催化作用、氧的运输和储存、电子转移、生物分子的结构组织以及细胞信号传导和调控过程。理解蛋白质-金属系统中的分子相互作用机制对于设计和开发有前景的治疗策略具有巨大价值。钌(Ru)复合物因其广泛的治疗谱而受到认可，包括抗肿瘤、抗菌和抗氧化活性。钌的多种氧化态（从-II到+VIII）使得可以合成具有广泛生物相互作用和新作用机制的复合物，包括DNA损伤、ROS介导的细胞凋亡和抗转移活性。其中，Ru(II)和Ru(III)配合物被认为最具应用性，因为它们具有最高的化学稳定性。最后，Ru(III)复合物被认为是治疗癌症的更好选择，这主要归因于它们较低的毒性和更好的耐药性。然而，最有前途的Ru(III)候选药物NAMI-A和KP1019在临床化疗研究中未能达到预期的效率，这是由于严重的副作用和有限的生物利用率。一系列限制促使人们寻找更安全且有效的癌症治疗策略。靶向治疗是一种相对较新的先进治疗方法，但其应用程度不如化疗广泛。靶向治疗的关键原理是基于药物与特定分子靶标（如蛋白质、受体、酶等）的相互作用，这些靶标负责癌细胞的生存和增殖。靶向治疗提供了多个优势，如选择性和更好的患者耐受性，从而促进了多种药物递送系统的开发。在这种情况下，必须克服与靶向效率、递送系统稳定性和生物相容性相关的一系列挑战。近年来，牛乳铁蛋白（bLF）作为转铁蛋白家族的一员，已被认为是生物活性物质（如金属离子、纳米颗粒、脂肪酸、核酸、脂多糖、维生素和其他蛋白质）的潜在载体。此外，bLF是一种可生物降解、无毒且不诱导免疫反应的蛋白质，具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗癌活性。这些多样的生物特性使bLF成为生物医学应用的理想候选者。它是一种大型糖蛋白（分子量约为77–91 kDa），其特征是对铁的高亲和力（KA约为10^20 M^-1）。因此，LF自然地充当铁的载体，通过受体介导的内吞作用实现其在肠道中的有效吸收。LF受体（LFRs）表达在各种类型的细胞表面，例如肠上皮细胞、肝细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、神经元和中性粒细胞以及巨噬细胞。重要的是，已经在癌细胞中报告了LFRs的过表达，这表明LF作为靶向抗癌治疗的药物载体的高潜力。值得注意的是，钌能够模仿铁与转铁蛋白家族蛋白质的结合；因此可以假设钌的摄取方式与铁相似——通过受体介导的内吞作用进行。先前的研究主要集中在探究Ru(III)复合物与转铁蛋白（TF）之间的相互作用；然而，关于LF–Ru结合机制的信息仍然有限。研究表明，KP1019以2:1的摩尔比与人类apo-转铁蛋白（apo-hTF）的特定铁结合位点结合，而在更高的摩尔比下则非特异性结合。类似地，Levina等人注意到KP1019与holo-TF中的铁结合位点竞争，导致TF与TF受体（TFR）之间的相互作用受损，从而降低了金属的摄取。相比之下，Wang等人证明，人类高白细胞白血球（HL-60）细胞通过TF介导的Ru(III)摄取不受共存的Fe(III)的影响，因为这两种金属占据不同的结合位点。尽管LF和TF属于同一蛋白质家族并且序列同源性约为60%，但它们的结构差异显著。例如，LF中的铁释放速度大约是TF的100倍慢；因此其结构对蛋白水解的抵抗力更强。此外，LF的等电点明显更高（约为8–9），而TF的等电点在5–6范围内。蛋白质的等电点显著影响表面电荷特性，从而影响与其他分子进行静电相互作用的倾向。因此，LF–Ru复合物的设计将显著改进Ru(III)复合物通过受体介导途径的递送。重要的是，LF–Ru复合物的设计可能为功能化生物分子的结构特性和生物活性提供新的见解。为此，选择了五氯钌酸钾（K2[RuCl5(H2O)）作为前体。与常用的Ru(III)前体（如三氯化钌水合物RuCl3·xH2O）相比，K2[RuCl5(H2O)是一种在水溶液中具有增强水解稳定性的明确配位复合物，且不易发生不受控制的聚合。因此，其在LF修饰和LF–Ru复合物制备中的使用提供了更大的控制性和可重复性。所选的Ru(III)复合物之前没有被发现具有任何特定的生物特性；然而，它具有高水溶性和紧凑性，因此我们假设它可以容易地结合到LF生物分子中。通过一系列光谱（荧光光谱、ATR-FTIR、DLS）、光谱（ICP-OES）、散射（SAXS）、显微镜（LM、SEM-EDS、TEM-EDS）和电泳（SDS-PAGE）技术分析了合成的LF–Ru复合物中的相互作用性质。通过包括分子对接、分子动力学（MD）和密度泛函理论（DFT）在内的计算方法的应用，填补了实验数据之间的空白。通过测试LF–Ru复合物对革兰氏阴性（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌）和革兰氏阳性（粪肠球菌）细菌的抗菌性能来评估其生物活性。还研究了LF–Ru复合物对细胞存活率及其细胞毒性的影响，包括鼠成纤维细胞（L929）、人肝细胞癌（HepG2）和人结直肠腺癌细胞（Caco-2）。
2. 实验
2.1. 材料
用于分析的牛乳铁蛋白（bLF）与之前的研究相同。五氯钌酸钾（K2[RuCl5(H2O)）、冰醋酸（CH3COOH）和醋酸钠（CH3COONa）购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。
2.2. Ru(III)结合到LF的批量等温研究
通过批量吸附方法分析了LF–Ru的结合机制。在本研究中，使用五氯钌酸钾作为钌前体。将适当量的Ru(III)复合物溶解在0.1 M醋酸缓冲液中（pH 4），浓度分别为1.25、2.5、5、10、25、50、75、100、150、250和500 mg L^-1。同样，将LF悬浮在醋酸缓冲液中（pH 4），浓度为1000 mg L^-1，然后与Ru(III)复合物溶液以1:1（体积比）混合。相应的混合液中的Ru与蛋白质的摩尔比分别为0.27/1、0.53/1、1.07/1、2.14/1、5.34/1、10.68/1、16.02/1、21.36/1、32.04/1和106.79/1（每摩尔LF的Ru摩尔数）。反应混合物在37 °C和400 rpm下孵育24小时，使用Eppendorf ThermoMixer（德国汉堡）。之后，将其转移到具有3 kDa分子量截留的Amicon-0.5离心过滤器中，并以14,000 rpm离心5分钟，以分离形成的复合物和未结合的金属离子。收集的滤液溶解在2%硝酸中，然后通过ICP-OES测定Ru(III)的浓度。
2.3. Ru(III)结合到LF的动力学研究
通过进行动力学结合研究进一步探究了LF–Ru复合物的形成机制。首先，将LF溶液（1000 mg L^-1）与两种不同浓度的Ru(III)复合物溶液（10和100 mg L^-1）以1:1（体积比）混合。混合物在37 °C和400 rpm下孵育不同时间，分别为2、5、10、20、30、60、120、300、450和1440分钟。未结合的Ru(III)使用与上一步相同的程序进行定量。
2.4. LF–Ru复合物的制备
根据等温和动力学研究，选择了三种浓度的五氯钌酸钾（1.25、100和500 mg L^-1）进行大规模合成LF–Ru复合物，分别命名为LF–1.25Ru、LF–100Ru和LF–500Ru。根据等温研究，复合物中结合的Ru与bLF的摩尔比分别为0.10/1、8.43/1和28.85/1（每摩尔LF的Ru摩尔数）。合成条件与第2.2节中描述的相同。孵育24小时后，将反应混合物转移到具有3 kDa MWCO的Amicon-15离心过滤器中，并以6000 rpm、4 °C和40分钟离心。含有LF–Ru复合物的浓缩物用蒸馏水清洗两次，然后用冷冻干燥机（Labconco，美国堪萨斯城）在-54 °C和0.080 mbar下过夜冷冻干燥，直到获得干粉。
2.5. LF–Ru复合物的荧光性质研究
2.5.1. 三维光谱测量
最初，将LF和LF–100Ru溶解在去离子水中，浓度为100 mg L^-1。使用Jasco FP-8300荧光光谱仪（JASCO，美国马里兰州东顿）在特定的激发（200–730 nm）和发射（210–750 nm）范围内记录三维荧光光谱。测量间隔为5 nm，扫描速度为5000 nm min^-1。
2.5.2. LF–Ru系统中猝灭机制的分析
准备了Ru(III)复合物浓度分别为1.25、2.5、5、10、25、50、75、100、150、250和500 mg L^-1的一系列溶液，用于Stern–Volmer实验。将蛋白质溶液（1000 mg L^-1）与金属复合物以1:1（体积比）混合。根据之前记录的LF的三维光谱（图S1）使用特定的最大发射波长。使用Varioskan™ LUX Multimode Microplate Reader（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）在λex/λem = 280/330 nm下分析荧光强度的变化。
2.6. 粒子大小和ζ电位测量
使用Malvern Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments，英国）分析了LF–100Ru复合物以及在不同介质（蒸馏水和pH 4的0.1醋酸缓冲液）中分散的LF的流体动力学直径和ζ电位的变化，浓度为1000 mg L^-1。分别使用DTS0012和DTS1070比色皿进行粒子大小和ζ电位测量。分析在25 °C下进行，平衡时间为120秒，使用手动模式运行。2.8. 同步辐射圆二色性（SRCD）研究
蛋白质样品的圆二色性（CD）光谱是在丹麦奥胡斯大学物理与天文学系的ASTRID2同步辐射源的AU-CD光路上记录的。光谱在25°C下使用Hellma公司的quartz suprasil cuvette类型121.000仪器，并在氮气气氛中收集，光程长度为0.1毫米。CD光谱以1纳米的间隔进行采集，每次测量平均获取2个数据点。最终的光谱是通过五个独立测量并经过基线校正后的平滑平均值计算得出的，这些数据点覆盖了178至280纳米的范围。光谱使用七点Savitzy–Golay滤波器进行平滑处理。蛋白质浓度是通过比勒雷特（biuret）方法测定的。分析得到的每个二级结构类型的百分比是通过将分配给特定二级结构的拟合峰面积除以所有拟合峰面积之和来计算的。
2.9. 小角X射线衍射（SAXS）分析
SAXS曲线是在德国汉堡DESY（德意志电子同步加速器）的Petra III储存环的P12光路上收集的。蛋白质样品（20微升）在去离子水或磷酸盐缓冲液中进行分析，相应的溶剂/缓冲液用于背景扣除。在测量前，样品经过离心处理以去除聚集物。所有数据都在15°C下收集，散射矢量（s）的范围为0.0088–5纳米。合并的数据集被用来检测最低s区域的浓度依赖性散射。所有SAXS数据都是使用ATSAS软件包处理的。积分、缩放和缓冲液扣除是使用PRIMUS程序完成的。得到的曲线用于后续的所有计算和重建。模型是使用DAMMIF软件计算的。结构参数和理论强度是使用CRYSOL软件计算的。回转半径（Rg）、最大直径（Dmax）和 pair-distance分布函数p(r) 是使用GNOM软件确定的。
2.10. 显微镜成像
2.10.1. 光学显微镜（LM）和配备能量色散X射线光谱仪（SEM-EDS）的扫描电子显微镜
少量的干燥后的bLF、LF–1.25Ru、LF–100Ru和LF–500Ru样品被固定在碳粘性盘（Leit Tabs）上，并安装在SEM样品架上。使用Axio Zoom.V16光学显微镜（Carl Zeiss Microscopy GmbH，德国耶拿）和EVO 15扫描电子显微镜（Carl Zeiss Microscopy GmbH，德国奥伯科亨）观察其形态和元素组成，该显微镜配备了背散射电子探测器（BSE）和SmartEDS能量色散X射线光谱仪（EDS）。
2.10.2. 透射电子显微镜配备能量色散X射线光谱仪（TEM-EDS）
TEM样品的制备方法是：将几毫克的材料分散在99.8%的无水乙醇中，然后在超声浴中超声处理5秒。随后，将5微升的悬浮液滴在带有孔洞的镀碳铜网格上（Lacey类型，Cu 400 mesh，Plano）。在常温下让溶剂蒸发，然后对粘附在网格上的干燥材料进行TEM分析。使用的仪器是Tecnai X-Twin透射电子显微镜（FEI Company，美国希尔斯伯勒），配备了暗场探测器（BF）、高角环形暗场探测器（HAADF）和Edax RTEM能量色散X射线光谱仪（EDS）。
2.11. 解吸研究
主要将LF–100Ru复合物溶解在水中，配制成浓度为10,000 mg L⁻¹的溶液。根据欧洲药典指南36，将样品与胃液（pH 1.4）和肠液（pH 7.25）按1:4的比例（v/v）混合，然后在37°C下孵育1、2和3小时。之后，将反应混合物转移到Amicon离心过滤器（截留分子量为3 kDa）中，并以14,000 rpm的速度离心5分钟。剩余的滤液适当溶解在2%的HNO₃中，使用ICP-OES方法分析释放出的Ru(iii)离子的量。同时，将LF–100Ru溶液（10,000 mg L⁻¹）在80°C下在王水中矿化3小时，以确定复合物中Ru(iii)的初始浓度。
2.12. SDS-PAGE分析
LF和LF–100Ru复合物的电泳分离是在4–12%的聚丙烯酰胺凝胶（Thermo Scientific，美国沃尔瑟姆）中进行非还原条件下进行的。通过向15微升样品中加入5微升的4×Bolt十二烷基硫酸锂（LDS）样品缓冲液（Thermo Scientific，美国沃尔瑟姆）来实现非还原条件。电泳在200 V电压下运行22分钟，使用1×MES流动缓冲液。凝胶通过Coomassie Blue R-350染色1小时后进行显色处理，然后 在去离子水中过夜脱色。
2.13. 胃蛋白酶消化动力学
胃蛋白酶消化动力学的研究方法与Pryshchepa等人之前描述的方法类似37。首先，在去离子水中制备清蛋白酶储备溶液（2000 U mL⁻¹），然后将其稀释至5 U mL⁻¹，并使用模拟的胃液进行稀释。底物LF和100LF–Ru复合物分别溶解在水中，得到浓度为5000 mg L⁻¹的工作溶液。酶/底物混合物的比例为0.1 U每100 µg，最终蛋白质浓度为1000 mg L⁻¹。一系列样品在Eppendorf ThermoMixer（德国汉堡）中在37°C下孵育1、2、5、15和30分钟。反应通过向反应混合物中加入0.7 M Na₂CO₃（占总样品体积的35%）来终止。最后，所有样品都通过SDS-PAGE在还原模式下进行分析。通过加入2 μL的10×Bolt还原剂（Thermo Scientific，美国沃尔瑟姆），其中含有500 mM的dithiothreitol（DTT）来达到还原条件，每20微升反应混合物加入该还原剂。
2.14. LF–Ru系统的分子对接
分子对接使用了holo-和apo X射线晶体结构数据。在PDB数据库中，只有一种holo-（铁饱和）的bLF X射线晶体结构，其中包含两个高亲和力金属配位位点——组氨酸253和595（PDB ID: 1BLF），分辨率约为2.80 Å，包含残基5–689。此外，还有一种apo-（无铁）的bLF X射线晶体结构（PDB ID: 4OQO），分辨率约为2.42 Å，包含残基342–689。在这种结构中，组氨酸253残基缺失；因此，只能研究组氨酸595位点。蛋白质结构是在Schrödinger Suite的蛋白质制备模块中准备的。向结构中添加了氢原子，并指定了键的顺序和二硫键。蛋白质的质子化状态是在pH 4.0下使用PROPKA软件确定的。蛋白质能量最小化是在OPLS4力场中进行的。[RuCl₅(H₂O)]²⁻复合物是使用Maestro构建的，并使用Jaguar应用进行了DFT几何优化和单点能量计算，Jaguar是Schrödinger Suite的一个组件。对于几何优化，使用了B3LYP-D3分子轨道和LANL2DZ基组对Ru原子进行优化，对剩余原子使用6-31G**基组。计算是在水溶剂中进行的，使用了极化连续模型。几何优化后，使用单点能量计算确定了静电势能，整个复合物的电荷设为−2。在MetalDock中，钌原子的几何优化和单点能量计算是自动化工作流程的一部分，使用ORCA 5.0执行。DFT计算使用了B3LYP理论和def2-TZVP基组对所有原子进行。分子对接是在Schrödinger Suite的Glide应用和MetalDock44工作流程中进行的，其中使用了AutoDock4对接引擎。使用了两种Glide特定的对接方法：标准精度对接和诱导Fit对接。对接网格框以蛋白质的组氨酸残基253和595为中心。MetalDock是一个专为金属复合物与生物分子的分子对接开发的开源工作流程。指出了Ru原子第一配位球中的空位，并在金属复合物中添加了一个虚拟原子，以便金属原子直接与蛋白质残基配位。分子对接也使用了AutoDock4作为对接工具。
2.15. 分子动力学（MD）和密度泛函理论（DFT）研究
我们分两个阶段进行了理论计算：（1）DFT和（2）经典MD。在DFT计算中，我们使用Gaussian09代码优化了单个氨基酸的结构、孤立的[RuCl₅(H₂O)]²⁻复合物以及与氨基酸相互作用的[RuCl₅(H₂O)]²⁻复合物，以获得它们的最低能量基态配置。采用了B3LYP杂化泛函，使用GENECP关键字定义了Ru(iii)的LANL2DZ基组，而对Cl、H、O、C和N原子则使用了6-31G基组。优化后的结构和相应的电子密度分布使用GaussView 5.0进行可视化。根据分子对接结果，只选择了一些氨基酸进行量子力学计算，以降低计算成本。对于每个系统，检查了所有可能的结合位点，并选择了最低基态能量的最有利配置进行进一步分析。对于经典MD模拟，牛乳铁蛋白（bLF）的初始结构是从RCSB蛋白质数据库中获得的：holo形式使用1BLF，apo形式使用4OQO。在三种模型配置完成分子对接后，每种情况下得分最高的姿态被用作MD模拟的起始结构。GROMACS软件使用CHARMM力场对蛋白质残基进行模拟，[RuCl₅]²⁻使用EasyPARAM衍生参数。在MD运行之前，含有[RuCl₅]²⁻的蛋白质使用SPC/E水分子在边长为10纳米的立方盒子中进行了溶剂化。系统的总能量被最小化以放松键并消除可能的结构冲突。使用Particle Mesh Ewald（PME）计算长程静电相互作用，非键合相互作用的截止距离设置为1.2纳米。最小化后，系统在NVT系综下使用Langevin恒温器加热至300 K。随后，在NPT系综下在1巴压力和310 K下平衡。每个平衡步骤持续100皮秒。生产运行持续30纳秒，之后分析轨迹并计算均方根偏差（RMSD）。
2.16. 基于雷莎嗪（Resazurin）的LF和LF–100Ru抗菌活性评估
使用三种细菌菌株评估了LF和LF–100Ru的抗菌活性：大肠杆菌ATCC 33876、粪肠球菌ATCC 51299和肺炎克雷伯菌B34。首先，细菌接种在Mueller–Hinton肉汤（MHB）中并在有氧条件下孵育24小时。之后，将制备的0.5 McFarland细菌悬浮液稀释100倍。在MHB中制备了一系列LF和LF–100Ru溶液，浓度分别为10,000、5000、2500、1250和625、312.5 mg L⁻¹。然后，将100 µL的细菌悬浮液与100 µL的分析样品混合，在96孔板上在37°C下孵育过夜。细菌悬浮液和培养基单独用作阳性和阴性对照。随后，向每个孔中加入10 µL的雷莎嗪溶液（100 mg L⁻¹），并在37°C下再孵育1小时。使用Varioskan™ LUX多功能微孔板读数仪在λex/λem = 560/590 nm下通过荧光强度的变化来确定细菌活力。所有分析对样品和对照样品都进行了三次重复实验。从每个分析样品和阳性对照中减去阴性对照的值。阳性对照的荧光值被设定为100%的细菌存活率。
2.17. 体外细胞系评估
LF–Ru复合物的细胞毒性在L929小鼠成纤维细胞系和人类上皮结直肠腺癌细胞Caco-2上进行了评估，这两种细胞均来自美国典型培养收集中心（ATCC），以及来自欧洲认证细胞培养物收集中心（Sigma Aldrich）的肝细胞癌细胞HepG2。所有细胞系均在添加了10%胎牛血清（Biological Industries）和抗生素（青霉素100 U/mL以及链霉素100 μg/mL，Capricorn Scientific GmbH）的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Biowest）中培养。培养物在37°C、5% CO2浓度的湿润培养箱中孵育。当细胞达到约70%的汇合度时，常规每周2-3次使用0.05%胰蛋白酶–EDTA溶液（Capricorn Scientific GmbH）进行传代。
2.17.1. 通过MTT测定细胞活力
通过MTT测定（3-(4,5-二甲基噻唑基)-2,5-二苯四唑溴化物；Thermo Fisher Scientific）来评估细胞对LF–Ru复合物的增殖反应。首先，将L929、HepG2和Caco-2细胞以每毫升5 × 10^4个细胞的浓度接种到96孔培养板（Jet Biofil）中，每孔加入100 μL添加了成分的DMEM，并在37°C下预孵育24小时。孵育后，细胞暴露于LF–Ru复合物48小时。制备复合物的储备溶液，然后在培养基中进行系列稀释，以获得最终浓度分别为625、1250、2500和5000 mg/L。此外，还准备了含有未修饰乳铁蛋白的对照样品，以及额外浓度的20,000和10,000 mg/L。处理后，移除培养基，并替换为100 μL在PBS中制备的MTT溶液（0.5 mg/mL）。培养板在37°C下孵育2小时以促进甲酚兰的形成。孵育期结束后，小心去除MTT试剂，然后向每个孔中加入50 μL绝对二甲基亚砜（DMSO）。轻轻摇动培养板10分钟。使用Varioscan™ LUX多模微孔读取器在570 nm和630 nm的参考波长下读取吸光度。通过将处理过的细胞与设定为100%存活率的对照组进行比较来计算存活率百分比。所有测试均进行了五次重复实验。此外，还使用Olympus EP50倒置相差显微镜观察了细胞形态和密度。
2.17.2. 通过LDH活性测量细胞毒性效应
通过使用CytoTox96非放射性细胞毒性测定试剂盒（Promega，美国威斯康星州麦迪逊）按照制造商的方案来量化细胞毒性效应，该方法通过测量乳酸脱氢酶（LDH）的释放来测定。每种条件都进行了五次重复实验。对于L929小鼠成纤维细胞、人类上皮结直肠腺癌细胞Caco-2细胞和肝细胞癌细胞HepG2细胞，在与测试物质孵育48小时后收集的50 μL上清液，转移到新的96孔培养板（Jet Biofil）中。CytoTox96试剂是通过结合测定缓冲液和底物混合物新鲜制备的。代表100% LDH释放的阳性对照是通过用0.8% Triton X-100处理细胞45分钟生成的。阴性对照包括培养基中的未处理细胞，而空白组则包含单独的培养基或含有指定测试物质的培养基，以便消除测量中的背景效应。随后，向每个孔中加入50 µL试剂，在21°C下黑暗中孵育30分钟。通过添加50 µL终止液来停止反应。使用Varioskan™ LUX多模微孔读取器在490 nm处测量LDH释放，从而反映膜损伤。结果以平均值±标准差（SD）表示。统计分析使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的后验多重比较测试进行。所有计算均使用GraphPad Prism 8.0.2软件（美国加利福尼亚州拉霍亚）完成。显著性水平表示如下：* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001。在某些情况下，当细胞存活率超过相同浓度的LF的对照值时，统计显著性用‘#’符号而不是星号标记。
3. 结果与讨论
3.1. 等温线研究
通过应用两种等温线模型，即Langmuir模型和Freundlich模型（图1A），研究了LF–Ru系统的结合行为。用于分析Ru(iii)与LF结合的等温线模型和热力学参数的详细描述见补充信息（SI）。图1包括：
(A) Ru(iii)在LF上的吸附等温线，(B) 改性的BET等温线，以及(C) Ru(iii)在LF上的吸附效率条形图。两种模型的计算吸附参数见表1。
Freundlich模型
Langmuir模型
n
KF [mg g^-1]
S
R^2
qmax [mg g^-1]
KL [L mg^-1]
S
R^2
1.63
3.24
45.8
0.969
56.9
0.033
10.3
0.993
实验吸附容量范围为0.12到36.4 mg g^-1。表2显示了形成的LF–Ru复合物中结合的Ru与bLF的摩尔比。qeq/Ceq关系更适合用Langmuir模型（R2 = 0.993）而不是Freundlich模型（R2 = 0.969）来拟合，这表明在研究的条件下Ru(iii)与有限数量的LF可结合区域发生了类似饱和的结合。计算的最大吸附容量（qmax）为56.9 mg g^-1，证实了Ru物种对LF的显著亲和力。之前确定的Fe(iii)在LF上的qmax为36.3 mg g^-1。
表2
获得的LF–Ru复合物中n(Ru)/n(LF)的摩尔比（mol Ru per mol LF）
值得注意的是，RL随着C0的增加而减小，这与所使用的関系一致。确定的无量纲平衡参数（RL = 0.28–0.99）表明LF–Ru的形成是令人满意的。尽管实验数据更适合用Langmuir模型拟合，但不应排除Freundlich模型的贡献，这表明整个装载范围内系统并不完全均匀。异质性因子（1/n < 1）也支持了有利的结合。为了进一步探测高装载行为，数据还使用了修正的BET风格表示方法进行了分析。所得图表表明，在初始类似饱和的结合阶段之后，可能在较高的Ru前体浓度下发生二次积累（图1B）。在这种情况下，BET类型的解释应被视为高装载行为的现象学描述，而不是多孔固体上经典多层吸附的证明。特别是，它可能反映了Ru在蛋白质基质内的二次积累或聚集，而不是严格的表面多层结构。这种解释与LF–500Ru的TEM观察结果更为一致，在最高装载量下才检测到富Ru的域。计算得的Ru(iii)在LF上的结合效率范围为24.0%到49.6%（图1C）。随着初始Ru(iii)复合物浓度从1.25 mg L^-1增加到10 mg L^-1，效率从37.5%增加到49.0–49.6%。随后，在25–500 mg L^-1范围内，效率从44.8%降低到24.0%，支持了最可结合区域的逐渐饱和。计算的吉布斯自由能变化（ΔG）在测试浓度范围内为−19.6到−16.6 kJ mol^-1，证实了在给定条件（T = 310 K）下LF–Ru的形成是自发的。相比之下，之前确定的LF–Ag系统的ΔG值范围为−25到−11 kJ mol^-1。
3.2. 动力学研究
为了评估LF–Ru结合的动力学，测试了两种初始Ru(iii)复合物浓度，即10 mg L^-1和100 mg L^-1（图2）。图2包括：
(A和D) LF–Ru结合的零阶动力学模型，(B和E) Weber–Morris颗粒内扩散模型，以及(C和F) 在初始Ru(iii)复合物浓度分别为(A–C) 10 mg L^-1和(D–F) 100 mg L^-1时Ru(iii)在LF上吸附效率的条形图。用于评估Ru(iii)与LF结合的动力学模型的详细描述见补充信息（SI）。因此，应用了零阶动力学模型来评估Ru(iii)浓度随时间(Ct)的变化。对于初始金属复合物浓度为10 mg L^-1的情况，观察到金属在2分钟内快速结合到LF上（k0 = 0.48 mg L^-1 min^-1），导致初始Ru(iii)浓度（C0）从1.39 mg L^-1降低到Ct为0.42 mg L^-1（图2A）。在接下来的步骤（5–30分钟）中，Ct从0.55逐渐增加到0.93 mg L^-1。这种现象可能与LF的结构变化有关，导致金属解吸并随后Ru(iii)重新定位到更适宜的结合位点。所得Weber–Morris曲线表明Ru(iii)从溶液到蛋白质表面的快速传输，通常被描述为边界层扩散和/或外部质量传递（图2B）。随后，观察到吸附容量急剧下降，这可能是由于弱结合的Ru(iii)释放所致。最后，形成的LF–Ru系统在30分钟后达到平衡。计算出的吸附效率（%E）在分析的时间段内范围为29.2%到69.7%（图2C）。结果与零阶动力学曲线相当，显示2分钟时结合的Ru(iii)比例最高，随后是金属的逐渐解吸和吸附效率的下降。经过30分钟的孵育后，吸附效率保持几乎恒定（29.2–35.3%），表明蛋白质可能已经达到了其Ru(iii)结合的平衡状态，可能是由于可结合位点的饱和。在初始复合物浓度为100 mg L^-1的情况下，Ru(iii)与LF的结合是一个快速的一步过程（k0 = 3.14 mg L^-1 min^-1），在2分钟内完成（图2D）。在2–20分钟范围内观察到Ru(iii)的轻微解吸，对应的Ct约为9–11 mg L^-1。观察到的波动可能是由于LF结构的重排以及结合Ru(iii)的重新分布造成的。Weber–Morris模型证实了金属离子在表面上的快速结合（图2E）。结果表明，颗粒内扩散不是关键的限制步骤；因此，最初结合在蛋白质表面的Ru(iii)离子在系统达到平衡之前经历了短暂的重新分布。计算出的吸附效率在整个时间段内相对恒定，范围为30.5%到39.9%，表明在较高初始复合物浓度下LF–Ru复合物的稳定性更高，饱和度更快（图2F）。
3D荧光光谱分析
图3展示了LF和LF–100Ru复合物的3D光谱。所有注册的峰在表3中都有标记。在LF的3D荧光光谱中观察到两个主要峰，分别在λex/λem = 280/330 nm和λex/λem = 225/327 nm处，这些峰可能归因于芳香氨基酸。图3还包括：
(A) LF和(B) 溶解在去离子水中的LF–100Ru复合物（浓度为100 mg L^-1）的3D光谱。表3显示了LF和LF–100Ru复合物（100 mg L^-1）的3D荧光光谱上观察到的峰：
样品
峰1
峰2
λex [nm]
λem [nm]
强度 [a.u.]
λex [nm]
λem [nm]
强度 [a.u.]
bLF
280
329
9634
225
327
6219
bLF–100Ru
280
328
4397
225
324
3006
在LF–Ru复合物形成后，最大发射峰从329 nm略微蓝移至328 nm，从327 nm蓝移至324 nm，这可能是因为芳香氨基酸残基，特别是Trp，暴露于极性溶剂减少，以及它们的微环境转变为更疏水的方式。Trp附近的这种极性变化可能导致蛋白质构象更加紧凑和稳定。在λex/λem = 265/531 nm处出现的额外峰归因于石英比色皿（图S2）。尽管如此，从6219 a.u.降至3006 a.u.的明显荧光淬灭证实了Ru(iii)与bLF的结合。从下一小节中的Stern–Volmer实验获得了关于荧光团和淬灭剂之间相互作用的更详细见解。LF-Ru淬火机制的分析
在广泛的Ru(iii)配合物（淬火剂）浓度范围内，检测了LF荧光强度的变化。将Ru(iii)配合物加入LF溶液中会导致蛋白质荧光强度的有效降低（图4A）。图4：
(A) 在钌配合物存在下的荧光淬火Stern-Volmer图，(B) 选定的Ru(iii)配合物浓度区域的放大图像，(C) 在298 K下分析的LF-Ru系统的双Stern-Volmer荧光淬火图，以及(D) 相应的log c（Ru配合物）范围的放大图像。通过应用Stern-Volmer方程(1)分析淬火机制：
F0/F = 1 + KSV[Q] = 1 + Kqτ0[Q]
其中F和F0分别表示加入淬火剂前后LF的荧光强度，KSV是Stern-Volmer常数（M^-1），[Q]是淬火剂的浓度（M），Kq是淬火速率常数（M^-1），τ0是未加入淬火剂时荧光团的荧光时间，通常等于10^-8秒。荧光强度的明显降低证实了Ru(iii)与bLF的结合。根据Stern-Volmer图，在低Ru(iii)浓度下（最高0.2 mM），观察到线性关系（R2 = 0.9895），这对应于金属与蛋白质的摩尔比为16:1。在所述的浓度范围内，确定的KSV为（2.044 ± 0.094）× 10^4 M^-1，表明荧光团对淬火剂分子的高度可用性。例如，人类转铁蛋白（hTF）和五氯钌(iii)配合物（带有双齿咔唑-吡啶羧酸配体）系统的计算KSV为1.09 × 10^5 M^-1。如图所示，当金属浓度较高时，曲线呈上升趋势。Stern-Volmer曲线的正曲率可能可以用淬火效应的复杂性来解释。一般来说，荧光淬火可以被描述为动态机制或静态机制。动态淬火的特点是生物分子与处于激发状态的淬火剂分子之间的碰撞相互作用，而静态机制则涉及形成非荧光的基态复合物。静态淬火现象通常在淬火剂浓度较高时观察到。因此，我们可以推测在[Q] ≥ 0.2 mM时形成荧光团-淬火剂复合物，而在较低浓度下发生碰撞。因此，得到的曲线反映了动态和静态荧光淬火机制的结合。此外，计算得到的Kq为2.044 × 10^12 M^-1，远高于动态淬火的Kq最大值。为了更准确地确定淬火机制，应将其与温度相关联。此外，正曲率也可能与荧光团对淬火剂的可及性不等有关。实际上，bLF分子含有13个Trp残基，每个残基可能与Ru(iii)配合物的结合程度不同。
为了更详细地分析LF-Ru结合机制，应用了双对数方程(2)并设计了相应的图表（图4C）：
log[(F0 − F)/F] = log Ka + n log[Q]
其中Ka是结合常数，n是结合位点的数量。LF-Ru结合的双对数图显示出良好的线性关系（R2 = 0.9958）（图4D）。计算得到的Ka为（1.789 ± 0.0002）× 10^4 M^-1，n为0.998 ± 0.029，表明LF-Ru系统中的相互作用较强。在测试条件下，这一结果最好解释为一种主导的荧光报告结合事件，而不是确凿证据表明LF分子中只存在一个Ru结合位点。之前也有类似的研究报告了LF-没食子酸系统（T = 298 K）的结合参数，其中确定的Ka为1.17 × 10^4 M^-1，n为1.08。同样，Yan等人在298 K下报告了LF-人参皂苷（LF-Re）系统的Ka和n值分别为（1.190 ± 0.012）× 10^4 M^-1和1.27 ± 0.02。
3.5. LF和LF-Ru流体力学尺寸及ζ电位的变化
DLS结果显示，LF的尺寸根据所用介质和金属复合物的存在而发生显著变化（图5A）。图5：
(A) LF和LF-100Ru复合物的粒径分布以及(B) ζ电位。在pH 4的LF情况下，观察到了7.5 nm和43.8 nm的小颗粒以及5560 nm的大聚集体；然而，与分散在水中的LF相比，它们的贡献要小得多。值得注意的是，LF与钌复合物结合后，其流体力学直径显著减小。24.3 nm处的单个尖锐峰表明形成了单分散系统。基于此，可以推测钌可能参与了LF结构的稳定，防止了蛋白质的聚集。这一推测也通过ζ电位测量得到了证实。在所有分析的样品中，都在设定的条件下显示出正ζ电位（图5B）。正如预期的那样，分散在水中的LF形成了最不稳定的胶体系统（ζ = 9.3 ± 0.5 mV），因为该介质的pH值（pH 7）接近蛋白质的等电点（pI）。之前，Pryshchepa等人指出bLF的pI约为7.4 ± 0.2。相比之下，pH 4下溶解的LF显示出更正的电位；因此其ζ电位为ζ = 11.6 ± 0.8 mV。同样，Bokkhim等人表明，pH 4下的天然LF的ζ值为+18，在pH 7时降低到+10 mV。更酸性的介质通常促进氨基（–NH2） functional groups的质子化，导致ζ电位增加。ζ电位高于+20 mV或低于-20 mV的样品被认为是稳定的。无论是分散在水中的LF还是乙酸缓冲液中的LF样品，都形成了相当不稳定的胶体。加入Ru(iii)复合物显著影响了LF的电荷性质。实际上，LF-Ru在所有分析的样品中显示了最高的ζ电位（ζ = 23.8 ± 0.8 mV），从而形成了最稳定的胶体系统。ζ电位的明显增加可能与Ru(iii)结合后LF结构的构象变化有关，这导致了正电荷氨基酸（如赖氨酸、精氨酸和组氨酸）的表面可及性提高。此外，Ru(iii)可能还参与了与羧基（–COO−）的相互作用，中和了LF分子中的负电荷。
3.6. ATR-FTIR分析
进行了ATR-FTIR分析，以识别参与与金属离子结合的蛋白质功能基团。此外，观察到的酰胺带的变化提供了LF二级结构变化的信息。LF及其相应LF-Ru复合物的ATR-FTIR光谱显示在图6中。图6：
LF和LF-Ru复合物的ATR-FTIR光谱。随着结合的Ru(iii)数量的增加，LF中特征性的酰胺A带在3300–3100 cm^-1范围内发生蓝移。这些变化表明结合的Ru(iii)可能会影响多肽主链中氢键的强度。同样，在3100–3050 cm^-1范围内观察到的峰归因于N–H（酰胺B带）的伸缩振动。与酰胺A类似，其波长也从3061 cm^-1蓝移到了3065 cm^-1。在2965–2960、2925–2920和2875–2870 cm^-1范围内观察到的特征带可能分别归因于不对称–CH3、不对称–CH2和对称–CH2的伸缩振动。
1700–1600 cm^-1范围是酰胺I带的特征范围，通常用于确定蛋白质中的二级结构含量，因为它受氨基酸侧链振动的影响较小，与酰胺II和酰胺III相比。它主要对应于CO（80%）与C–N（20%）基团在肽主链中的伸缩振动，其峰位置可能因二级结构类型的不同而不同，例如β-折叠（1640–1610 cm^-1）、随机卷曲（1650–1640 cm^-1）、α-螺旋（1660–1650 cm^-1）或β-转角（1690–1660 cm^-1）。通过解卷积酰胺I带，我们能够区分每种二级结构的贡献（图7）。事实上，β-折叠（50.3%）是bLF中主要的二级结构类型，其次是β-转角（37.3%）、α-螺旋/随机卷曲（11.1%）和聚集的β-折叠（1.3%）（图8）。图8：
Ru(iii)修饰后LF的二级结构组成变化。Ru(iii)复合后α-螺旋含量的显著增加表明蛋白质采取了更稳定和有序的构象，特别是在LF-100Ru样品中，这与我们的荧光结果一致。Chen等人之前也观察到了类似的趋势，即LF与乳糖的复合。另一方面，Alhazmi等人报告称，金属离子（如Fe(ii)、Ir(iii)和Pt(iv)与BSA的结合导致α-螺旋含量显著降低。还指出，α-螺旋含量的降低导致AgNP在BSA上的固定。有趣的是，Hadden等人报告了铁不饱和和饱和hLF的二级结构存在微小差异。LF-1.25Ru和LF-100Ru的α-/β-结构比的轻微变化表明了构象重排依赖于结合的金属量。此外，在LF-500Ru复合物中观察到α-螺旋的丢失，同时随机卷曲结构增加。因此，我们可以假设过量的Ru(iii)可能对蛋白质的稳定性产生负面影响，导致其部分展开。酰胺II带在1580–1490 cm^-1处观察到，可以归因于N–H弯曲与C–N伸缩振动。在LF-1.25Ru、LF-100Ru和LF-500Ru中分别观察到从1517 cm^-1到1526 cm^-1和从1517 cm^-1到1515 cm^-1的蓝移和红移，证实了与Ru(iii)复合引起的LF构象变化。尽管该区域特征于β-折叠结构，但它也可能与酪氨酸C–C环的伸缩振动重叠。同样，在1240–1230 cm^-1和1165–1160 cm^-1范围内也观察到了峰位移，这些也是酪氨酸侧链的特征。基于此，我们可以推测酪氨酸可能参与了与Ru(iii)的结合。在1450–1440 cm^-1和1400–1380 cm^-1处观察到的峰可能分别来源于氨基酸侧链的–CH3不对称和对称弯曲振动。尽管如此，1400–1380 cm^-1的范围可能归因于天冬氨酸侧链的振动。因此，LF-1.25Ru和LF-100Ru的吸收带从1389 cm^-1到1395 cm^-1的蓝移可能是Ru(iii)与天冬氨酸羧基相互作用的结果。酰胺III带的特征区域在1350–1200 cm^-1，主要包括N–H弯曲和C–N伸缩振动。在1310–1305 cm^-1和1240–1230 cm^-1处观察到的峰分别确认了LF和LF-Ru样品中α-螺旋和β-折叠结构的存在。1200–950 cm^-1范围被认为是碳水化合物的特征区域，出现的峰可能归因于LF作为糖基化蛋白质的碳水化合物残基（C–O、C–C伸缩和C–O–H变形振动）。Ru(iii)复合后该区域的峰位移可能是由于糖链的可及性差异导致LF构象变化所致。此外，在1054 cm^-1处观察到的峰可能归因于色氨酸侧链（CC或C–N伸缩和C–H弯曲振动）。
3.7. 同步辐射圆二色性（SRCD）
使用以下技术研究了Ru(iii)结合对bLF二级结构变化的影响。应用BestSel算法可以从理论模型计算出二级结构含量。表4展示了理论结构和实验数据所得结果的比较，而SRCD光谱显示在图9中。图9展示了分析样品的SRCD光谱（黑色代表天然LF，红色代表LF–1.25Ru，蓝色代表LF–100Ru）。表4还比较了实验数据和理论数据之间的二级结构内容。
二级结构类型
理论
实验
1BLF
4OQO
1
2
3
4
5
LF
LF–1.25Ru
LF–100Ru
α-螺旋
规则螺旋1
17.4
17.8
17.4
17.4
17.9
17.4
17.4
16.1
16.7
17.3
扭曲螺旋2
12.2
12.1
12.2
11.4
12.2
12.2
0.0
0.0
0.0
反平行β-折叠
反1左旋
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
反2松弛
1.7
1.2
1.9
1.9
1.2
1.2
1.7
23.7
25.8
24.3
反3右旋
10.4
10.7
10.6
9.4
10.6
10.6
10.3
1.6
2.6
1.9
平行β-折叠
5.5
6.0
4.9
5.4
5.3
5.3
5.3
0.0
0.0
0.0
β-转角
18.3
15.6
18.7
17.4
17.5
17.5
17.5
17.5
13.3
11.1
12.4
其他（随机卷曲）
34.5
36.6
34.3
36.6
35.8
35.8
35.6
31.3
30.2
这项分析使用了BestSel算法，其中1 = glide_His253_holo_1BLF，2 = glide_His595_apo_4OQO，3 = glide_His595_holo_1BLF，4 = metaldock_His253_holo_1BLF，5 = metaldock_His595_apo_4OQO。基于晶体结构计算的apo型和holo型的二级结构元素内容仅有微小差异。同样，晶体结构的叠加表明铁离子并没有导致bLF的空间组织发生显著变化（图10）。图10展示了分析的晶体结构和与对接的钌离子的模型的空间结构比较（A – 1BLF，B – 4OQO，C – glide_His253_holo_1BLF，D – glide_His595_apo_4OQO，E – metaldock_His595_holo_1BLF，F – metaldock_His595_apo_4OQO）。接下来，对与Ru(iii)对接的模型进行了分析。金属离子没有引起LF结构的变化。观察到LF的晶体结构和实验结构的二级结构内容存在差异，这可能是由于LF的高灵活性（随机卷曲含量超过30%）。另一方面，实验数据表明，随着Ru(iii)浓度的增加，金属络合并没有引起LF二级结构的显著变化。这种行为表明Ru(iii)以稳定的方式与LF分子结合，而不会干扰其二级结构。结果显示，β-结构是所有分析样品中主要的二级结构，其含量在38%到42%之间。LF–1.25和LF–100Ru样品的β-结构百分比与FTIR结果相当；然而，个别结构的含量有所不同。值得注意的是，Ru(iii)与LF的络合仅导致α-螺旋含量的轻微增加，这与之前的FTIR酰胺I带反卷积结果不一致。FTIR和SRCD分析得到的二级结构内容的差异可以归因于每种技术的特定敏感性和固有局限性。如前所述，CD光谱法被认为是量化α-螺旋结构的更可靠方法，而FTIR光谱法通常对β-折叠结构更敏感。例如，某些氨基酸侧链，特别是天冬氨酸和谷氨酸，可能会对酰胺I区域（1700–1600 cm−1）的肽键振动有轻微贡献，从而可能影响FTIR带的归属。另一方面，CD分析的一个主要限制是肽主链信号与芳香族和含硫氨基酸侧链的贡献之间的光谱重叠。因此，一些作者建议在178 nm以下的波长进行CD测量，以最小化这种干扰并提高二级结构的区分度。
3.8. 小角X射线散射（SAXS）是一种研究溶液中蛋白质结构和寡聚化的强大方法，能够计算晶体结构或理论结构的结构参数。分析模型和实验数据的结构参数分别总结在表5和表6中。表5展示了与对接钌离子的晶体结构的结构参数比较，其中1 = glide_His253_holo_1BLF，2 = glide_His595_apo_4OQO，3 = glide_His595_holo_1BLF，4 = metaldock_His253_holo_1BLF，5 = metaldock_His595_apo_4OQO。
结构参数
1BLF
4OQO
1
2
3
4
5
Rg [nm]
3.65
3.68
3.66
3.65
3.65
3.65
3.65
3.65
Dmax [nm]
9.88
10.3
10.2
9.95
9.96
9.96
9.96
体积 [ų]
1.2149 × 10⁵
1.2386 × 10⁵
1.2517 × 10⁵
1.2517 × 10⁵
1.2517 × 10⁵
1.2517 × 10⁵
1.2517 × 10⁵
表6展示了LF和LF–Ru复合物的SAXS数据收集和结构参数。
3.9. 显微镜研究
3.9.1. 扫描电子显微镜（LM）和能谱仪电子衍射（SEM-EDS）
根据LM图像，LF的结构由大的不规则板块构成（图12A）。另一方面，LF–Ru复合物的表面变得更加破碎和颗粒化，导致冻干（图12D、G和J）。此外，随着金属浓度的增加，LF–Ru复合物的颜色也发生了特征性变化（图12J）。根据SEM图像，LF表面可以描述为光滑的（图12B）。LF–Ru复合物的结构则以更高的破碎程度和增加的粗糙度为特征（图12E、H和K）。能量分散X射线光谱显示所有分析样品中都含有碳（C）、氮（N）、氧（O）和硫（S），这些都是构成蛋白质结构的关键元素（图12C、F、I和L）。之前确定的LF的C:N:O:S重量比为54:18:24:1.4，这与获得的结果一致。值得注意的是，EDS结果确认LF–500Ru样品中富含钌（Ru）元素，其含量在分析区域为2.48%。此外，在所有分析样品中观察到的少量铁（Fe）含量在0.11–0.18%范围内，这可能是由于LF天然的螯合Fe(iii)离子的能力；因此，未修饰LF的初始铁饱和度为17%。
3.9.2. 扫描电子显微镜（TEM）成像
获得的TEM图像显示，随着结合的Ru(iii)浓度的增加，LF的微观结构发生了显著变化（图13）。所有样品中C含量的显著增加可能与使用了碳网格进行分析有关。观察到LF–1.25Ru样品主要由无定形蛋白质基质组成（图13A–C）。在分析的区域没有检测到钌，这可能是由于其含量低以及EDS在纳米尺度区域上的定量可靠性有限。LF–100Ru中观察到的较暗区域可能对应于局部富钌区域（图13E–G）。在这个阶段，这些观察结果应谨慎解释为Ru异质积累的证据，而不是确认成核中心。与SEM-EDS结果类似，在LF–500Ru样品中检测到Ru（图13L），其含量为0.36%。根据LF–500Ru的TEM图像，存在球形的异质金属纳米颗粒（图13I–K）。颗粒大小在5到10 nm之间。放大区域中可见的晶格条纹与纳米结构的RuO2一致，其测得的层间距离（d-spacing）为3.06 Å。这种d-spacing是金红石型RuO2的特性，对应于（110）平面。
3.10. 解吸研究
根据模拟肠道条件，在3小时内未观察到LF–100Ru有显著的Ru释放；而在没有酶的模拟胃条件下，金属损失在同一时间内不超过1.5%。实际上，Marques等人在pH 2和7.4下孵育LF时也观察到了类似的铁释放趋势。在pH 2下孵育16小时后才注意到明显的金属解吸。此前，Majka等人已经证实了LF铁饱和度对pH条件的高敏感性。因此，在pH 2.1的柠檬酸缓冲液中透析24小时后，bLF中的铁含量下降到约1%。此外，在0.1 M盐酸（pH 1.2）和磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中孵育2小时后，bLF中Fe(iii)的释放量分别占金属总量的约58%和1.1%。基于解吸研究结果，可以假设bLF和Ru(iii)在形成的复合物中具有强的结合亲和力，这与等温线和荧光研究的结果一致。之前，Raimondi等人将低金属解吸与有效不可逆的结合过程联系起来。从实际角度来看，LF–100Ru在生理流体中的高稳定性可能对其潜在的生物可用性有积极影响。
3.11. SDS-PAGE研究
SDS-PAGE结果显示LF和LF–100Ru之间的电泳迁移率有轻微差异。在非还原条件下，LF和LF–100Ru的分子质量分别为80 kDa和77 kDa（图14A）。图 14
(A) 在非还原性条件下(1, 2)和还原性条件下(3, 4)对(1, 3) LF和(2, 4) LF–100Ru复合物进行SDS-PAGE质量分析；(B) 在底物与酶孵育1、2、5、15和30分钟后，对(3, 5、7、9、11) LF和(4, 6、8、10、12) LF–100Ru复合物进行胃蛋白酶消化动力学分析；以及对照样品(1) LF和(2) LF–100Ru。相比之下，在还原性条件下，LF和LF–100Ru的分子大小分别约为90 kDa和89 kDa。先前，在分离天然LF和LF–Fe复合物时也观察到了类似的现象。55作者将不同模式下LF电泳迁移率的变化归因于添加还原剂后生物分子金属结合特性的丧失。此外，在所有样品中，无论是还原性还是非还原性条件下，都观察到了分子量大于150 kDa的高分子量聚集体，这表明它们的结合不是通过二硫键来调节的。107
胃蛋白酶消化动力学的结果证实了样品LF和LF复合物对胃环境的高敏感性（图14B）。值得注意的是，在消化的初始阶段（1分钟），LF–Ru比LF更稳定。然而，在后期阶段（2-30分钟），LF结构对胃蛋白酶的抵抗力更强。先前，Pryshchepa等人观察到样品与酶孵育30分钟后LF和LF–Ag复合物被完全消化。37考虑到对照消化的结果，LF–Ru结构对含有胃蛋白酶的SGF的敏感性明显高于对SGF本身的敏感性。尽管解吸研究结果确认了形成的LF–Ru复合物具有很强的结合亲和力，但在胃条件下LF–Ru的高消化性降低了其向目标部位（肠道）的递送效率。许多先前的研究已经证明了蛋白质水解物作为各种金属离子（包括Fe(ii)、Ca(ii)和Zn(ii)的载体的潜力，从而增强了生物可性和生物利用度。108特定肽对金属的结合亲和力主要受其氨基酸序列、分子量和空间效应的影响。108关于Ru(iii)，几种氨基酸，包括组氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、赖氨酸（Lys）、天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu），被认为是最重要的配体。109,110尽管如此，其他残基，例如酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）和亮氨酸（Leu），也可能成功参与Ru(iii)的结合。因此，可以假设有效的蛋白酶消化不一定导致金属释放，因为Ru(iii)可能仍然与消化过程中生成的肽片段保持配位。相反，蛋白质水解过程中LF一级结构的丢失可能会影响其与特定细胞受体的识别，从而可能减少金属的吸收。111为了保持LF–Ru系统的完整性并促进其在肠道中的可控、定点释放，可能需要应用适当的封装方法。先前，Kilic等人测试了牛血清白蛋白–单宁酸（BSA-TA）微胶囊以提高LF的生物利用度。112所提出的递送系统有效保护LF免受胃环境中的降解，从而实现蛋白质在小肠中的释放。此外，Niu等人表明，封装在果胶基胶体系统中的LF在体外胃消化30分钟后保留了大约47 ± 1.4%的天然结构，与未封装的LF相比，保护程度显著更高。113
3.12. LF–Ru复合物中的分子对接
3.12.1. 配体复合物 – 几何优化和单点计算
使用Schrödinger Suite对[RuCl5(H2O)]2−复合物进行几何优化，得到的Ru–Cl键长在2.27至2.35 Å之间，与报道的实验值一致。114 Ru原子的电静力势（ESP）电荷为+0.92，复合物呈现出接近八面体的几何结构，键角在94–96°之间。作为对比，使用MetalDock工作流程中的ORCA进行的几何优化得到了稍长的Ru–Cl键长（2.34–2.43 Å）和较低的Ru原子电荷（+0.52），这可能是由于所应用的基础集的差异。尽管如此，复合物的几何结构仍然接近八面体，键角在94至98°之间。
3.12.2. 分子对接 – H253位点（全蛋白结构，PDB ID: 1BLF）
使用分子对接研究了Ru(iii)复合物与bLF的潜在结合。在对接之前，从[RuCl5(H2O)]2−复合物中移除了配位的水分子，因为预计它会在水生生物环境中解离。在对接过程中，将DFT优化的[RuCl5]2−复合物视为刚性分子以保持其几何结构（图S3）。使用Glide进行的刚性对接得到的对接分数为−8.708 kcal mol−1，初始的Ru–Nε（His253）距离为3.76 Å。在对组氨酸残基进行局部优化后，这个距离缩短到2.37 Å，表明Ru和His253之间形成了配位键（图15A和B）。氯离子配体与带正电的残基（K210, K301, R121）形成了盐桥，并与Y92、Y192、K210和K301形成了卤素键。Ru中心还与D297相互作用，并与Y92和Y192形成了π–阳离子相互作用，这些作用在天然复合物中已知可以协调Fe3+。配位键保持了八面体的几何结构，键角在88.5–92.7°之间。距离约束对接将Ru–N键缩短到2.26 Å，但显著降低了对接分数（−2.006 kcal mol−1）。同样，诱导契合对接得到的结果不太理想（−4.104 kcal mol−1），Ru–His距离超过了4 Å，表明刚性对接提供了最有利的位置。图15
RF复合体与bLF H253和H595位点的分子对接。(A和B) 使用Glide对接到holo-bLF的H253位点（PDB ID 1BLF）：(A) RF复合体与H253周围残基的相互作用，(B) 与H253的配位键的距离和几何结构（为清晰起见，省略了非共价相互作用）；(C和D) 使用MetalDock对接到holo-bLF的H253位点（PDB ID 1BLF）：(C) RF复合体与H253周围残基的相互作用，(D) 与H253的配位键的距离和几何结构；(E和F) 使用Glide对接到holo-bLF的H595位点（PDB ID 1BLF）：(E) RF复合体与H595周围残基的相互作用，(F) 与H595的配位键的距离和几何结构；(G和H) 使用(G) Glide和(H) MetalDock对接到apo-bLF的H595位点（PDB ID 4OQO）：RF复合体的相互作用和配位键。用浅粉色表示盐桥，用洋红色表示卤素键；π–阳离子相互作用用绿色表示。为了确认对接位置，应用了MetalDock工作流程。得到了一个可比的定向，初始的Ru–Nε距离为2.48 Å，在组氨酸优化后降低到2.61 Å（图15C和D）。估计的结合自由能为−6.83 kcal mol−1，相互作用模式与Glide的结果非常相似，尽管其中一个配位角（78.4°）略微偏离了理想的八面体几何结构。
3.12.3. 分子对接 – H595位点（全蛋白结构，PDB ID: 1BLF）
还评估了在替代的His595位点上的对接。这个区域形成了空间受限的环境，大多数Glide的姿态将复合物定位在His595的Nε原子5–7 Å处。最接近的姿态显示Ru–Nε距离为3.24 Å，对接分数为−2.411 kcal mol−1，表明形成配位键的可能性不大（图15E和F）。同样，MetalDock在该位点上的对接也没有产生稳定的配位几何结构，Ru原子与His595的Nε原子之间的距离约为4 Å。
3.12.4. 分子对接 – H595位点（无蛋白结构，PDB ID: 4OQO）
也使用无蛋白结构的bLF进行了对接。在这种情况下，暴露在溶剂中的C-叶为配体提供了更大的空间可及性，便于配体结合。最佳的Glide姿态显示Ru–Nε距离为2.6 Å，对接分数为−3.803 kcal mol−1，配位键的几何结构角度接近90°（图15G）。MetalDock得到的姿态更加接近，Ru–Nε距离为2.46 Å，估计的结合自由能为−7.02 kcal mol−1。这种配置还通过与其他残基的相互作用得到了进一步的稳定，包括D395（图15H）。
3.13. 分子动力学
进行了经典MD模拟，以阐明[RuCl5]2−复合物与三种牛乳铁蛋白（bLF）结构配置之间的相互作用机制。生产模拟30 ns后得到的平衡结构如图16所示。每个系统的初始配置都是基于分子对接结果确定的，以确保金属复合体在蛋白质结合区域内或附近具有现实的起始 Orientations。在整个模拟过程中，[RuCl5]2−复合物通过与几个氨基酸残基的短程非共价相互作用（包括氢键、卤素接触和范德华力）保持了稳定的结合。在无蛋白结构的bLF系统中，复合体保持在蛋白质表面附近，由周围的水分子形成的良好定义的溶剂化壳层稳定。模拟28 ns后，观察到的最短相互作用距离是Ru原子与Cys335（HB2）之间的3.18 Å，以及Arg349（HE）与复合体的Cl5原子之间的2.06 Å。到30 ns结束时，复合体保持了溶剂化状态，但略微远离蛋白质表面，显示出动态但非解离的行为。对于1BLF–His253配置，金属复合体定位在His253位点附近，与几个残基形成了相对较强且更稳定的相互作用：Lys28–HZ2（2.10 Å）、Arg39–HE（2.15 Å）和Thr35–HG1（2.16 Å）。相比之下，在1BLF–His595配置中，复合体更靠近蛋白质表面稳定，观察到的最短距离是Lys27–HZ2（1.93 Å）和Lys100–HZ1（4.53 Å）。这些观察结果表明，精氨酸和赖氨酸残基在通过短极性接触锚定复合体方面起主导作用，其次是半胱氨酸和苏氨酸残基的贡献。总的来说，这些结果表明，有效的蛋白酶消化不一定会导致金属的释放，因为Ru(iii)可能仍然与消化过程中产生的肽片段保持配位。相反，蛋白质水解过程中LF一级结构的丢失可能会影响其与特定细胞受体的识别，从而可能减少金属的吸收。111为了保持LF–Ru系统的完整性并促进其在肠道中的可控、定点释放，可能需要应用适当的封装方法。先前，Kilic等人测试了牛血清白蛋白–单宁酸（BSA-TA）微胶囊以提高LF的生物利用度。112所提出的递送系统有效保护了LF免受胃环境的降解，从而实现了在小肠中的蛋白质释放。此外，Niu等人表明，封装在果胶基胶体系统中的LF在体外胃消化30分钟后保留了大约47 ± 1.4%的天然结构，与未封装的LF相比，后者仅保留了7 ± 1.1%的天然结构。113
3.12.1 配体复合物的几何优化与单点计算
使用Schrödinger Suite对[RuCl5(H2O)]2−复合物进行几何优化，得到的Ru–Cl键长在2.27至2.35 Å之间，与报道的实验值一致。114 Ru原子的电静力势（ESP）电荷为+0.92，复合物呈现出接近八面体的几何结构，键角在94–96°之间。作为对比，使用ORCA在MetalDock工作流程中进行的几何优化得到了稍长的Ru–Cl键长（2.34–2.43 Å）和较低的Ru原子电荷（+0.52），这可能是由于应用的基础集不同所致。尽管如此，复合物的几何结构仍然接近八面体，键角在94至98°之间。
3.12.2 分子对接 – H253位点（全蛋白结构，PDB ID: 1BLF）
使用分子对接研究了Ru(iii)复合物与bLF的潜在结合。在对接之前，从[RuCl5(H2O)]2−复合物中移除了配位的水分子，因为预计它会在水生生物环境中解离。在对接过程中，将DFT优化的[RuCl5]2−复合物视为刚性分子以保持其几何结构（图S3）。使用Glide进行刚性对接得到的对接分数为−8.708 kcal mol−1，初始的Ru–Nε（His253）距离为3.76 Å。在对组氨酸残基进行局部优化后，这个距离缩短到2.37 Å，表明Ru和His253之间形成了配位键（图15A和B）。氯离子配体与带正电的残基（K210, K301, R121）形成了盐桥，并与Y92、Y192、K210和K301形成了卤素键。Ru中心还与D297相互作用，并与Y92和Y192形成了π–阳离子相互作用，这些作用在天然复合物中已知可以协调Fe3+。配位键保持了八面体的几何结构，键角在88.5–92.7°之间。距离约束对接将Ru–N键缩短到2.26 Å，但显著降低了对接分数（−2.006 kcal mol−1）。同样，诱导契合对接得到的结果也不尽如人意（−4.104 kcal mol−1），Ru–His距离超过了4 Å，表明刚性对接提供了最有利的位置。图15
Ru(iii)复合物与bLF的H253和H595位点的分子对接。(A和B) 使用Glide对接到holo-bLF的H253位点（PDB ID 1BLF）：(A) Ru复合物与H253周围残基的相互作用，(B) 与H253的配位键的距离和几何结构（为清晰起见，省略了非共价相互作用）；(C和D) 使用MetalDock对接到holo-bLF的H253位点（PDB ID 1BLF）：(C) Ru复合物与H253周围残基的相互作用，(D) 与H253的配位键的距离和几何结构；(E和F) 使用Glide对接到holo-bLF的H595位点（PDB ID 1BLF）：(E) Ru复合物与H595周围残基的相互作用，(F) 与H595的配位键的距离和几何结构；(G和H) 使用(G) glide和(H) MetalDock对接到apo-bLF的H595位点（PDB ID 4OQO）：Ru复合物的相互作用和配位键。盐桥用浅粉色表示，卤素键用洋红色表示；π–阳离子相互作用用绿色表示。为了确认对接姿态，应用了MetalDock工作流程。得到了一个可比的定向，初始的Ru–Nε距离为2.48 Å，在组氨酸优化后降低到2.61 Å（图15C和D）。估计的结合自由能为−6.83 kcal mol−1，相互作用模式与Glide的结果非常相似，尽管有一个配位角（78.4°）略微偏离了理想的八面体几何结构。
3.12.3 分子对接 – H595位点（全蛋白结构，PDB ID: 1BLF）
也评估了在替代的His595位点上的对接。这个区域形成了空间受限的环境，大多数Glide的姿态将复合物定位在His595的Nε原子5–7 Å处。最接近的姿态显示Ru–Nε距离为3.24 Å，对接分数为−2.411 kcal mol−1，表明形成配位键的可能性不大（图15E和F）。同样，MetalDock在这个位点上的对接也未能产生稳定的配位几何结构，Ru原子与His595的Nε原子之间的距离约为4 Å。
3.12.4 分子对接 – H595位点（无蛋白结构，PDB ID: 4OQO）
也使用无蛋白结构的bLF进行了对接。在这种情况下，溶剂暴露的C-叶为配体在His595周围提供了更大的空间可及性，便于配体结合。最佳的Glide姿态显示Ru–Nε距离为2.6 Å，对接分数为−3.803 kcal mol−1，配位键的几何结构角度接近90°（图15G）。MetalDock得到的姿态更加接近，Ru–Nε距离为2.46 Å，估计的结合自由能为−7.02 kcal mol−1。这种配置还通过与其他残基的相互作用得到了进一步的稳定，包括D395（图15H）。
3.13 分子动力学
进行了经典MD模拟，以阐明[RuCl5]2−复合物与三种牛乳铁蛋白（bLF）结构配置之间的相互作用机制。生产模拟30 ns后得到的平衡结构如图16LF和LF–100Ru的抗菌活性
LF和LF–100Ru对所选细菌菌株（即大肠杆菌ATCC 33876、粪肠球菌ATCC 51299和肺炎克雷伯菌B34）的生长影响能力，在312.5–10000 mg L−1的广泛浓度范围内进行了评估，使用的是基于连苯三嗪的测定方法。该浓度范围对应于LF–100Ru中的3.30–105.4 mg L−1的钌（Ru）含量。根据获得的结果，LF和LF–100Ru复合物均影响了分析的细菌菌株的存活率（图17）。观察到随着蛋白质浓度的增加，大肠杆菌的存活率显著下降，从92%降至8%。先前，Biernbaum等人确定纯LF和牛乳中发现的原始LF对大肠杆菌的最低抑制浓度（MIC）分别为3500 mg L−1和14000 mg L−1。此外，还指出LF–Zn和LF–Cu复合物对大肠杆菌的抗菌活性高于天然LF和apo-LF。作者假设金属修饰的LF复合物具有更强的抗菌潜力，这可能与它们与细菌细胞表面的相互作用有关，从而导致其损伤（杀菌效果）。另一方面，LF–Mn复合物对大肠杆菌表现出中等的抗菌活性，效果低于天然LF和apo-LF，但高于holo-LF。apo-LF的增强活性可归因于其抗菌机制，即通过铁的螯合作用进而抑制细菌生长。根据我们的结果，使用最高浓度的LF–100Ru处理后，大肠杆菌的存活率下降到仅64%。因此，我们可以假设与LF结合的Ru(iii)可能由于金属离子占据铁结合位点或与细菌细胞膜的相互作用较弱，从而对蛋白质的抑制活性产生负面影响。观察到补充LF促进了粪肠球菌的生长；因此，其存活率与蛋白质浓度呈正相关，在10000 mg L−1的LF浓度下增加了两倍。对于LF–100Ru，粪肠球菌的存活率根据所用的复合物浓度不同而介于50%到107%之间。值得注意的是，LF–100Ru在2500 mg L−1的浓度下显示出最高的抑制潜力。先前已经证实，粪肠球菌株对LF具有高度抗性，蛋白质的补充可能会促进细菌生长。Garbe等人解释这种现象是由于粪肠球菌能够利用LF结构中的糖胺聚糖作为营养物质。相比之下，Milanowski等人指出LF–Ag对粪肠球菌的MIC为1250 mg L−1，这可能与形成了具有高抗菌效率的纳米复合物有关。先前的研究表明，基于钌的复合物对革兰氏阳性菌种的抗菌效果明显优于革兰氏阴性菌。例如，钌的掺入显著增强了壳聚糖复合材料对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。实际上，没有观察到LF对肺炎克雷伯菌有显著的抗菌效果，其存活率在整个浓度范围内保持相对稳定。另一方面，在10000 mg L−1的LF–100Ru处理下，细菌存活率降低到78%。值得注意的是，Murata等人报告称，在8000 mg L−1的LF浓度下，LF抑制了肺炎克雷伯菌的生长。相比之下，Kutila等人报告称LF的抗菌活性对不同菌株具有依赖性。值得注意的是，所测试的浓度范围主要用于评估生物相容性和相互作用趋势，而不是治疗性的抗菌效果。例如，常用的合成抗生素埃拉维霉素（eravacycline）对临床分离的大肠杆菌、粪肠球菌和肺炎克雷伯菌的MIC值分别为0.5、0.25和2 mg L−1。此外，一系列卡宾–Ru(ii)复合物对大肠杆菌的MIC范围为800至1000 mg L−1，而氨苄西林的MIC为3.12 mg L−1。总体而言，这些发现表明Ru(iii)的配位以菌株依赖的方式改变了LF的生物反应。
（A）LF和（B）LF–100Ru复合物处理后细菌存活率的变化 ± 标准差。关于获得的消化结果，值得注意的是，从LF衍生的肽类，包括LF1-11、乳铁蛋白和乳铁蛋白精氨酸肽（lactoferrampin），表现出强烈的抗菌活性，可能比完整的LF更有效。据报道，LF和乳铁蛋白对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为500 mg L−1和8 mg L−1。这些N末端肽具有高度碱性（pI约9.7–11.7），与带负电荷的脂多糖（LPS）强烈相互作用，导致膜不稳定并随后损伤细菌。解吸研究结果证实了Ru(iii)与蛋白质的强结合；因此，可以假设与LF片段结合的Ru(iii)可能影响它们的局部电荷分布，从而调节肽-膜相互作用的强度。尽管如此，先前的结构建模和MIC研究表明，乳铁蛋白中β链两侧的阳离子残基的相对位置以及它们相对于疏水性色氨酸残基的方向决定了膜相互作用的效率和破坏程度。另一方面，Tomita等人报告称，添加铁（0.1 M FeSO4）对胃蛋白酶衍生的LF肽对大肠杆菌的抗菌活性没有影响，这证实了它们的铁独立（杀菌）作用机制，与完整的LF不同。相比之下，浓度高于0.1 M的钙和镁离子通过干扰肽-膜相互作用显著降低了乳铁蛋白的活性。由于本研究没有直接探讨与Ru(iii)在肽水平上的相互作用，这一方面仍然不清楚，可能是未来研究的有趣方向。
3.15 LF–Ru复合物的细胞毒性及其对细胞存活率的影响
为了评估在四种不同浓度（625、1250、2500和5000 mg L−1）下三种LF–Ru复合物对细胞存活率和膜完整性的影响，使用了L929成纤维细胞、HepG2肝细胞和Caco-2肠上皮细胞进行了两项互补的测定。MTT和LDH测定用于评估细胞对LF–Ru处理的生物反应。MTT测定（图18A–C）通过评估代谢活性来指示细胞存活率，而LDH测定（图19A–C）通过测量膜完整性来提供关于潜在细胞毒性的补充信息。相应LF–Ru复合物中计算出的钌浓度显示在表7中。
（A）L929成纤维细胞、（B）HepG2细胞和（C）Caco-2细胞在48小时与LF、LF–1.25Ru、LF–100Ru和LF–500Ru共培养后的存活率，与未处理细胞（定义为100%）进行了比较。结果以五个独立重复实验的平均值 ± 标准偏差（SEM）表示。统计显著性表示为：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。与LF对照组的比较用星号表示（# p < 0.05，## p < 0.01，### p < 0.001）。虚线代表建立的细胞毒性阈值。
（A）L929成纤维细胞、（B）HepG2细胞和（C）Caco-2细胞在48小时暴露于LF、LF–1.25Ru、LF–100Ru和LF–500Ru后的LDH释放量作为膜完整性和细胞毒性的指标，并相对于未处理对照组（设为100%）进行了表达。数据以五个独立实验的平均值 ± 标准偏差（SEM）报告。统计显著性表示如下：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。与LF处理组的比较用星号表示（# p < 0.05，## p < 0.01，### p < 0.001）。细胞毒性阈值用虚线水平线表示。
测试的LF–Ru复合物中的钌浓度
添加的LF–Ru复合物浓度 [mg L−1]
LF–1.25Ru
LF–100Ru
LF–500Ru
钌浓度
Ru [mg L−1]
Ru [µM]
Ru [mg L−1]
Ru [µM]
Ru [mg L−1]
Ru [µM]
5000
0.62
6.12
52.7
521.2
175.8
1739.6
2500
0.31
3.06
26.3
260.6
87.9
869.8
1250
0.15
1.53
13.2
130.3
44.0
434.9
625
0.08
0.77
6.6
65.2
22.0
217.5
对于L929细胞系（图18A），未改良的LF在20000和10000 mg L−1浓度下表现出细胞毒性效应，表现为细胞存活率显著降低至约50%和52%。因此，后续对LF–Ru复合物的研究从5000 mg L−1开始，在该浓度下LF单独仅表现出边缘性的细胞毒性，存活率约为70%。在2500 mg L−1及以下浓度，LF不再表现出毒性效应，并且随着浓度的降低观察到细胞增殖逐渐增加。LF–Ru复合物在大多数条件下对L929细胞没有表现出明显的细胞毒性。然而，在625 mg L−1浓度的LF–100Ru和1250 mg L−1浓度的LF–1.25Ru下观察到细胞存活率下降，分别为72%和74%；这些结果伴随着相对较高的标准偏差。值得注意的是，在5000 mg L−1浓度下，所有三种LF–Ru复合物都显著增强了细胞增殖，这表明Ru的掺入可能减少了高LF浓度的不利影响。L929的LDH测定结果（图19A）证实了高剂量LF的细胞毒性，显示在20000、10000和5000 mg L−1浓度下LDH释放量呈剂量依赖性增加，表明膜损伤和完整性丧失。相比之下，较低的LF浓度（<1250 mg L−1）显示的LDH水平与细胞对照相当。在LF–Ru复合物中，LF–500Ru在所有测试浓度下仅引起最小的LDH释放，这与MTT结果一致。同样，LF–100Ru显示低LDH活性（约11–17%）。LF–1.25Ru在所有测试浓度下一致地增加了LDH释放（约18–25%），因此在分析的配方中显示出最高的膜损伤倾向，尽管总体细胞毒性保持在30%以下。HepG2细胞（图18B）对LF的反应与L929细胞相似。20000、10000和5000 mg L−1的浓度导致存活率显著下降，分别约为25%、54%和61%。相比之下，LF–500Ru在所有测试浓度下对HepG2细胞显示出潜在的促进作用，存活率保持在100%或以上，没有明显的细胞毒性迹象。虽然这些值与细胞对照组没有显著差异，但在5000和2500 mg L−1浓度下观察到相对于LF处理细胞的显著改善，表明有更利的反应特征。LF–100Ru在5000 mg L−1下的细胞毒性与LF相当，存活率约为61%，而较低浓度（625–2500 mg L−1）没有表现出明显的细胞毒性，但接近阈值水平。LF–1.25Ru没有表现出明显的细胞毒性；5000 mg L−1的剂量处于边缘水平，而较低浓度与对照组没有显著差异。HepG2的LDH测定结果（图19B）支持了MTT的发现。LF诱导了强烈的、剂量依赖性的LDH释放增加，在20000 mg L−1时观察到最高的膜损伤，达到约21%。所有三种LF–Ru复合物在625–1250 mg L−1下显示低LDH水平，与良好的细胞耐受性一致。在5000 mg L−1时，LF–500Ru（约29%）、LF–1.25Ru（约25%）和LF–100Ru（约16%）的LDH活性升高。尽管如此，MTT数据表明在LF–500Ru和LF–1.25Ru存在下细胞存活率有所提高，这表明观察到的LDH释放可能反映了短暂的应激反应，而不是典型的细胞溶解效应。
在Caco-2细胞（图18C）中，LF在整个浓度范围内没有表现出细胞毒性活性，突显了其与肠上皮细胞的良好生物相容性。相比之下，LF–500Ru在所有测试浓度（625–5000 mg L−1）下显著降低了存活率，约为34–39%，没有明显的剂量-反应趋势。LF–100Ru仅在5000 mg L−1下表现出细胞毒性，而较低浓度则耐受性良好。LF–1.25Ru在5000–1250 mg L−1的浓度范围内降低了细胞存活率，显示出高细胞毒性（约37–41%）。625 mg L−1的浓度被认为是边缘的，细胞存活率达到75%。有趣的是，Caco-2细胞（图19C）中的LDH测量显示，在所有条件下酶释放水平都很低，无论化合物或浓度如何。LDH值与细胞对照相当，表明膜完整性保持良好，没有急性细胞损伤。这与MTT结果的明显差异——特别是对于LF–500Ru观察到的代谢活性降低——表明其作用机制可能是非细胞溶解性的。数据表明，这些复合物可能具有细胞抑制作用，通过阻止细胞增殖或代谢功能（例如，通过细胞周期停滞或轻度应激诱导）来发挥作用，而不会破坏膜结构或导致细胞坏死。MTT和LDH测定得到的结果为LF及其LF–Ru复合物在不同模型中的细胞反应提供了重要见解。尽管LF在较高浓度下对L929和HepG2细胞表现出细胞毒性作用，但它并未影响Caco-2细胞的存活能力，这与LF与肠道上皮模型的已知兼容性一致。例如，Matsuzaki等人证明了完整的牛LF能够被Caco-2肠细胞主动吸收和释放，而不会损害细胞完整性。Zhao等人也表明，在50–200 mg L−1的浓度范围内，bLF增强了Caco-2细胞的存活能力，并提高了跨上皮电阻（TEER）以及紧密连接蛋白的表达。LF–Ru复合物的表现取决于具体的细胞系和加载量，而不是统一的毒性模式。LF–500Ru在多种条件下增强了HepG2和L929细胞的存活能力，但相同的配方却降低了Caco-2细胞的代谢活性，这表明其反应是依赖于具体情境的。在Caco-2模型中观察到的最有趣的现象是，代谢活性的降低伴随着轻微的LDH释放。这种模式表明其主要作用是非细胞毒性的，更符合细胞抑制或代谢调节的作用，而非急性膜损伤。在本研究中，LF–100Ru被正常L929成纤维细胞相对较好地耐受，而在5000 mg L−1（相当于521.2 µM Ru）的浓度下，HepG2和Caco-2癌细胞的存活能力却降低了。这些发现表明在测试条件下细胞反应存在差异，而不是药理学选择性。作为对比，据报道顺铂在10 µM浓度下可导致约90%的结直肠癌细胞（HT29和SW480）存活能力丧失，而KP1019在50–80 µM浓度下可使细胞存活能力降低约50%（IC50），具体取决于细胞系。同样，一系列Ru(ii)多吡啶复合物和顺铂对HepG2细胞的IC50值分别为17.7–25.3 µM和11.5 µM。值得注意的是，相应的游离配体并未表现出细胞毒性。这些观察结果突显了基于Ru的系统通常在比铂类药物更高的浓度下才表现出生物效应。相比之下，尽管NAMI-A表现出显著的抗转移活性，但在100 µM浓度下它并未降低乳腺腺癌（TS/A）、口腔癌（KB）或黑色素瘤（B16-F10）细胞系的存活能力，其对HT-29细胞的报道IC50为339 µM。因此，本研究的主要目的是评估生物相容性和初步的细胞反应，而不是治疗效果。细胞形态通过倒置相衬显微镜在孵育48小时后进行评估。所有图像见补充信息（SI）。展示了L929成纤维细胞（图S7）、HepG2肝细胞（图S8）和Caco-2上皮细胞（图S9）在暴露于三种LF–Ru复合物（5000和625 mg L−1）及相应对照组后的代表性图像。细胞形态的比较分析与MTT和LDH测定结果一致，进一步验证了所测试化合物的细胞毒性或生物相容性效应。L929成纤维细胞的显微分析显示了典型的纺锤形形态和均匀的黏附性，与健康细胞结构一致。未观察到细胞毒性损伤的迹象。LF–500Ru复合物直接悬浮在培养基中，这解释了其所有显微照片中可见的黑色颗粒物质。HepG2细胞的相衬显微镜观察结果显示的形态与生化测定结果一致。在用LF–500Ru处理的培养物中，两种测试浓度（5000和625 mg L−1）均保持了正常的上皮特征：细胞保持多边形、紧密排列且黏附良好，表明具有良好的细胞相容性。在625 mg L−1时这一点尤为明显，图像未受到复合物颗粒的干扰。在5000 mg L−1的LF–100Ru处理下，细胞显示出可见的形态变化，包括细胞圆化、部分脱离和聚集度降低，这与细胞毒性一致；然而，在625 mg L−1时，大多数细胞仍保持接近正常的形态。对于LF–1.25Ru，在5000 mg L−1浓度下细胞显示出轻微的形态变化，如密度降低和偶尔的圆化，而在625 mg L−1时，单层结构基本保持完整。在5000和625 mg L−1的对照组和LF处理细胞中，Caco-2细胞保持了特征性的鹅卵石状形态和密集的单层结构，表明存活能力高且没有明显的细胞毒性。用LF–Ru复合物处理后的Caco-2细胞的显微评估显示的变化通常与存活能力和LDH结果一致，尽管并非所有生化效应都伴随着明显的结构损伤。尽管MTT测定显示LF–Ru复合物在5000 mg L−1浓度下代谢活性降低，但相衬显微镜仅观察到轻微的形态变化。细胞密度降低，但基本上保持了上皮的鹅卵石状形态，仅有轻微的聚集度降低和局部脱离。这些结果表明代谢活性受到抑制，这一点通过MTT测定得到证实，而整体膜完整性和基本细胞结构相对保持完好，这与这些样本中观察到的低LDH释放一致。
4. 结论
在本研究中，bLF成功修饰了Ru(iii)离子，所得到的LF–Ru系统通过互补的实验和计算方法进行了表征。批量吸附实验显示了类似饱和的结合行为，结合效率介于24.0%至49.6%之间。热力学分析表明LF–Ru的形成是自发且有利的（ΔG < 0）。动力学研究表明，大部分Ru(iii)的吸收在大约2分钟内迅速发生，达到平衡后仅有少量的重新分布。荧光淬灭证实了LF–Ru系统中的强相互作用；然而，n ≈ 1的结果应被解释为一个主要的荧光报告结合事件，而不是证明乳铁蛋白中仅存在一个Ru结合位点。脱附实验显示，在没有酶的情况下，LF–100Ru在SGF和SIF中仅释放出少量Ru，表明该配方在测试条件下的稳定性很高。同时，胃蛋白酶消化显示SGF中完整的LF支架迅速丢失，这表明尽管Ru可能与消化片段结合，但如果没有额外的配方策略，通过受体介导的完整LF–Ru的递送可能会受到限制。ATR-FTIR表明存在依赖于加载量的构象重排，而SRCD和SAXS表明LF的整体二级结构和溶液灵活性基本保持不变。分子对接和MD模拟确定了holo-bLF中的His253是最有利的结合区域，并支持[RuCl5]2−通过极性和卤素介导的接触进行稳定结合。在对简化残基模型的DFT计算中仅用作供体优先级的定性描述符，并不定义折叠LF中的实际配位环境。TEM数据进一步表明，只有在最高加载量（LF–500Ru）下才会产生富含Ru的域和类似RuO2的纳米颗粒，表明这是一种次要的高加载现象，而不是LF–Ru形成的普遍机制。从生物学角度来看，评估了LF和LF–100Ru的抗菌活性，而对LF–100Ru则进行了脱附研究。选定的LF–Ru配方在体外产生了不同的细胞反应：LF–100Ru被L929成纤维细胞相对较好地耐受，但在5000 mg L−1浓度下降低了HepG2和Caco-2细胞的代谢活性，而根据LDH数据，Caco-2的反应主要是非细胞毒性的。总的来说，这些结果表明乳铁蛋白可以作为Ru(iii)的活性协调支架，但最终的生物学结果强烈依赖于Ru的加载量以及系统是否保持在蛋白质结合的复合物状态，或在高前体浓度下继续发生二次Ru积累。
作者贡献
手稿的撰写是所有作者共同努力的结果。T. D.-T.负责研究的构思和设计，进行了实验并分析了数据；M. E.和K. R.参与了体外实验和相应的数据分析；P. P.参与了研究设计并在研究过程中提供了指导；G. T.参与了LM、SEM-EDS和TEM-EDS分析及相应的数据分析；K. S.、O. P.和Ł. S.参与了SAXS和SRCD测量及相应的数据分析；R. v. E.协助了手稿的修订；K. M.、W. G.和A. K.参与了分子对接实验及相应的数据分析；R. S.和P. K. J.参与了MD和DFT研究及相应的数据分析。T. D.-T.和P. P.起草了手稿，所有作者都参与了讨论和修订。所有作者均同意最终版本的手稿。
利益冲突
不存在需要声明的利益冲突。
数据可用性
支持本研究的所有数据都包含在正文和补充信息（SI）中。补充信息文件包含了关于Ru(III)与乳铁蛋白结合的等温线和动力学分析的额外细节、补充的3D荧光光谱、MD和DFT研究的分子建模结果，以及与细胞毒性和细胞存活能力相关的额外细胞成像数据。补充信息可获取。详情请参见DOI: https://doi.org/10.1039/d6qi00255b。
致谢
本研究得到了波兰华沙国家研究中心资助的LIDER项目“开发分离生物活性乳铁蛋白的制备方法”（项目编号LIDER13/0292/2022）的财政支持。Tetiana Dyrda-Terniuk是“细胞作为实验平台和bioFACTories（CExFact）”新兴领域的成员，而Paweł Pomastowski是“朝向个性化医疗”的托伦卓越中心（位于卓越倡议下的研究型大学）的成员。我们感谢汉堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）的SAXS光束线P12（位于PETRA III储存环），并感谢丹麦奥胡斯大学物理与天文学系的ASTRID2光束线的使用。
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