摘要：由于某些全氟和多氟烷基物质（PFAS）具有高持久性和对人类健康的不良影响，其使用受到了限制。因此，尽管许多这类化合物的毒理学数据仍然有限或缺失，但新型PFAS正越来越多地被引入工业应用中。本研究探讨了新型PFAS的分子作用机制，重点关注具有线性或分支结构以及羧酸或磺酸官能团的单醚和多醚PFAS。将分化后的HepaRG细胞（一种人类肝细胞模型）暴露于三种非细胞毒性浓度的不同PFAS同系物中，持续24小时。随后分离总RNA并进行全转录组分析。该研究为总共33种PFAS同系物提供了转录组数据，其中13种是首次获得相关数据。对于大多数PFAS，差异表达基因（DEG）的数量随浓度增加而增加；而五种PFAS即使在最高测试浓度下也仅引起轻微的转录变化。Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析显示，所有33种PFAS在HepaRG细胞中引发了相似的转录反应，表明尽管这些PFAS同系物在结构上存在显著差异，但它们的分子效应具有共性。所测试的PFAS一致激活了与脂肪酸和脂质代谢相关的经典通路，这些通路主要由核受体PPARα调控，并且还影响了与外源性物质代谢相关的通路，部分通路与PXR和CAR信号通路相关。此外，几种PFAS抑制了胆固醇和胆汁酸的生物合成途径。IPA进一步预测了这些PFAS对肝细胞相关上游调节因子（如HNF4A、HNF1A和FOXA2）的影响。
引言：全氟和多氟烷基物质（PFAS）是一大类化学品，用于制造多种工业和消费品，例如炊具、纸张和纺织品上的防水防污涂层（Gluge等人，2020年）。由于其极高的化学稳定性，许多PFAS能够抵抗化学或生物降解，因此在环境中持续存在（Cousins等人，2020年）。人类主要通过受污染的水、食物和空气接触这些物质。动物和流行病学研究表明，许多PFAS与免疫系统、内分泌系统和肝脏的不良影响有关（EFSA，2020年；ATSDR，2021年）。然而，PFAS毒性的潜在分子机制尚未完全明了。对于肝脏相关的影响，过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）的激活是许多PFAS的已知分子靶点，该受体参与脂质代谢（Behr等人，2020b年；Bjork和Wallace，2009年；Wolf等人，2008年、2012年）。此外，已有报道指出，一些PFAS会影响由孕烷X受体（PXR）和构型雄烷受体（CAR）调控的外源性物质代谢通路（Rosen等人，2017年）。由于PFAS的高持久性和不良健康影响，包括两种最著名的传统PFAS——全氟辛酸（PFOA）和全氟辛烷磺酸（PFOS）在内的多种PFAS的使用已在国际和地区监管框架下受到限制，例如《斯德哥尔摩持久性有机污染物公约》（Stockholm Convention，https://chm.pops.int/Home/tabid/10001/Default.aspx）和欧盟持久性有机污染物法规（EU 2019/1021；EU 2020/784），以及更广泛的REACH框架和相关限制措施（EU 2017/1000）。因此，工业界开发了许多替代PFAS用于工业应用。其中，许多（多）醚PFAS被引入作为PFOA和PFOS等化合物的替代品。在这些物质中，全氟碳骨架被一个或多个醚氧原子打断，使其在结构上不同于经典的全氟烷基羧酸（PFCA）或全氟烷基磺酸（PFSA）同系物。与已充分研究的传统PFAS相比，许多新型化合物的毒理学信息仍然有限或缺失。为了比较PFAS在人类肝细胞中的分子效应，我们对暴露于33种PFAS同系物（包括15种PFCA/PFSA同系物和18种全氟烷基醚羧酸（PFECA）或全氟烷基醚磺酸（PFESA）同系物）的分化HepaRG细胞进行了转录组分析。HepaRG细胞系是一种成熟的人类肝脏体外模型，分化后的HepaRG细胞由类似肝细胞和胆管细胞的细胞组成，其中类似肝细胞的细胞在形态和生化特征上与原代人类肝细胞非常接近（Antherieu等人，2010年；Rogue等人，2012年）。转录组分析显示，所有33种PFAS引发了相似的反应模式，包括对脂肪酸代谢（与PPARα相关）和外源性物质代谢（包括与PXR相关的信号通路）的一致影响。仅有一部分PFAS在接近细胞毒性阈值的浓度下观察到与胆固醇和胆汁酸代谢、氨基酸代谢和有丝分裂相关的额外变化。
材料与方法：
化学品：33种PFAS同系物均以最高纯度购买。11-氯二十氟-3-氧十一烷-1-磺酸钾盐（8:2 Cl-PFESA）从eNovation Chemicals（美国格林布鲁克）购买；2,3,3,3-四氟-2-[1,1,2,3,3,3-六氟-2-(三氟甲氧基)丙氧基]-丙酸（Branched ADONA）、甲基全氟-3,6,9-三氧十二烷酸酯（CH3-PFO3TriDA）、全氟庚烷磺酸（PFHpS）、全氟-3,6-二氧十二烷酸（PFO2DA）、全氟-3,6-二氧庚烷酸（PFO2HpA）、全氟-3,6,9-三氧十二烷酸（PFO3DA）、全氟-3,6,9-三氧十二烷酸（PFO3TriDA）、铵2-全氟戊氧基-2,3,3,3-四氟丙酸酯（PFoxaOA）、全氟戊烷磺酸（PFPeS）和全氟(4-甲基-3,6-二氧辛烷)磺酸钾盐（类似于Nafion-BP2）从Apollo Scientific（英国曼彻斯特）购买；2,3,3,3-四氟-2-(七氟丙氧基)丙酸（HFPO-DA）、2,3,3,3-四氟-2-(1,1,2,3,3,3-六氟-2-(全氟丙氧基)丙氧基)丙酸（HFPO-TA）、全氟-2,5,8-三甲基-3,6,9-三氧十二烷酸（HFPO-TeA）、1-(三氟乙烯氧基)-2-(2-磺基四氟乙氧基)六氟丙烷（Nafion BP1）、7H-全氟-4-甲基-3,6-二氧辛烷磺酸（Nafion-BP2）、全氟-(3-氧戊烷-1-磺酸）（PF2EOESA）、全氟-3-甲氧基丙酸（PFMOPrA）和全氟-4-甲氧基丁酸（PFMOBA）从SynQuest Laboratories（美国阿拉楚阿）购买；铵全氟辛酸（PFOA-NH4）、全氟丁酸（PFBA）、全氟丁烷磺酸（PFBS）、全氟癸酸（PFDA）、全氟庚烷酸（PFHpA）、十一氟己酸（PFHxA）、全氟己烷磺酸钾盐（PFHxS）、全氟壬酸（PFNA）、全氟辛酸（PFOA）、全氟辛烷磺酸钾盐（PFOS）、全氟戊酸（PFPeA）、五氟丙酸（PFPrA）和全氟十一烷酸（PFUnA）从Sigma-Aldrich（德国陶夫基兴）购买；2,2-二氟-2-(三氟甲氧基)乙酸（PFMOAA）从Enamine（德国美因河畔法兰克福）购买。这些PFAS同系物的结构及其CAS编号见补充表1。据报道，某些PFECA同系物（如HFPO-DA）在异丙醇中稳定，但在极性非质子溶剂（如DMSO）中不稳定（Zhang等人，2022年）。因此，选择异丙醇作为制备不同PFAS同系物0.5 M储备溶液的标准溶剂。然而，有33种PFAS同系物中有4种在异丙醇中的溶解度不足，因此分别为类似Nafion-BP2（0.1 M异丙醇）、PFHxS和PFOS（0.5 M DMSO）以及8:2 Cl-PFESA（0.05 M DMSO）制备了不同的储备溶液。
细胞培养：HepaRG细胞从Biopredic International（法国圣格雷瓜尔）购买，并按照制造商的方案进行培养。HepaRG细胞在含有酚红（P04-29150，PAN Biotech，德国艾登巴赫）的William’s E培养基中接种并培养28天，培养基中添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS，P40-47100，批号P131102，PAN Biotech）、5 µg/mL胰岛素（PAN Biotech）、50 µM氢化可的松半琥珀酸盐（Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴）、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素（Capricorn Scientific，德国埃布斯多夫格伦德），培养条件为37°C，培养环境中有5%的二氧化碳。为了诱导细胞分化，在第14天和第15天向培养基中添加1%（v/v）二甲基亚砜（DMSO），从第16天到第28天添加1.7%（v/v）DMSO。在28天的培养期间，每2-3天更换一次培养基。随后，根据Klein等人（2014年）的描述，将分化后的HepaRG细胞在无血清培养基中培养两天，该培养基由不含酚红的William’s E培养基（P04-29510S1，PAN Biotech，德国艾登巴赫）、5 µg/mL胰岛素、50 µM氢化可的松半琥珀酸盐、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素、0.5%（v/v）DMSO、1%（v/v）Insulin-Transferrin-Selenium 100x溶液（Capricorn Scientific，德国埃布斯多夫格伦德）、10 ng/mL人肝细胞生长因子（100–39 H，Thermo Fisher Scientific，德国达姆施塔特）、2 ng/mL人表皮生长因子（AF-100-15，Thermo Fisher Scientific，德国达姆施塔特）和1 mg/mL牛血清白蛋白（BSA，CP84，卡尔罗斯，德国）组成。在第30天，将上述储备溶液用无血清培养基稀释至所需浓度，使所有条件下的溶剂变为0.1%异丙醇和0.5% DMSO，然后将细胞暴露于不同的PFAS同系物中24小时。
细胞毒性：通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定法评估了33种PFAS同系物的细胞毒性。HepaRG细胞以每孔9.000个细胞的密度接种在96孔板的内部60孔中。最外层孔填充了100 µL磷酸盐缓冲盐水溶液。HepaRG细胞按照上述30天分化程序进行培养。第30天，移除培养基，并将细胞在无血清培养基中与不同浓度的PFAS共同培养24小时。随后向孔中加入MTT溶液（最终浓度为每孔0.05 mg/mL），在37°C、含5%二氧化碳的湿润环境中培养1小时。之后，将平板以300 × g离心5分钟，然后用130 µL脱附溶液（0.7%十二烷基硫酸钠在异丙醇中）替换培养液。在黑暗中摇动15分钟后（微孔振荡器，600 U/min），使用微孔读数仪（Infinite M Flex，Tecan）在570 nm波长下测量吸光度。进行三次独立生物学重复实验，每次实验有三个技术重复。0.01% Triton-X 100作为阳性对照（PC）。处理细胞的存活率相对于未经处理的阴性（溶剂）对照（SC）进行计算，阴性对照含有0.1%（v/v）异丙醇和0.5% DMSO。
RNA制备：HepaRG细胞以每孔2*10^5个细胞的密度接种在6孔板中。按照上述30天分化程序进行培养。第30天，移除培养基，并将细胞在无血清培养基中与不同浓度的PFAS共同培养24小时。随后在显微镜下观察细胞情况。细胞裂解和总RNA提取按照RNeasy Mini Kit（目录编号74104，Qiagen，荷兰芬洛）的方案进行。进行三次独立生物学重复实验，每次实验有三个技术重复。细胞裂解液和分离出的RNA储存在-80°C。
RNA文库制备和测序：首先使用RNA Assay Kit（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）在Qubit® 4.0荧光计上对RNA样本进行定量。使用Fragment Analyzer和High Sensitivity RNA Analysis Kit（Agilent Technologies，美国圣克拉拉）评估样本完整性。RNA质量基于RNA Quality Number（RQN）进行评估，每个样本的RQN值均高于7。使用SMART-Seq mRNA LP Kit（Takara Bio Inc., 加州圣何塞）进行文库制备。使用3′ SMART-Seq CDS Primer II A从总RNA合成第一链cDNA，并通过SMART-Seq v4 Oligonucleotide实现5′端的模板切换。使用PCR Primer II A扩增得到的cDNA，然后使用NucleoMag NGS Clean-up和Size Select beads（Takara Bio Inc.）进行纯化，并使用DNA HS Assay Kit在Qubit® 4.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）上进行定量。纯化的cDNA被稀释至2 ng/µL，并经过14轮PCR扩增以生成测序文库，在此过程中加入了双重索引以实现样本的多重检测。文库大小分布使用高灵敏度小片段分析试剂盒（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）的Fragment Analyzer进行评估。扩增后的文库被合并、纯化，并通过KAPA文库定量试剂盒（Roche Diagnostics）进行定量，定量基于定量PCR测量结果和平均文库大小。合并后的文库被加载到Illumina NovaSeq和NextSeq 550流式细胞仪（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）上，并在Polo GGB测序设施（Polo d’Innovazione di Genomica, Genetica e Biologia Srl，意大利锡耶纳）以2×75 bp的双端格式进行测序。
RNAseq数据的处理包括使用Illumina bcl2fastq版本2.20进行解复用和转换为FASTQ文件。原始数据的质量通过FastQC版本0.12.1（Andrews 2010）和multiQC版本1.21（Ewels et al. 2016）进行评估。随后使用Trimmomatic版本0.36进行质量过滤，以去除接头和低质量读段。然后将读段映射到人类参考基因组“GRCh38”和Ensembl 110注释上，使用kallisto版本0.50.1和默认参数。在去除所有样本中计数为零的基因后，剩余的34,904个基因在R版本4.4.1（R Core Team 2024）中进行分析。通过R包sva中的“ComBat_seq”函数（版本3.52.0）去除由于技术差异引起的批次效应。差异基因表达（DGE）分析使用R包DESeq2版本1.44.0（Love et al. 2014）进行，使用默认设置估计大小因子和分散度。负二项式GLM拟合和Wald统计量分别用于检测每种处理条件与对照条件之间的DGE差异。假发现率（FDR）用于控制多重检验（Benjamini和Hochberg 1995），默认采用“独立过滤”方法。只有padj < 0.05且|log2FC| > 0.5的基因被识别为DEGs并纳入进一步分析。热图由R包ComplexHeatmap版本2.20.0（Gu et al. 2016）生成。
Ingenuity通路分析将处理后的RNAseq数据集上传到IPA软件（Qiagen；2025年第一季度发布），使用ENSG编号作为标识符。数据分析采用以下标准：|log2FC| > 0.5且padj < 0.05。此外，分析仅限于“人类”物种以及“肝脏”、“肝细胞”和“肝癌细胞系”组织类型。最后，网络分析和上游调节因子分析仅考虑直接关系。对“高”、“中”和“低”三个浓度类别进行了比较分析。由于IPA软件最多只能比较20个不同的数据集，因此对所有PFCA和PFSA同系物（15个同系物）进行了一次比较分析，而对PFECA和PFESA亚组的所有同系物（18个同系物）进行了第二次比较分析。随后，将两次分析的结果从IPA导出并在R中整合，得到所有33个PFAS同系物的一个综合分析结果。
**细胞毒性和PFAS浓度的选择**
对于每种PFAS，选择了三种非细胞毒性浓度用于HepaRG细胞的转录组研究。MTT测定法用于检测线粒体脱氢酶的活性，常被用作细胞活力的指标，因此用于评估33种PFAS同系物在分化HepaRG细胞中的细胞毒性效应。对于每种同系物，首先在较宽的浓度范围内进行了初步MTT筛选（数据未显示）。许多PFAS在500 µM或更高浓度下没有细胞毒性，但选择250 µM作为整个项目的最大测试浓度，以下称为“高”浓度。在较小的浓度范围内进行了额外的MTT测定，以确认所选“高”浓度在HepaRG细胞中不具有细胞毒性（见补充图1）。每种PFAS还选择了另外两种测试浓度，以下分别称为“中”和“低”浓度。总体而言，选定的测试浓度范围为5 µM至250 µM。所有PFAS都在25 µM浓度下进行了测试，但在大多数情况下，这是“低”浓度。33种同系物中有22种在250 µM下进行了测试，25种在100 µM下进行了测试。每种PFAS用于HepaRG处理的浓度如图1所示。需要注意的是，后续比较分析是基于“高”、“中”和“低”分类进行的，而不是基于具体的PFAS浓度。
**实验工作流程**
分化后的HepaRG细胞与33种PFAS同系物的三种选定浓度共同孵育24小时（见图1）。每种处理条件生成了三个独立的重复样本。总共准备了305个样本，包括8个未经处理的对照样本。从这些样本中提取总RNA，检查RNA完整性，并使用Illumina NovaSeq和NextSeq 550平台进行全转录组分析。序列比对使用kallisto完成，过滤并去除批次效应后，使用|log2FC| > 0.5和padj < 0.5的阈值进行DGE分析。
**DGE分析**
DGE分析的结果总结在图1中。大多数PFAS同系物的失调基因数量随浓度增加而增加。一些PFAS，例如PFOA、PFHpS和PFO3DA，在相应的“高”测试浓度下至少引起了显著的转录组改变，而其他PFAS，例如短链同系物PFPrA和PFMOAA以及PFUnA、PFOS和类似Nafion-BP2，对HepaRG细胞的基因表达影响很小。值得注意的是，许多处理条件仅引起轻微的基因表达改变，尤其是在“低”测试浓度下。通过设定一个任意阈值，即100个DEGs作为PFAS对基因表达产生显著影响的最低数量，只有6种PFAS在“低”测试浓度下达到这一阈值，16种在“中”测试浓度下达到，28种在“高”测试浓度下达到。尽管许多处理条件的DEGs数量较少，但仍对所有33种PFAS进行了后续的通路分析。
**IPA分析**
使用|log2FC| > 0.5和padj < 0.05的截止标准进行了IPA分析。此外，分析仅限于“人类”物种，以及“肝脏”器官和“肝细胞”及“肝癌细胞系”细胞类型，以确保我们使用HepaRG细胞获得的实验数据仅与使用人类肝脏、人类原代肝细胞或人类肝癌细胞系获得的IPA来源的实验数据进行比较。同时，仅考虑直接相互作用，排除与间接相互作用相关的数据。最后，对“高”、“中”和“低”三个浓度类别进行了比较分析。“高”浓度组的比较分析结果分别在图2中展示了典型通路，在图3中展示了上游调节因子，在图4中展示了下游效应（毒性功能）。相应的中和低浓度类别的比较分析见补充图2-7。
**典型通路分析**
如预期，不同PFAS对各种典型通路的影响与DEGs的数量相关。PFOA、PFOA-NH4、PFHpS和PFO3DA的影响最为显著，这些PFAS也显示出最多的DEGs（见图1）。值得注意的是，PFOA和PFOA-NH4对典型通路的影响在显著性和z值方面几乎相同。因此，在该细胞培养实验中，无论是以游离酸形式还是铵盐形式使用PFOA，结果都相似。一些PFECA和PFESA同系物也显示出对典型通路的强烈影响，例如PFoxaOA、HFPO-TeA、8:2 Cl-PFESA和Nafion-BP1。而对于那些在HepaRG细胞中通常对基因表达影响较小的PFAS（如PFPrA、PFBA、PFUnA、PFOS、PFO3TriDA、CH3-PFO3TriDa和类似Nafion-BP2），仅观察到轻微的影响。当padj < 0.05时，颜色会从浅灰色渐变为黑色，热图瓦片的左上角三角形区域会显示逐渐增加的-log10(padj)值。在热图瓦片的右下角三角形区域，IPA z分数用橙色表示（表示相应上游调节因子的激活），用紫色表示（表示相应上游调节因子的抑制）。值得注意的是，PFAS不仅对“高”浓度类别（图2）的脂肪酸和脂质代谢有激活作用，对“中”浓度类别也有激活作用，对“低”浓度类别也有部分激活作用（补充图2和3），这表明所有PFAS在更广泛的浓度范围内都会影响这些代谢途径。
除了脂质代谢外，几乎所有PFAS都显著影响了与外源物质代谢相关的经典代谢途径。与脂质代谢类似，这种影响也出现在“高”、“中”浓度类别，以及部分“低”浓度类别中。PFAS影响了基于I期和II期酶基因表达的外源物质代谢途径。CYP和/或ADH基因表达的改变（I期）体现在诸如“I期——化合物功能化”、“尼古丁降解II”、“阿司匹林ADME”和“乙醇降解”等途径中；UGT和/或GST基因表达的改变（II期）体现在诸如“II期——化合物结合”、“血清素降解”、“卟啉代谢”和“对乙酰氨基酚ADME”等途径中（图2）。显然，PXR和CAR是这些外源物质代谢途径的核心上游调节因子，除了PFPrA、PFBA和PFUnA外，所有PFAS都会激活它们（图3）。有趣的是，PFAS对这些核受体的激活作用并未完全反映在经典代谢途径中。从z分数来看，存在“PXR/RXR激活”途径被激活的趋势，而“外源物质代谢CAR信号通路”和“外源物质代谢PXR信号通路”途径则倾向于被抑制。因此，必须指出PFAS强烈影响HepaRG细胞中由PXR和CAR调节的基因表达，但与PPAR介导的脂质代谢的明确调控方向相比，其调控方向（激活或抑制）并不那么清晰。关于调控方向的不确定性可以解释为：许多受PXR和CAR调节的基因在PFAS处理后上调，而其他依赖PXR和CAR的基因则同时下调。这一点在补充图11-13中得到了说明，这些图展示了33种PFAS对与“I期——化合物功能化”经典途径相关基因表达的影响。经典的PXR和CAR靶基因如CYP3A4和CYP2B6在PFAS处理后显著上调，而其他CYP基因（例如CYP1A1和CYP2E1）则下调。因此，PFAS介导的外源物质代谢改变可能不仅仅依赖于PXR和/或CAR的激活，还可能涉及其他机制。
图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
基于33种PFAS“高”浓度数据的IPA下游效应（毒性功能）的比较分析。当至少有一种PFAS的padj < 0.05时，就会显示其下游效应。下游效应根据padj的值进行排序。当padj < 0.05时，颜色从浅灰色渐变为黑色，随着-log10(padj)值的增加而变化。
一些测试的PFAS强烈抑制了与胆固醇和胆汁酸生物合成相关的经典代谢途径（图2）。这解释了那些对HepaRG转录组有强烈影响的PFAS，如PFOA、PFOA-NH4、PFHpS和PFO3DA，这些PFAS的DEGs数量较多。此外，PFoxaOA、HFPO-TeA、8:2 Cl-PFESA和Nafion-BP1也强烈抑制了与胆固醇和胆汁酸生物合成相关的途径。这一点在“胆固醇生物合成”（图5和补充图14-15）和“胆汁酸和胆汁盐代谢”（图6和补充图16-17）的经典代谢途径中得到了体现，展示了33种PFAS对HepaRG细胞中相关基因表达的影响。一些PFAS显著下调了几乎所有参与胆固醇生物合成途径的基因（图5），表明这些基因受到共同调控。SREBF1和SREBF2的基因表达几乎不受PFAS的影响（图5），然而IPA预测某些PFAS会抑制这两个转录因子的调控功能（图3）。此外，预测一些PFAS会激活（B1F）或抑制（ATF6）参与胆固醇生物合成调控的其他上游调节因子（图3）。在胆汁酸代谢方面，许多PFAS显著下调了CYP7A1基因的表达（图6）。此外，许多PFAS还影响了参与胆汁酸生物合成的酶编码基因（例如CYP8B1、CYP27A1、AKR1D1）以及参与胆汁酸排泄的膜转运蛋白编码基因（ABCB11、SLC51B、SLC51A）的表达（图6）。
图5：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
基于33种PFAS“高”浓度数据的IPA经典代谢途径“胆固醇生物合成”相关基因的比较分析。所有属于IPA途径“胆固醇生物合成”的基因都被显示出来。基因根据log2FC的值从上到下排序，正值在上，负值在下。当padj < 0.05时，颜色从浅灰色渐变为黑色，随着-log10(padj)值的增加而变化。
值得注意的是，与胆固醇和胆汁酸生物合成相关的经典代谢途径及其上游调节因子仅在PFAS的“高”浓度下受到影响（图2和3），而在“中”或“低”浓度下没有显著影响（补充图2-5），这与上述PFAS对脂质代谢和外源物质代谢的影响相反。考虑到250 µM的高浓度接近于PFOA、PFOA-NH4、PFHpS和PFO3DA的细胞毒性阈值，这些PFAS对胆固醇和胆汁酸生物合成的强烈影响可以解释为在接近导致细胞死亡的浓度下发生的巨大细胞代谢和调控紊乱。尽管这些效应仅在某些PFAS的近细胞毒性浓度下观察到，但不能排除其他PFAS在更高浓度下也会抑制胆固醇和胆汁酸生物合成。
除了与胆固醇和胆汁酸生物合成相关的途径外，对HepaRG转录组有强烈影响的PFAS还影响了一些与氨基酸代谢、细胞分裂、一般转录和翻译以及某些免疫相关反应相关的经典代谢途径（图2）。与这些全局细胞功能相关的途径在相应的“高”浓度下被某些PFAS激活或抑制，但在“中”和“低”浓度下则没有（补充图2和3），这再次表明在接近导致细胞死亡的浓度下发生了巨大的细胞信号传导和代谢紊乱。与上述对胆固醇和胆汁酸生物合成的强烈影响相比，PFAS对这些各种细胞功能的影响在显著性上较低，z分数也较小。总体而言，由于少数PFAS在接近其细胞毒性阈值时的影响并不明显，因此对这些数据的解释需要谨慎。
IPA分析显示，大多数PFAS抑制了FOXA2，这是一种参与肝细胞分化的肝脏特异性转录因子。此外，IPA预测大多数PFAS显著影响了肝细胞特异性全局调节因子HNF4A和HNF1A，且倾向于抑制（图3）。此外，HIF1A（HIF-1转录因子的α亚基，是细胞对缺氧反应的主要调节因子）也被预测被大多数PFAS抑制。这四种转录因子都参与调节细胞增殖、分化、能量代谢和代谢稳态等核心细胞功能，表明PFAS在更广泛的浓度范围内影响了HepaRG细胞的生存能力。PFAS介导的这些四个核心调节因子的抑制在“高”、“中”浓度类别以及部分“低”浓度类别中都有预测（图3、补充图4和5），表明这些核心细胞功能在更广泛的浓度范围内受到PFAS的影响。同样，参与甲状腺代谢调节的核受体THRB也被预测在“高”、“中”和“低”浓度下被许多PFAS激活（图3），表明PFAS对甲状腺内分泌系统也有影响。最后，NF-κB亚基RELA也被预测在更广泛的浓度范围内被许多PFAS激活，将PFAS介导的效应与NF-κB信号传导联系起来。
除了几乎所有PFAS都影响的这些转录因子外，一些上游调节因子如TP53、AHR和ATF4也受到本研究中使用的一些PFAS的影响（图3），但这些发现并不十分可靠，因此无法得出明确结论。值得注意的是，这些与某些额外调节因子的相互作用主要限于PFECA和PFESA亚组的成员，表明新型PFAS可能会影响一些传统PFCA和PFSA亚组未涉及的额外调节因子。
关于下游效应（毒性功能），IPA软件预测本研究中使用的大多数PFAS诱导的分子效应与体内某些肝脏特异性不良结果之间存在强烈关联，特别是“进行性肝内胆汁淤积”和“进行性家族性肝内胆汁淤积1型”（图4）。这些关联在“高”、“中”浓度类别以及部分“低”浓度类别中都有预测（补充图6和7）。尽管显著性较低，但也预测了与胆汁酸代谢紊乱（例如进行性家族性肝内胆汁淤积2型和3型、原发性胆汁性肝硬化）和脂质代谢（例如非酒精性脂肪肝病）相关的疾病，以及与炎症（例如炎症性肝细胞腺瘤、肝炎）相关的疾病，最终还包括肝硬化、肝细胞癌或肝癌等与某些PFAS诱导的分子效应相关的终末不良结果。这些潜在下游效应的预测基于间接关联，因果关系尚不明确，因此需要谨慎处理。有许多报告指出某些肝脏疾病与肝细胞基因表达的改变有关。然而，目前尚不清楚这种基因表达的改变是否是疾病发展的原因，或者相反，即器官是否试图通过改变基因表达来补偿导致疾病的代谢紊乱。此外，IPA还考虑了基于某些疾病中基因突变发生的第二种关联类型。然而，某些疾病有时与特定基因的突变有关，而这些突变可能会导致相应基因产物的功能改变，但这并不立即意味着突变是导致这些疾病的直接原因。IPA的预测依赖于间接关联和未知的因果关系，因此应谨慎对待。不过，值得注意的是，IPA预测了体外PFAS介导的基因表达改变与体内不良效应之间存在强烈关联，这些不良效应主要与肝内胆汁淤积有关，这是一种由于胆汁酸生物合成和排泄持续失衡而发生的疾病。
动物和人类流行病学研究表明，接触多种PFAS（包括PFOA和PFOS）会对免疫系统、内分泌系统和肝脏产生不良影响。然而，其背后的分子机制尚未完全明了。组学方法，特别是转录组学，被广泛用作无假设的工具来识别受影响的分子途径，并提供关于毒素作用的机制见解。许多转录组学研究调查了PFAS在不同物种（包括人类、小鼠、鱼类和其他环境物种）和组织中的影响（Attema等人2022年；Dasgupta等人2020年；Feng等人2022年；Khan等人2021年；Pfohl等人2021年；Rowan-Carroll等人2021年）。这些研究大多集中在PFOS和/或PFOA上，有些研究还包含了其他PFCA和PFSA同类物质。最近的一项研究综合并重新评估了多项转录组学研究的结果，得出结论认为PFAS在不同物种和组织中诱导了相似的转录组变化，表明保守的古老分子靶点受到PFAS的影响（Beccacece等人2023年）。这些保守的反应主要与免疫、内分泌信号传导和脂质代谢相关。
在肝脏毒性的研究中，多项啮齿动物实验发现PPARα激活是PFAS肝毒性的关键分子启动事件。Robarts等人（2024年）重新分析了暴露于PFAS的小鼠肝脏的转录组数据集，包括传统PFAS（PFOA、PFOS、PFNA、PFHxS）和几种替代PFAS（如HFPO-DA、HFPO-TA、Nafion-BP2）。他们的分析显示，除了Nafion-BP2外，所有测试的PFAS都一致地刺激了PPARα调控的脂质代谢。此外，大多数PFAS还激活了转录因子CAR、NRF2和SREBP1/2，而STAT5b则被抑制。总体而言，作者得出结论，传统PFAS和替代PFAS在小鼠肝脏中诱导了相似的分子反应。
多项转录组学研究使用人类肝癌细胞系或原代人肝细胞进行，其中大多数研究仅涉及少数几种传统PFAS。在HepG2细胞中，PFOS、PFOA和PFHxA影响了与脂肪酸和脂质代谢、葡萄糖代谢以及细胞应激相关的多个途径（Carberry等人2025年）。在HepaRG细胞中，PFOS、PFOA和PFNA激活了由PPARα调控的脂肪酸和脂质代谢，并抑制了与胆固醇生物合成相关的基因表达。基因表达的改变进一步表明这三种传统PFAS诱导了内质网应激（Louisse等人2020年、2023年）。在原代人肝细胞中，HFPO-DA（GenX）在0.1至100 µM的浓度范围内改变了参与脂质、单羧酸和酮体代谢的基因表达。在100 µM的HFPO-DA浓度下，PPARα、VEGF、STAT3和SMAD4信号通路被激活（Robarts等人2022年）。总体而言，PFAS介导的PPARα调控基因表达的激活是所有这些使用人源肝细胞进行的研究中的一个共同主题。
迄今为止最全面的人源肝细胞基PFAS转录组学研究由Addicks等人（2025年）发表，该研究使用了从原代人肝细胞衍生的人肝球体，并强调PFAS不会诱导相同的途径谱型，这与我们的数据部分一致。然而，在我们的HepaRG数据集中，33种PFAS的整体模式仍然表现为广泛的相似途径级反应，其中脂质和外源性物质代谢的共享信号最为明显，而在接近细胞毒性的高浓度下，其他途径的差异变得更加明显。本研究的主要新颖之处在于，33种PFAS同类物质的转录组反应模式可以视为两层反应：第一层是大多数化合物共有的核心反应，主要涉及脂质代谢和外源性物质代谢；第二层包括额外的途径变化（如胆固醇/胆汁酸代谢、氨基酸代谢、细胞分裂、翻译/转录和免疫相关功能），这些变化仅在一部分PFAS的“高”浓度下观察到。
Addicks研究与我们自己的研究之间的一个重要区别在于PFAS的组成：Addicks研究中只有一种PFCA同类物质HFPO-DA（GenX），而我们的研究也包含了这种物质。在这方面，我们专注于（聚）醚类PFAS的PFAS同类物质的选择补充了Addicks的研究，并将关于PFAS诱导的人肝细胞转录组改变的信息扩展到了至少44种PFAS同类物质。据我们所知，我们的研究首次提供了至少13种PFCA和PFESA亚组PFAS同类物质的转录组数据，包括PFMOAA、PFMOPrA、PFMOBA、PFO2HpA、PFO2DA、PFO3DA、PFO3TriDA、PFoxaOA、branched ADONA、PF2EOESA、8:2 Cl-PFESA、Nafion-BP1以及类似Nafion-BP2的物质。因此，我们的研究大大扩展了关于醚类PFAS的机制转录组证据，并表明尽管这些化合物在结构上与传统的PFCA/PFSA同类物质不同，但它们在很大程度上诱导了相同的肝脏核心特征。我们数据集的另一个重要方面是包含了短链和极短链PFAS，这些物质在机制研究中仍然较少被关注。在我们的DGE分析中，一些化合物（尤其是PFPrA和PFMOAA）即使在“高”浓度下也只引起了轻微的转录变化，这在途径水平上也得到了体现，即那些整体转录组反应较弱的化合物（如PFUnA、PFOS和类似Nafion-BP2）也仅显示出轻微的IPA途径扰动。特别是，超出共享核心反应的额外途径组并不是在所有PFAS中都普遍存在，而主要是在“高”浓度下表现出较强反应的化合物中；这包括一些与免疫相关的途径以及与翻译/转录、氨基酸代谢和细胞分裂相关的途径。由于许多这些途径类别在相应的“中等”和“低”浓度下不存在，因此最好将它们解释为在较强、接近细胞毒性条件下的次要反应层。因此，短链PFAS缺乏这些广泛的途径变化不应被解释为生物学上的不活性，而应解释为在测试浓度窗口（最大250 µM）内有效的细胞内暴露较低，从而主要捕获了共享的核心反应。
Addicks研究与我们自己的研究的另一个重要区别在于PFAS的组成：Addicks研究中只有一种PFCA同类物质HFPO-DA（GenX），而我们的研究中也包含了这种物质。在这方面，我们专注于（聚）醚类PFAS的PFAS同类物质的选择补充了Addicks的研究，并将关于PFAS诱导的人肝细胞转录组改变的信息扩展到了至少44种PFAS同类物质。据我们所知，我们的研究首次为PFCA和PFESA亚组的至少13种PFAS同类物质提供了转录组数据。因此，我们的研究显著扩展了关于醚类PFAS的机制转录组证据，并表明尽管这些化合物在结构上与传统的PFCA/PFSA同类物质不同，但它们在很大程度上诱导了相同的肝脏核心特征。我们数据集的另一个重要方面是包含了短链和极短链PFAS，这些物质在机制研究中仍然较少被关注。在我们的DGE分析中，一些化合物（尤其是PFPrA和PFMOAA）即使在“高”浓度下也只引起了轻微的转录变化，这在途径水平上也得到了体现。特别是，超出共享核心反应的额外途径组并不是在所有PFAS中都普遍存在，而主要是在“高”浓度下表现出较强反应的化合物中；这包括一些与免疫相关的途径以及与翻译/转录、氨基酸代谢和细胞分裂相关的途径。由于许多这些途径类别在相应的“中等”和“低”浓度下不存在，因此最好将它们解释为在较强、接近细胞毒性条件下的次要反应层。因此，短链PFAS缺乏这些广泛的途径变化不应被解释为生物学上的不活性，而应解释为在测试浓度窗口内有效的细胞内暴露较低。
根据IPA的结果，大多数PFAS诱导的最显著的基因表达改变是PPARα依赖性靶基因的上调，进而导致PPARα介导的脂肪酸和脂质代谢的调节。这在33种测试的PFAS中的29种中观察到，并且发生在较宽的浓度范围内。PFAS介导的PPARα激活已在多个水平和多个物种中得到证实，例如通过转激活实验（Behr等人2020b年；Wolf等人2008年、2012年）、PPARα结合实验（Ishibashi等人2019年）、分子对接研究（Khazaee等人2021年；Kowalska等人2023年）等。这些研究通常仅限于PFCA和PFSA同类物质，但上述提到的最新转录组学研究以及我们自己的研究表明，PPARα的激活似乎是大多数PFAS亚组的共同特征。我们最近通过转激活实验表明，我们测试集中的所有PFAS（除了PFDA、PFUnA和8:2 Cl-PFESA）都能激活PPARα（Alker等人2026年）。在那项研究中，PFCA同类物质被证明是最强的PPARα激动剂，而含有磺酸官能团的PFAS的活性低于含有羧酸官能团的PFAS。这与先前的报告一致，即PFSA同类物质作为PPARα激动剂的活性低于PFCA同类物质（Behr等人2020b年；Rosenmai等人2018年；Wolf等人2008年、2012年）。因此，在AOP框架内，PFAS介导的PPARα激活可以被认为是肝细胞中的重要分子启动事件，而PPARα调控的脂肪酸和脂质代谢的紊乱可能是PFAS诱导的肝细胞效应的主要机制。
除了PPARα激活外，大多数PFAS同类物质还影响了HepaRG细胞中的外源性物质代谢，主要通过PXR和/或CAR调节。与我们自己的结果一致，Addicks研究中也发现大多数PFAS影响了由CAR调节的外源性物质代谢相关基因的表达（Addicks等人2025年）。此外，Robarts等人（2024年）总结了多项小鼠研究，表明多种传统和新型PFAS也激活了PXR和/或CAR。在本研究中，大多数PFAS显著影响了CYP、GST和UGT家族的基因表达，但调节的方向不如PPARα靶基因的上调那么明确。因此，PFAS诱导的I相和II相基因表达的调节可能不仅仅由PXR和CAR调节，其他因素也可能影响PFAS在HepaRG细胞中的外源性物质代谢。从机制上讲这是合理的，特别是对于CAR来说，因为CAR依赖的外源性物质反应也可以通过涉及信号依赖的CAR磷酸化状态控制（例如Thr38去磷酸化）和核转位（Mutoh等人2013年）的间接激活机制发生，而不仅仅是直接的受体-配体相互作用。此外，CAR和PXR都与RXR形成异二聚体，而PPARα也是RXR的伴侣，这使得以RXR为中心的核受体相互作用成为这里观察到的混合代谢/外源性物质特征的合理解释。实际上，我们之前已经表明，一些PFCA和PFSA同类物质在转激活实验中既不激活PXR也不激活CAR，而它们明显激活了PPARα（Alker等人2026年）。在那项研究中，PFCA同类物质被证明是最强的PPARα激动剂，而含有磺酸官能团的PFAS的活性低于含有羧酸官能团的PFAS。这与先前的报告一致，即PFSA同类物质作为PPARα激动剂的活性低于PFCA同类物质（Behr等人2020b年；Rosenmai等人2018年；Wolf等人2008年、2012年）。因此，在AOP框架内，PFAS介导的PPARα激活可以被认为是肝细胞中的重要分子启动事件，而PPARα调控的脂肪酸和脂质代谢的紊乱可能是PFAS诱导的肝细胞效应的主要机制。
除了PPARα激活外，大多数PFAS同类物质还影响了HepaRG细胞中的外源性物质代谢，主要通过PXR和/或CAR调节。与我们的结果一致，Addicks研究中也发现大多数PFAS影响了由CAR调节的外源性物质代谢相关基因的表达（Addicks等人2025年）。此外，Robarts等人（2024年）还报告了多种传统和新型PFAS激活了PXR和/或CAR。在本研究中，大多数PFAS显著影响了CYP、GST和UGT家族的基因表达，但调节的方向不如PPARα靶基因的上调那么明确。因此，PFAS诱导的I相和II相基因表达的调节可能不仅仅由PXR和CAR调节，其他因素也可能影响PFAS在HepaRG细胞中的外源性物质代谢。从机制上讲这是合理的，特别是对于CAR来说，因为CAR依赖的外源性物质反应也可以通过涉及信号依赖的CAR磷酸化状态控制（例如Thr38去磷酸化）和核转位的间接激活机制发生。此外，CAR和PXR都与RXR形成异二聚体，而PPARα也是RXR的伴侣，这使得以RXR为中心的核受体相互作用成为这里观察到的混合代谢/外源性物质特征的合理解释。事实上，我们之前已经表明，一些PFCA和PFSA同类物质在转激活实验中既不激活PXR也不激活CAR，而它们明显激活了PPARα（Behr等人2020b年），这表明外源性物质代谢的激活机制可能独立于PXR和/或CAR。尽管确切的分子启动事件尚不清楚，但在暴露于各种PFAS同类物质时，细胞解毒程序似乎会被激活。然而，这些程序在PFAS的情况下无效，因为这些化合物对代谢转化具有抗性，它们可能不是I相或II相酶的底物。因此，HepaRG细胞似乎能够识别PFAS作为外源性物质，但它们无法通过I相和II相酶将其转化以促进细胞排泄。
除了对外源性物质解毒的影响外，这种RXR-/PXR-/CAR相关的反应也可能与这里观察到的更广泛的代谢表型有关，因为这些核受体网络与肝脏脂质、胆固醇和胆汁酸的稳态密切相关，因此可能有助于解释PFAS对CYP7A1表达和胆汁酸/胆固醇生物合成的显著影响。与我们的数据一致，其他多项使用HepaRG细胞（Louisse等人2020年、2023年）和原代人肝细胞（Addicks等人2025年）进行的转录组研究也发现，多种传统PFAS抑制了胆固醇生物合成。然而，在HepaRG细胞中，之前已经表明PFOA和PFOS并未影响胆固醇水平（Behr等人2020a年；Louisse等人2020年）。另一方面，经常有报道指出，传统PFAS在原代人肝细胞球体和HepaRG细胞中强烈下调了CY7A1基因的表达（图6；Addicks等人2025年；Behr等人2020a年；Louisse等人2023年），至少在HepaRG细胞中，这导致CYP7A1蛋白显著减少（Behr等人2020a年）。CYP7A1在肝细胞中催化从胆固醇生成胆汁酸的第一步，也是限速步骤。我们之前的研究已经表明，当HepaRG细胞培养物受到PFOA或PFOS处理时，某些胆汁酸的水平确实会显著下降（Behr等人，2020a）。因此，观察到的胆固醇生物合成基因表达的抑制可能是PFAS诱导的CYP7A1下调的反馈机制，旨在维持细胞内的胆固醇水平。Addicks等人在他们的研究中提出，长链PFAS整合到细胞膜中可能会抑制SCAP/SREBP调控系统，从而导致胆固醇生物合成基因的下调（Addicks等人，2025）。我们认为，在人类肝细胞中，当CYP7A1被PFAS下调时，胆固醇转化为胆汁酸的过程会受到强烈抑制，从而减少细胞的胆固醇生物合成，以避免产生过多的胆固醇。因此，反复观察到PFAS在人类肝细胞中抑制胆固醇生物合成这一现象，实际上可能是由于PFAS通过下调CYP7A1来抑制胆汁酸合成所致。在本研究中，PFAS水平与胆汁酸生物合成之间的关联也体现在IPA预测中，即肝内胆汁淤积是PFAS引起的最显著的下游效应（图4）。胆汁淤积是一种基于肝脏胆汁酸合成和分泌失衡的肝脏疾病。尽管目前尚未在人类身上证明PFAS水平与胆汁淤积疾病之间存在相关性，但流行病学研究至少揭示了PFAS血清水平与血清胆固醇之间的正相关关系（Dong等人，2019；Fu等人，2014；Jain和Ducatman，2019；Nelson等人，2010）。乍一看，这一发现似乎与在分子和细胞水平上观察到的PFAS抑制胆固醇生物合成的现象相矛盾。然而，可以假设存在一种反馈机制，在肝脏中活跃起来，以抑制由于PFAS引起的胆固醇水平升高而产生的过量胆固醇的生物合成，这可能是由于PFAS抑制了CYP7A1调控的胆汁酸合成。有趣的是，在啮齿动物中情况正好相反。许多动物研究表明，PFAS的应用会导致小鼠（Minata等人，2010；Wang等人，2014）和大鼠（NTP，2019a，2019b）的血清胆固醇水平下降。然而，在分子水平上，Robarts等人（2024）总结指出，一些PFAS在小鼠肝脏中激活了胆固醇生物合成。综合来看，PFAS似乎会影响与胆固醇稳态相关的胆汁酸合成，但背后的分子机制以及物种间的差异尚未完全明了。
在我们的研究中，一些PFAS还影响了与氨基酸代谢、细胞分裂、一般转录和翻译以及免疫反应等相关的一系列经典途径，但这些效应仅在接近这些PFAS同系物的细胞毒性阈值的“高”浓度下观察到（图2）。因此，这些发现可以解释为在接近导致细胞死亡的浓度下，细胞信号传导和代谢出现了严重紊乱。Addicks等人（2025）报告了某些PFAS对人类肝球体中与免疫功能、蛋白质合成（核糖体和起始）以及柠檬酸循环相关的基因表达的影响。这些效应是在长链PFCA和PFSA同系物中观察到的。在Addicks的研究中，最高测试浓度为100 µM，这可能接近这些PFAS同系物的细胞毒性阈值。可以假设，如果测试浓度高于100 µM并接近相应的细胞毒性阈值，较短链的PFAS也可能影响这些额外途径。在本研究中，虽然许多PFAS的细胞毒性阈值要高得多，特别是对于短链PFCA和PFSA同系物，但我们选择的最高测试浓度为250 µM。这些PFAS并未引起与免疫或核糖体功能相关的基因表达变化，这与Addicks的研究结果一致。然而，与Addicks的研究不同，我们认为这不是因为这些短链PFAS的膜整合潜力较低，而是因为在这些浓度下尚未达到它们的细胞毒性阈值。最后，需要指出的是，短链PFAS的生物累积潜力远低于长链同系物。短链同系物完全通过肾脏清除，而长链同系物如PFOA和PFOS则部分通过肝脏清除并通过胆汁排出（Abraham等人，2024）。因此，未来的研究可以关注短链PFAS的肾脏毒性，包括使用肾细胞系的体外研究。
关于测试浓度，需要指出的是，本体外研究中使用的PFAS浓度相对较高（范围为5–250 µM），比普通人群中的PFAS血清浓度高出三到四个数量级。例如，普通人群中的PFOS血清浓度通常在约10 nM的范围内，而且普遍认为PFOS在亚微摩尔水平上会对人体健康产生不良影响（EFSA，2020）。许多PFAS已知在众多体内和体外毒理学终点上表现出陡峭的剂量-反应曲线。这也解释了本研究中每种PFAS同系物都在三个非细胞毒性浓度下进行了测试的原因，并且在最低测试浓度下几乎未观察到任何反应（图1）。因此，在体外研究中使用高PFAS浓度是必要的，以便深入了解PFAS驱动的分子毒性机制，这有助于对这些化合物的危害进行评估，但在将体外结果与实际暴露情景联系起来时需要谨慎。然而，在本研究中，即使是在最高的非细胞毒性浓度100 µM下，分化的HepaRG细胞也没有表现出强烈反应。由于细胞毒性问题，在我们之前的研究中，HepaRG处理的最高PFOS浓度也为100 µM（Sadrabadi等人，2024）和48小时处理的最高浓度为50 µM（Behr等人，2020a）。Louisse等人在他们的研究中使用了高达400 µM的PFOS进行HepaRG处理（Louisse等人，2020，2023），并在200 µM和400 µM的PFOS浓度下观察到了基因表达的显著变化。然而，在Louisse的研究中（Louisse等人，2023），即使在100 µM浓度下，PFOS对HepaRG细胞的基因表达也只有轻微影响。根据他们的细胞毒性数据，Addicks等人使用最高20 µM的PFOS对人类肝球体进行了10天的暴露，并观察到了PFOS对基因表达的强烈影响（Addicks等人，2025）。这表明PFOS对基因表达的影响取决于细胞模型、暴露持续时间、孵育浓度以及不同的细胞培养方案的额外技术细节。此外，在评估转录组数据时使用不同的截止标准也解释了不同研究中PFOS效力的看似差异。除了PFOS之外，这也可能适用于PFNA、PFDA和PFUnA在不同研究中对基因表达的明显不同影响。
总之，不同的转录组研究一致表明，多种PFAS同系物在人类肝细胞中具有相似的分子作用机制。在基因表达水平上，PFAS通常通过激活PPARα来诱导脂肪酸和脂质代谢，并至少部分通过PXR/CAR相关的信号通路影响外源物质代谢。在本研究中，这一现象在总共33种PFAS同系物中得到了证实，其中包括13种PFECA/PFESA亚组的同系物，这是首次在HepaRG中报告此类转录组证据。重要的是，当前的数据集还包括了短链和非常短链的PFAS，这些在机制研究中仍然较少被关注。这些化合物通常引起的转录组反应较弱，额外的途径扰动也较少，但这不应被解释为生物学上的不活性。相反，我们的数据支持这样的观点：短链PFAS也可以贡献于相同的肝细胞转录组特征，而在测试浓度范围内，更广泛的次要反应可能低于检测限。一部分PFAS影响了额外的经典途径和相关的上游调节因子，但主要是在高浓度、接近细胞毒性阈值的情况下。有趣的是，几种PFAS强烈抑制了胆固醇和胆汁酸的生物合成，这可能是由于PFAS显著下调了CYP7A1基因表达。尽管这些效应仅在我们HepaRG体外系统中的高微摩尔浓度下观察到，但它们提供了可能的机制解释，可以说明流行病学研究中观察到的PFAS血清水平与血清胆固醇水平之间的关联。总体而言，这些发现突显了转录组研究在揭示PFAS肝毒性的共同特征和化合物依赖性特征方面的价值，并有助于在分子水平上提出可验证的机制假设。
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