综述：用于细胞封装的新型多孔材料

这篇综述从合成生物学和材料科学的角度总结了近期在cell@MOF、cell@COF和cell@HOF复合材料方面的进展。它概述了合成多孔无机外骨骼的关键合成策略，重点介绍了基于框架的材料。此外，还讨论了细胞表面化学以及评估细胞活力的当前方法。文章还探讨了这些复合材料在细胞疗法、生物催化、生物传感和二氧化碳减排等主要应用领域的应用，以及它们的制备和表征方法。最后，综述指出了利用框架材料来设计合成细胞和增强细胞功能的未来前景和挑战。

引言

在自然界中，生物物种的生存依赖于它们应对各种环境条件的能力。为了适应环境压力，一些微生物发展出了通过分子前体的自组装来构建无机涂层的能力。这些涂层旨在赋予被包裹的细胞各种功能性，如机械强度、耐热性和物理保护，以确保细胞在不利条件下的生存。例如，某些细菌会产生一种有机聚合物网络，提供机械强度以抵抗外部压力，并提高它们在缺水环境中的耐干燥性。这种生存机制被称为孢子形成。具体来说，细胞进行不对称分裂，形成一个新腔室：前孢子。在前孢子中，细胞会封装对菌株生存至关重要的生物物质（如脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和酶）。然后，前孢子经历一个成熟过程，在此过程中，壳层和多层涂层包围前孢子的核心，形成一个保护性屏障（图1a）。随后，通过用二吡啶酸（DPA）和钙离子逐渐替代水来使核心脱水，实现代谢失活或休眠状态，最终在母细胞内形成内孢子（图1a）。最后，母细胞经历程序性细胞死亡（凋亡），同时将内孢子释放到环境中。关于这一过程的详细信息可以在专门的综述文章中找到。保护性涂层材料的自然形成不仅限于有机生物聚合物。一些细胞拥有从环境中吸收矿物质并合成无机材料涂层的代谢机制。这一过程被称为生物矿化，它为不同的生物系统提供了坚固且具有保护性的外骨骼。生物硅化是个体细胞矿化的典型例子，其中硅藻将可溶性硅酸转化为无定形的二氧化硅壳。这种无机涂层在细胞暴露于热、干燥、微生物攻击和裂解酶降解等环境压力时提高了细胞的生存能力。同时，无机涂层还赋予了光学透明性，并使细胞功能所需的营养物质得以运输。其他典型的无机细胞涂层例子包括存在于软体动物壳和珍珠中的碳酸钙，以及存在于骨骼组织中的磷酸钙。受这些天然涂层的启发，多学科研究正在探索为缺乏天然矿化能力的细胞开发无机保护性外骨骼的合成方法。这些合成细胞@壳系统被称为“人工孢子”（图1b），并具有三个主要优势：

图1

自然（a）和人工（b）孢子形成的示意图。自然过程始于细胞的不对称分裂：母细胞（紫色）形成前孢子（橙色）。母细胞包裹前孢子，形成一个能够抵抗多种压力（紫外线、化学物质和热量）的成熟孢子（蓝色）。孢子可以保持休眠状态，直到营养丰富的条件触发其萌发和生长。人工孢子形成也类似地在单个细胞（紫色）周围使用保护性涂层（蓝色晶体），抑制细胞增殖并增强抵抗力。需要时溶解这种无机涂层可以恢复正常的生长和代谢。

I. 增强细胞对化学和物理压力的抵抗力：与裸露的细胞不同，人工孢子对不利环境条件（如酶降解、渗透压变化、高温和紫外线辐射）表现出更强的耐受性。

II. 按需抑制和重新激活细胞分裂：在活细胞周围形成坚硬的人工壳层会阻碍细胞分裂，诱导出类似孢子的休眠状态。通过按需降解壳层可以恢复细胞增殖和自然代谢功能。

III. 定制的外源生化特性：通过设计具有特定化学和生化特性的涂层，可以赋予细胞具有外源化学功能性的无机外骨骼：新的细胞@壳系统具有原始裸露细胞所没有的功能。例如，这种材料设计策略提高了细胞在营养缺乏和蛋白酶丰富环境中的适应性。

我们注意到，无机外骨骼应满足以下要求：（i）选择性传递、（ii）耐久性、（iii）按需可降解性和（iv）功能性。这些特性如下所述：

I. 选择性传递：在细胞@壳系统中保持细胞活力取决于向细胞质持续供给营养物质。理想情况下，人工细胞涂层应作为分子筛，允许生物相关分子（如细胞营养物质、氧气和代谢物）自由通过，同时防止细胞毒性大分子的扩散。

II. 耐久性：模拟孢子的特性需要制造出足够坚固的人工涂层，以承受渗透压变化和脱水引起的机械应力。此外，坚硬的人工壳层会延缓或抑制细胞分裂，模拟孢子的休眠状态。

III. 按需可降解性：为了实现原始代谢细胞功能的可编程恢复，人工涂层必须能够在施加外部刺激时降解。按需去除人工涂层可以控制细胞从休眠状态到活跃状态的转换。

IV. 功能性：人为赋予外源功能性使得可以制造出具有非天然功能的系统。这种方法可以用来使细胞适应恶劣的生存环境（如营养缺乏或细胞毒性环境）。

受到设计独特功能性潜力的启发，研究人员专注于用各种无机（如SiO2、CaCO3和MnO2）、有机（如海藻酸盐、聚乙烯、壳聚糖和细胞膜）和混合（如金属-酚类网络和框架材料）材料来包裹活细胞（图2a-c）。在这篇综述中，我们重点关注用于包裹单个活细胞的框架材料（图2c）。框架材料可以定义为由分子构建块通过定向键合相互作用连接的扩展晶体网络。最常用的用于包裹活细胞的框架材料是金属-有机框架（MOFs）。最近，也有报道将活细胞封装在共价有机框架（COFs）和氢键结合的有机框架（HOFs）中的研究。所有这三种框架材料都是通过自下而上的合成方法制造的。MOFs由通过多官能团有机连接剂连接的无机簇组成，而COFs和HOFs则分别仅由通过共价和氢键连接的有机构建块构成。这些材料的共同特点是它们的自下而上合成方法，这使得可以精确调整无机涂层的化学和结构特性。例如，可以调整孔径大小来调节必需细胞营养物质的扩散，同时防止蛋白酶的细胞毒性效应。

图2

无機（a）、有機（b）和混合材料（c）作为无机细胞涂层的示意图，以及选定示例的扫描电子显微镜（SEM，中间）和透射电子显微镜（TEM，底部）显微照片。（a）不同放大倍数的酵母@SiO2的SEM显微照片。微切片酵母@SiO2的TEM图像显示了厚度超过50纳米的二氧化硅壳（经参考文献22授权改编，版权属于2009年，Wiley-VCH）。（b）用于多层细胞涂层的有机聚合物材料的SEM和TEM显微照片（经参考文献39授权改编）。（c）单个细胞被封装在金属-聚酚纳米壳内的示意图（经参考文献19授权改编，版权属于2014年，Wiley-VCH）。在这篇综述中，我们从合成生物学和材料科学的角度提供了关于cell@MOF、cell@COF和cell@HOF复合材料的研究概述。首先，我们讨论了用于生长无机外骨骼框架材料的两种合成策略（即一步法和多步法）背后的原理、细胞表面化学，以及评估涂层细胞活力的最佳实践。接下来，我们探讨了cell@MOF、cell@COF和cell@HOF复合材料的应用，包括细胞适应性、细胞疗法、生物催化和二氧化碳减排，并重点介绍了这些生物复合材料的制备和表征方法。然后，我们讨论了基于MOF、COF和HOF的无机涂层在制造合成细胞方面的潜力。最后，我们简要介绍了使用框架材料作为外骨骼来增强细胞功能的未来机遇和挑战，特别关注大肠杆菌（E. coli）或基因工程细菌在靶向治疗中的应用。这样的微生物可以被封装在MOF材料中，以增强其对癌症的治疗效果。这种方法旨在开发多种细菌@MOF生物复合材料，并探索它们在癌症免疫疗法中的潜在应用，特别是通过细菌介导的癌症疗法。

活细胞的涂层方法

用于制造cell@MOF、cell@COF和cell@HOF复合材料的主要合成方法有两种：（i）一步法细胞涂层（图3a）和（ii）多步骤细胞保护性封装策略（图3b）。在本节中，我们介绍了这两种合成方法的基础方面，并解释了本综述中讨论的所有人工孢子的实例。

图3

（a）一步法封装过程和（b）通过将预先形成的无机纳米颗粒沉积到细胞膜上形成的“SupraCell64结构”的示意图。

一步法封装策略

一步法要求生物实体在原位调节无机涂层的形成，模仿自然的生物矿化过程。这种一步法细胞涂层方法是通过将细胞悬浮液与MOF、COF或HOF前体的水溶液混合来实施的。类似于生物材料可以触发自然生物矿化，导致无机纳米颗粒沉积在其表面，活生物体也可以诱导MOF、COF或HOF材料在其表面自组装。在生物界面，两种主要驱动力促进了多孔涂层的生长：（i）成核的自由能和（ii）静电分子间相互作用。第一种可以由细胞引起的异质成核效应来解释：正如对无机纳米颗粒的观察所示，这些成核种子降低了扩展网络材料成核的能量障碍。根据经典晶体成核理论，形成球形晶体的自由能与体积贡献为负，而表面贡献为正，后者阻碍了晶体生长。细胞的存在为晶体生长提供了支架，从而减少创建新表面的需要，降低了结晶能量障碍。尽管经典成核理论指的是晶体材料，但在生物矿化中的实验证据，特别是在生物和仿生系统中，表明晶体形成可能经历一个无定形阶段，作为随后晶体结构的前体。第二种驱动力来自细胞表面与MOF/COF/HOF前体之间的静电相互作用。在这种情况下，等电点（即细胞不带净电荷的pH值）和合成环境（如pH值、离子强度）共同决定了合成过程中的净细胞表面电荷，通常由ζ-电位（ζ-potential）表示。细胞ζ-电位的大正值或负值（即>+30 mV或<−30 mV）将表明细胞在合成环境中带有大的正或负净电荷。同样，MOF/COF/HOF前体在合成环境中的净电荷也由它们的化学性质决定（例如，金属阳离子的电荷和有机配体的pKa）。对于MOFs，基于体外观察，已经广泛讨论了生物大分子与框架前体在多孔框架成核和生长中的静电相互作用的作用；而对于HOFs和COFs，相应的机制细节仍需进一步理解。实际上，关于MOF仿生矿化作用和生物大分子封装的研究表明，表面暴露的带电官能团的存在会降低ζ势，从而诱导相反电荷前体的局部过饱和，并最终触发MOF的成核。34,52–54 特定的细胞膜成分，如带负电的糖蛋白、肽聚糖和碳水化合物，促进了细胞与MOF金属前体之间的静电相互作用。34,52–55 这些相互作用被认为是驱动生物大分子以及细胞和病毒外表面非晶MOF层快速形成的主要因素。34,52–54 这种非晶相随后可以转化为结晶材料。16,56

值得注意的是，虽然静电相互作用和异质成核被广泛认为是框架壳层形成的主要驱动力，但目前缺乏直接在活细胞表面的实验数据来阐明框架生长的动力学。尽管如此，有一些观察结果支持这样的假设：从蛋白质系统获得的机制见解可以扩展到细胞上。特别是，带电蛋白质促进框架成核的能力被报道为一种与尺寸无关的现象，这与主要由界面电荷密度和局部配位化学控制的机制一致，而不是由用作成核种子的生物分子的尺寸决定的。52–54,57 从概念上讲，这种机制与为合成表面开发的成核策略一致，在这些表面上，带电的自组装层被用来控制基于框架的薄膜的生长；例如，在层状（LbL）方法中，自组装的单层提供了羧酸盐界面，使得能够形成均匀的MOF薄膜。58,59 与细胞界面概念上更接近的系统是蛋白质和脂肪酸薄膜：这些已被证明是对不同MOF涂层有效的成核系统。60,61 这些观察结果共同支持了这样一个观点，即带电的生物大分子，无论是作为单独的实体还是作为密集堆积的生物分子界面，都可以诱导框架的成核和生长。然而，直接验证这些分子级模型能否准确描述活体界面上非生物壳层的形成仍然是一个重大挑战，主要是由于尺寸限制。例如，尽管时间分辨小角X射线散射（SAXS）是一种研究蛋白质周围框架成核和早期生长的先进技术，但细胞的微米级尺寸超出了传统SAXS设备的可观察范围。54,57 因此，迫切需要开发可适应的现场表征技术，以弥合分子成核和细胞尺寸之间的长度尺度，从而超越外推模型，完全阐明细胞封装的机制细节。当目标细胞表现出低表面电荷密度时，自发且快速形成连续涂层更具挑战性。这一限制可以通过在细胞表面静电吸附带电的封盖剂（例如PDADMAC：聚二甲基二烯丙基氯化铵（+）/PAA：聚丙烯酸（−））来克服，62 以合成修改细胞表面的ζ势。62 在MOF前体存在的情况下，预先涂覆的细胞上带电基团的丰富性加速了非生物壳层在细胞表面的沉积。62

我们注意到，在封装过程中快速形成细胞涂层通常是最大化细胞存活率的关键条件：在快速壳层形成之后，可以最小化细胞暴露于金属阳离子、有毒连接剂和非生理pH条件的风险。相反，未经优化的涂层协议会延长细胞暴露于这些非生理环境的时间，通常会导致细胞损伤和存活率的丧失。23,63

一锅法封装策略的另一个局限性是其在不同类型细胞上产生具有可控厚度和均匀性的壳层的有限能力。例如，所报道的细胞和沸石咪唑酸盐框架-8（ZIF-8）复合材料（cell@ZIF-8）显示出不同的ZIF壳层厚度。通常，需要为特定的细胞批次定制协议；这包括根据细胞类型、细胞密度和所使用的特定介质进行优化。多步封装策略

布林克等人64开发了一种基于纳米粒子的一系列细胞涂层技术，可以应用于各种非生物材料，包括陶瓷（例如SiO2和Fe3O4）和MOFs（例如MIL-100和ZIF-8）。这种方法依赖于细胞表面蛋白质与纳米粒子（NPs）之间的静电相互作用。通常，NP-细胞相互作用会导致NPs在活细胞周围积聚，随后通过吞噬作用或微胞饮作用过程被细胞内化（图3b）。64 这种NP与细胞之间的界面相互作用表明，如果抑制NPs的内化机制，NP可以用于细胞封装。通过促进粒子间的超分子相互作用可以抑制内化途径。因此，与仿生矿化方法不同，在多步策略中，MOF前体在没有目标细胞的情况下预先混合，生成MOF NPs的胶体溶液。然后，加入细胞并在含有单宁酸（一种促进粒子间结合的添加剂）的预合成MOF NPs的胶体悬浮液中孵育细胞。细胞膜与NPs之间的非共价相互作用（例如，金属-磷酸盐）促进了这些粒子在细胞壁周围的积聚。单宁酸能够促进强效的多价金属-酚类复合作用，导致粒子间的结合。这一过程在单个细胞周围形成连续的NPs涂层。通过设计NP吸附到细胞的过程并选择适当的添加剂用于粒子间结合，可以成功地抑制MOF纳米粒子的内化，从而形成基于MOF NPs的保护性非生物涂层。到目前为止，我们已经描述了细胞涂层的基本标准和通用方法。在接下来的章节中，我们将进一步探讨不同细胞表面属性如何控制细胞与非生物涂层之间的亲和力。细胞类型

所有活细胞都用DNA编码它们的遗传信息，并被半透性的脂质双层所包围——在原核生物中称为细胞质膜，在真核生物中称为质膜。原核生物和真核生物在几个基本方面有所不同。例如，真核细胞有一个将DNA与细胞质分隔开的细胞核，而原核细胞缺乏核膜。原核细胞通常比真核细胞更小、更简单（例如，原核细胞不含有细胞器或复杂的细胞骨架），并且它们的基因组更小、更简单。细胞还可以根据它们是否能够以单细胞形式存在（如微生物）或仅存在于多细胞生物的组织中（如大多数高等真核生物）来进行分类。微生物，包括细菌、古菌、原生动物、藻类或真菌，除了细胞膜之外还产生细胞壁。细胞壁作为许多微生物和一些多细胞生物（例如植物细胞）的外保护层。除了保护作用外，由多种生物聚合物组成的细胞壁还提供了结构上的 cohesion。细胞壁的具体组成和结构因物种而异，我们将在下文更详细地讨论。关于合成封装方法，这些最外层的细胞成分作为MOF、HOF或COF前体/粒子结晶/积累的主要界面，指导生物界面上非生物层的形成。细菌及其细胞表面

细菌是单细胞的原核微生物。根据它们膜和细胞壁的组成和结构，细菌被区分为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。65

革兰氏阴性细菌被两层膜包围，内层（细胞质）和外层膜，两者之间由称为周质的空间分隔。周质由一层薄的肽聚糖组成，提供了一个独特的还原环境，这使得蛋白质的氧化、折叠和质量控制更加高效和多样化。66 革兰氏阴性细菌的外膜是一种不对称的双层膜，内层由磷脂组成，外层由脂多糖（LPSs）组成。67 由于LPSs部分磷酸化，磷酸基团赋予了净负电荷。68 最著名的革兰氏阴性细菌例子是大肠杆菌（E. coli）。E. coli定植于人类和哺乳动物的肠道，在分子生物学和生物技术领域用于DNA克隆和重组基因表达的模型生物。69 这种细菌的核心优势是简单的培养条件和快速生长，以及完善的基因工程工具。因此，E. coli经常被选为新技术的基准，并且也是最早用于MOF封装实验的细菌之一。70 另一个相关的革兰氏阴性细菌例子是Pseudomonas putida（P. putida），这是一种耐溶剂细菌，可以用作两相发酵系统中精细化学品合成的生物催化剂。71 这两个例子都显示出在中性或略微酸性条件下带负电的表面。例如，不同的E. coli菌株在pH 7.4的150 mM磷酸盐缓冲液（PBS）中的ζ势范围从-4.9 mV到-33.9 mV不等。72 对于P. putida，在略微酸性的条件下，ζ势通常接近-30 mV（例如，在1 mM NaCl中的-27.4 mV）；73 在pH 6.2的10 mM KNO3中的-30 mV。71

与革兰氏阴性细菌不同，革兰氏阳性细菌的细胞壁由一层厚的肽聚糖组成，这层肽聚糖围绕着细胞质膜，肽聚糖上装饰有磷壁酸、多糖和蛋白质。74 由于磷壁酸带有负电荷，革兰氏阳性细菌的细胞表面也显示负电荷。75 革兰氏阳性细菌的例子包括嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和Moorella thermoacetica（M. thermoacetica）。嗜酸乳杆菌CRL 640是一种革兰氏阳性细菌，其ζ势约为-45 mV。76 Oh等人对E. coli和S. aureus的ζ势进行了直接比较，计算得出分别为-37.1 mV和-12.7 mV。77

总之，尽管革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的细胞壁结构和组成有所不同，但在生理条件下，细菌通常表现出负表面电荷。78



真核生物及其细胞表面

真核细胞表现出多样的表面结构，这些结构在维持细胞完整性、调节与环境的相互作用以及介导生化过程中起着关键作用。本节将探讨真菌、哺乳动物和植物细胞表面的独特特性，说明它们的不同组成和功能。真菌细胞的细胞壁由葡聚糖、几丁质和糖蛋白组成。在大多数真菌物种中，细胞壁是分层的。最内层通常由共价连接的、分支的（1,3）-β葡聚糖和3%到4%的几丁质组成，这些成分聚集形成纤维状微纤丝，为细胞提供了抵抗细胞质和膜所施加的巨大内部压力所需的强度。79 壁的外层往往更加多样化，且根据特定真菌的生理需求进行定制。在酿酒酵母（S. cerevisiae）中，（1,3）-β葡聚糖和（1,6）-β葡聚糖与细胞壁最外层的甘露蛋白相连，这被认为控制着细胞壁的孔隙率，从而控制着物质传递。80 酵母表面由于甘露蛋白中的磷酸盐而带负电。81 S. cerevisiae细胞表面的ζ势值取决于生长阶段和有氧或无氧培养条件：在后期生长阶段（从-10 mV降至-20 mV），以及在无氧条件下（从-18 mV降至-26 mV）。82 单细胞测量显示死细胞的存在与ζ势的降低有关，这可能是由于细胞壁受损。此外，观察到S. cerevisiae会向培养上清液中释放大量酸，这进一步导致了ζ势的降低。Rogowska等人也报告了类似的发现。83 在pH 2–6的区间内，ζ势值从-3 mV降至-18 mV，而在pH > 7时，测量值在-19 mV到-20 mV之间。83

植物细胞的细胞壁分层排列，包含纤维素微纤丝、半纤维素、果胶和可溶性蛋白质，而确切的组成强烈依赖于细胞类型。84 通常，这些成分组织成三层主要层：最内层的次级细胞壁（仅存在于特化的、分化的植物细胞中）、初级细胞壁和最外层的中间层。次级细胞壁由三层组成，通常称为S1、S2和S3，主要包含纤维素、半纤维素和木质素。初生细胞壁是最厚的一层，其成分与次生细胞壁相似，但含有更多的果胶。中间层主要由果胶多糖、木质素以及少量蛋白质组成，起到连接相邻细胞初生细胞壁的作用。在研究过程中，常用的被称为原生质体的球形细胞，其细胞壁通过机械方法或消化酶被去除。去除细胞壁后，原生质体仅被质膜包围和保护。尽管原生质体通常对外部压力比正常细胞更敏感，但它们具有多种优势，例如单细胞的操作更加简便、易于进行基因操作，并可用于筛选实验和单细胞显微镜观察。已经测量了多种植物细胞原生质体的ζ电位，例如大麦叶、烟草叶和蛇根草培养细胞原生质体的ζ电位，它们的表面ζ电位通常在-6到-28 mV之间。与真菌和植物细胞不同，哺乳动物细胞没有细胞壁，而是被一层富含碳水化合物的密集凝胶状网络——糖萼所保护，这层网络覆盖在它们的质膜上。糖萼构成了防止病原体等纳米颗粒进入细胞的物理屏障，它由多种蛋白聚糖、糖胺聚糖、糖脂和血浆蛋白组成，对这些物质的细胞黏附和信号传导非常重要。哺乳动物细胞缺乏细胞壁使它们对渗透压和剪切力的变化更加敏感。在生理pH值下，哺乳动物细胞的表面电荷通常是负的。在pH 7.4时，不同类型细胞的ζ电位范围很广，HeLa细胞的ζ电位为-19.4 ± 0.8 mV，而红细胞的ζ电位为-31.8 ± 1.1 mV。将细胞暴露在45°C下30分钟后，65%的细胞发生了细胞凋亡和坏死，ζ电位从-19 mV下降到-25 mV；研究人员认为这可能是由于细胞表面磷脂磷脂酰丝氨酸含量增加所致，而磷脂酰丝氨酸被认为是细胞凋亡的早期标志物。在另一项研究中，测量了不同固定细胞的ζ电位。通过使用固定剂（如甲醛）处理细胞可以实现细胞固定，这种处理可以迅速杀死细胞、防止自溶，并尽可能真实地保存细胞结构，从而适用于各种染色和显微镜分析。CytoRich Red固定的细胞表面电荷较低（-30 mV至-50 mV），低于活细胞的电荷（详见表1）。

表1 不同细胞的实验表面净电荷（ζ电位）

| 细胞类型 | 实验条件 | 参考文献 |
|--------|---------|--------|
| 大肠杆菌 | 1 mM NaCl | 91 |
| 普巴顿菌 | 1 mM NaCl | 73 |
| 金黄色葡萄球菌 | 1 mM KCl | 77 |
| 好酸乳杆菌 | 1 mM NaCl, pH 7.4 | 76 |
| 酵母 | 5 mM NaNO3, pH 2–11 | 83 |
| 烟草叶片原生质体 | 0.01 M KCl, 0.6 M蔗糖, 6.7 mM磷酸钠缓冲液 (pH 5.8) | 87 |
| 大麦叶片原生质体 | 0.6 M山梨醇, 磷酸钠缓冲液 (pH 5.6) | 92 |
| HeLa细胞 | PBS (1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) | 89 |
| 红细胞 | PBS (1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) | 89 |
| 多种固定的人类细胞系 | 固定细胞重新悬浮在超纯水中 | 90 |

在介绍了不同类型的细胞及其表面组成和电荷之后，接下来我们将讨论研究细胞活力的各种方法。这些知识对于评估细胞的非生物涂层和指导该研究领域的未来发展至关重要。

细胞活力反映了细胞在一定时间范围内维持代谢活性和结构完整性的能力。通常，细胞活力被定义为样本或群体中活跃增殖或分裂的细胞数量，因此它是许多生物学和生物医学应用中的重要参数。在细胞封装的背景下，活力测定常用于确定封装后的细胞存活情况，或评估封装细胞对有毒化学物质（如抗生素）或物理应力（如高温、极端pH值或辐射）的抵抗力。细胞活力测定方法可以分为直接测量分裂细胞数量的方法（如平板计数法）和间接测量细胞活力的方法（如染料转化或代谢关键中间产物的定量）。由于细胞的复杂性及其基础代谢过程，量化细胞活力可能并不总是容易的，结果可能取决于所使用的测定方法。目前有多种技术可用于评估细胞活力（见表2），包括（i）菌落形成单位的计数，（ii）膜通透性测定，（iii）代谢活性测试，（iv）腺苷三磷酸（ATP）的发光测量，（v）线粒体功能测定以及（vi）包含染料的评估。

表2 细胞活力测定方法的比较

| 测定方法 | 原理 | 优势 | 缺点 | 适用细胞类型 | 参考文献 |
|------------------|------------------------------|------------------------------|------------------------------|-----------------------------------------|
| 平板计数法 | 基于固体培养基上的菌落形成来检测活细胞 | 简单、快速、成本低 | 限于能形成独立菌落的生物 | 好酸乳杆菌；婴儿双歧杆菌 | 95 |
| ZIF-8 | 适用于广泛的微生物 | 需要时间 | 提供样本中活细胞的直接量化 | 短杆菌 | 95 |
| | 不适用于多细胞类型 | | | | |
| 膜通透性测定 | 测量物质或底物通过细胞膜的通透性 | 快速且高度敏感 | 基质成分可能影响酶活性 | 普巴顿菌 | 108 |
| | 对核酸具有高特异性 | | | | |
| | 细胞凋亡时仍保持膜完整性 | | | | |
| | 与流式细胞术和荧光显微镜兼容 | | | | |
| ATP发光测定 | 测量细胞内ATP水平 | 快速、信号输出稳定且灵敏 | ATP水平可能因细胞类型或微生物而异 | 好酸乳杆菌；HeLa细胞 | 123 |
| | 高特异性 | ATP浓度受生长条件影响 | | | |
| | 适用于高通量筛选 | | | | |
| 代谢测定 | 测量细胞代谢途径的活性 | 简单、快速且经济 | 结果可能受细胞生理状态影响 | 神经干细胞 | 33 |
| | 适用于多种细胞类型 | 易受还原剂和ROS清除剂干扰 | | | | |
| 流式细胞术 | 可同时分析单个细胞的物理和化学特性 | 需要昂贵的设备 | 不需要染色 | 某些染色剂对EDTA敏感 | | |
| | 提供灵敏的比率计探针 | | | | | |
| | 与多种荧光染料兼容 | | | | |
| 线粒体测定 | 测量线粒体膜的完整性或膜电位 | 提供细胞能量状态的见解 | 需要活细胞（无法固定细胞） | | |
| 染料排除法 | 评估细胞膜的完整性 | 简单快捷 | 容易高估或低估细胞数量 | | | |
| 细胞计数法 | 统计活细胞的数量 | 基于细胞在营养丰富培养基上的生长和分裂能力 | | | |

细胞计数是微生物学中的经典技术，它依赖于细胞在营养丰富培养基上的生长和分裂能力。当细胞悬液铺展在固体表面时，只有正在增殖的细胞会进行二分裂并最终形成可见大小的菌落，这些菌落被称为菌落形成单位（CFU）。因此，CFU直接反映了样本中活跃分裂细胞的数量。然而，值得注意的是，包括大肠杆菌（EHEC菌株）在内的多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌可以在休眠状态下存活并表现出生理活性，但不会显著生长。Wei和Yuan的研究是在使用乙二胺四乙酸（EDTA）去除MOF壳后，通过活细胞计数来确定封装在ZIF-8生物矿物化隔室中的细菌株（好酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌亚种以及短杆菌）的活力。结果发现，好酸乳杆菌和短杆菌的CFU数量仅略有减少，而婴儿双歧杆菌的活力下降了2到4个数量级。Luzuriaga的研究调查了封装在多晶ZIF-8壳中的大肠杆菌的活力，通过用500 mM醋酸钠缓冲液处理去除ZIF-8壳后，发现细胞无法形成可见菌落，表明在封装和/或与ZIF-8壳结合过程中细胞被失活。光学密度（OD）测量是一种替代方法，经济且快速，可用于定性和定量地测量液体培养基中细胞数量的变化。该方法基于细胞散射可见光的原理，通常使用波长为600 nm的紫外-可见光谱仪。散射光的程度，即透射率的变化，与样本中细胞的密度（单位体积的细胞数量）成正比。Gan使用这种方法评估了从ZIF-8和ZIF-C壳中释放出的酵母细胞的生长情况。尽管这种方法不能直接测量ZIF复合体中的细胞活力，但它显示，暴露于外部应激下的包覆细胞在进入指数生长阶段之前有一个较短的延迟期。Li的研究表明，封装在ZIF-90中的大肠杆菌细胞可以释放并保持活力。去除ZIF壳并转移到营养丰富的LB培养基后，细菌生长得以恢复，尽管指数生长的开始有所延迟。Ji使用细胞计数法确定了封装在厚度为1–2 nm的MOF壳中的光合厌氧菌Moorella thermoacetica的生长情况，结果发现包覆细胞的生长曲线与自由细胞完全相同。作者使用超分辨率3D结构照明显微镜（3D SIM）直接观察了MOF包覆细胞的细胞分裂情况，发现封装细菌在含氧氛围中的生长速度比自由细胞快。流式细胞术是一种可以同时分析悬浮在液体培养基中的单个细胞的物理和化学特性的技术。当这些细胞穿过激光束时，它们会散射光线，如果用荧光标记物标记的话，就会发出荧光信号。散射和发出的光会被检测并分析其各种特性，如大小、颗粒度以及特定分子的存在，从而提供关于单个细胞特征的详细见解。这些参数有助于了解分析的细胞群体中的细胞分布和存活情况。除了基于散射的测量外，用各种可以被激光激发的荧光染料标记细胞大大扩展了流式细胞术的用途。例如，比率膜探针F2N12S**在与健康细胞的膜结合时会产生绿色荧光（λexcitation = 405 nm；λemission = 530 nm）。当细胞发生凋亡时，膜电位的变化（即细胞内外的电位差）会导致发射波长红移至585 nm。两种发射峰值的比率可以定量和定性地估计细胞的存活情况。流式细胞术可以结合多种染料和染色技术，正如Kessel等人详细阐述的那样。在接下来的部分，我们将讨论在细胞封装和包被背景下经常使用的方法。

膜通透性检测是基于在死亡细胞中发生的膜完整性变化。通过测量某些分子穿透细胞膜的能力来评估细胞的存活情况。这种方法使用与细胞内成分相互作用的荧光或比色染料。通常，这些检测是通过结合排斥染料和包含染料来进行的，排斥染料可以穿透有缺陷的膜，而包含染料可以穿透完整的膜。然而，膜通透性并不一定反映细胞的代谢活性，因为膜完整性也可能受到生长条件的影响，如生长阶段或环境压力，这可能导致在某些情况下低估或高估细胞的存活情况。在哺乳动物细胞中，膜通透性检测通常会通过额外的方法来区分坏死和凋亡，因为这两种过程在细胞反应中起着不同的作用。凋亡是一种高度保守的、受控制的、程序性的细胞死亡。相比之下，坏死是一种由外部损伤（如毒素或环境压力）引起的非控制过程，并与病理反应相关。重要的是，在坏死细胞中，细胞膜完整性丧失，但在凋亡的早期阶段通常得以保持；因此，凋亡细胞可能不会被许多排斥染料检测到。这种区别在选择染色方法时至关重要。

碘化丙啶（PI）是一种广泛使用的膜通透性探针，作为一种排斥染料来标记死亡细胞。PI无法进入具有完整质膜的活细胞，但可以轻易渗透到膜完整性受损的死亡或濒死细胞中。一旦进入细胞内部，带正电的PI会与双链核酸发生定量结合。在488nm的激发波长下，PI结合的DNA复合物会在550nm的发射波长下表现出荧光，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞术来量化非活性细胞。然而，根据生长状态的不同，这种方法可能会产生高比例（高达40%）的假阳性结果，特别是在细胞生长的早期指数期。活细胞对PI的高吸收与细胞分裂和生长过程中细胞壁重建导致的暂时性膜不稳定性有关，这可能允许染料渗透活细胞。

排斥染料通常与包含染料一起使用，后者具有非重叠的荧光谱，并且可以穿透活细胞的完整膜。一种常用的染料是SYTO9，它可以进入活细胞和死亡细胞，并在结合DNA（λexcitation = 485 nm；λemission = 498 nm）或RNA（λexcitation = 486 nm；λemission = 501 nm）时表现出增强的荧光。SYTO9经常与PI一起用于活/死染色，因为这两种染料具有不同的荧光特性。此外，PI对DNA的亲和力高于SYTO9；因此，在细胞内同时存在这两种染料的情况下，SYTO9会被置换。SYTO9染料的一个已知限制是它们穿透革兰氏阴性细菌细胞壁的能力有限，这取决于它们的组成或从细胞中的主动输出。

Permyakova等人使用SYTO9和PI的荧光染色来区分封装在MIL-100(Fe)中的活细胞和死亡细胞。这种染色方法允许在封装了MIL-100(Fe)外骨骼的情况下定性评估活细胞与死亡细胞的比例。在优化条件下，大多数封装的细胞显示出完整的细胞膜。通过细胞计数，Yuan等人显示ZIF-8涂层适度降低了B. breve细胞的存活率。然而，使用PI和SYTO9进行活/死染色后，在去除ZIF-8壳层后，细胞壁显示出明显的损伤。这种损伤也从生长曲线中可以看出：与未经处理的B. breve细胞对照组相比，接种这些细胞到生长培养基后指数生长的开始显著延迟。这项研究强调了使用不同存活方法组合的重要性，以获得对封装方法对细胞存活影响的更全面理解。另一种用于检测活细胞或早期凋亡细胞的对比染料是Acridine Orange，它可以穿透完整膜并在结合DNA时产生绿色荧光（λexcitation = 502 nm，λemission = 525 nm）。这种染料的缺点是需要洗涤步骤来去除未结合的染料，因为结合DNA后其荧光强度并没有显著增强。Qin等人使用结合了溴化乙啶/Acridine Orange的染色法来评估热、活性氧、紫外线辐射和蛋白酶对封装在铜金属-有机多面体（MOP）水凝胶中的S. cerevisiae细胞的影响。在这项研究中，作者通过荧光显微镜显示，封装降低了细胞@MOP复合物在暴露于上述物理、化学和生物应力后的死亡细胞百分比。

代谢检测广泛用于评估细胞存活情况。使用这些方法，具有完整代谢功能的活细胞在添加特定底物时会产生可测量的荧光或比色信号，这可以与活细胞数量相关联。相反，死亡或濒死的细胞由于代谢受损，其转化率降低或完全停止。这样的检测可以在常规的分光光度计或平板读取器中进行，这些设备在生化或生物实验室中很常见，因此也可以用于高通量格式。细胞存活的一个优秀指标是还原型烟酰胺辅因子（NADH或NADPH）的存在，它们是代谢的关键成分。有几种选择性的四唑染料可用于通过细胞内NAD(P)H依赖的氧化还原酶的活性间接评估这些辅因子的浓度。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）是一种广泛使用的带正电荷的底物，可以轻易穿透细胞壁。它通过一个未知的NAD(P)H依赖的代谢过程转化为不溶性的formazan，经过溶解步骤后可以在570nm处进行分光光度测量，从而提供细胞存活的定量指标。MTT的衍生物，如MTS（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑）、XTT（2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-羧酰胺）或WTS（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑），带有负磺酰基团，会释放可溶性的formazan衍生物。然而，由于这些染料的净负电荷，它们无法穿过细胞膜。为了克服这个问题，在检测中加入了电子载体，如PMS（5-甲基-phenazinium甲硫酸盐）或PES（phenazine乙硫酸盐）。这些载体通过在细胞质和染料之间穿梭电子来促进formazan的还原，产生可通过光谱法测量的可溶性formazan产物。

我们注意到，在某些生长条件下，细胞可能会进入一种休眠状态，在这种状态下它们表现出大幅降低的代谢活性但保持存活。因此，检测需要仔细控制反应条件，包括染剂的浓度和培养时间。检测的结果可能受到所使用的微生物菌株的生理状态的影响。基于四唑的检测容易受到各种干扰，如Grabowiecka及其同事所回顾的。例如，培养基中MTT的非特异性还原和自由基清除剂的存在可能会干扰检测并影响结果。此外，含有铜(II)的复合物的存在也会影响formazan的原始吸收。需要注意的是，在将细胞封装到MOFs和其他配位化合物（例如MOPs）中的实验中，阳离子的存在可能特别重要。Yu等人使用市面上可购买的CCK-8（细胞计数试剂盒-8）存活检测来评估HOF封装的神经干细胞的存活情况。这种比色检测基于四唑盐WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑）的还原，它被转化为水溶性formazan衍生物。在这种情况下，封装对细胞的生物活性影响很小。同样的检测也被用来确定封装在ZIF-8框架中的“ZIFSpermbots”的存活情况，这些“ZIFSpermbots”由精子组成。

Ohtani等人使用细胞计数试剂盒-8来评估中国仓鼠卵巢K1细胞（CHO-K1）对氰化物桥接的2D配位聚合物（CPs）的存活情况，这些聚合物由金属离子和网络金属复合脂质组成。当受到40 µM NiCl2的挑战时，这些细胞保持了超过90%的存活率，但在金属复合脂质（即10 µM (dabco-(CH2)15-CH3)2[MnN-(CN)4]）的存在下存活率下降了50%。四唑衍生物MTS（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑）被用来确定封装在ZIF-8中的乳腺癌细胞系（MDA-MB-231细胞）的存活情况，结果显示培养6小时后存活率约为75%。

Calcein acetoxymethyl ester（calcein-AM）是另一种常用的非荧光代谢标记物，它可以被动穿过完整细胞的膜。在细胞内部，它被非特异性的酯酶酶解成酸性的、不透膜的calcein（λexcitation = 494 nm；λemission = 517 nm），从而产生强烈的绿色荧光。Calcein-AM经常作为代谢活性的指示剂，并作为一种包含染料用于活/死荧光染色中可视化活细胞。它经常与PI一起使用。例如，Yu等人使用PI和calcein-AM的差异染色来可视化HOF封装的神经细胞的存活情况。同样，双重calcein-AM/PI活/死染色也被用来评估封装在MOF中的癌细胞的存活情况。Chen等人使用WST-8染料和calcein-AM染色来显示封装在ZIF-8框架中的“ZIFSpermbots”大部分仍然存活，而细胞生长被抑制。Yan等人使用无色探针荧光素醋酸酯（FDA）来确定封装在ZIF-8中的大肠杆菌细胞的存活情况。在代谢过程中，这种化学物质被水解酶切割，从而释放出高荧光的荧光素。促进这种切割的酶是非特异性的酯酶、脂肪酶或蛋白酶。在这项研究中，作者没有观察到封装的大肠杆菌细胞在存活率上的差异。同样，Chen等人使用FDA方法结合CFU计数和生长曲线来评估不同ZIF-8壳层封装后的大肠杆菌和S. cerevisiae的存活情况。Falcaro及其同事也使用FDA来监测封装在β-半乳糖苷酶/ZIF-8壳层中的S. cerevisiae细胞的随时间变化的存活情况。在某些情况下，利用细胞自身产生的荧光蛋白来评估封装在ZIF-90中的细胞的活性。Li等人封装了重组产生荧光报告蛋白mCherry的大肠杆菌细胞。然而，在MOF封装之前必须诱导蛋白质表达，因为诱导剂（异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃苷，IPTG）无法渗透分子筛分膜ZIF-90。因此，存活和非存活细胞都可能显示荧光，无法确定封装的存活细胞的比例。另一种存活检测基于细胞内ATP的定量，ATP是活细胞中的主要化学能量载体。ATP因各种合成和分解过程而不断合成和消耗，其浓度是细胞代谢和生理状态的指标。在细胞死亡开始时，ATP水平通常会下降，因为细胞失去了补充ATP的能力。可以使用含有萤火虫萤光素酶（firefly luciferase）的商业试剂盒来定量ATP水平。121 在这些测定中，首先将细胞裂解以释放细胞内的ATP，然后将得到的裂解液与萤光素酶溶液混合。萤光素酶催化ATP和O2依赖性的转化，将萤光素（luciferin）转化为氧萤光素（oxyluciferin），产生与样品中ATP浓度相关的发光信号，从而反映细胞的整体活力。为了确保ATP的准确定量，在存在ATP酶抑制剂的情况下使用洗涤剂裂解细胞，以防止酶促的ATP耗尽。几种市售试剂盒采用了工程化的、稳定的萤光素酶系统，产生的发光信号可以持续数小时。ATP测定通常快速完成，整个操作过程只需几分钟，并且可以以高通量格式进行，包括1536孔板的配置。110 此外，ATP测定可以检测到少至20个细胞，而MTT测定则需要至少约25,000个细胞。97 需要注意的是，不同细胞类型和微生物菌株的ATP浓度可能会有所不同，这也可能受到细胞生理状态的影响。由于ATP测定依赖于酶活性，因此需要仔细考虑培养基的组成，以避免抑制萤光素酶。总体而言，ATP测定提供了一种可靠且敏感的方法来评估细胞活力。最近引入的一种ATP测定变体允许实时评估细胞活力。在这种方法中，向样品中加入一种可透过膜的萤光素前体。前体被酶转化为萤光素后，会扩散到培养上清液中，并进一步被萤光素酶转化为发光信号。122

此前，已有几种市售的ATP定量试剂盒（如CellTiter-Lumi Plus荧光细胞活力测定试剂盒和CellTiter-Glo细胞活力试剂盒）被用来监测包封在MOF（金属有机框架）中的哺乳动物细胞的活力，125 以及测试各种细胞系（包括人宫颈癌细胞系（HeLa）、人肺腺癌细胞系（A549）、人乳腺癌细胞系（MCF-7）和小鼠黑色素瘤细胞系（B16）在ZIF-8中的耐受性，ZIF-8已被提出用于冷冻保护应用。124 例如，基于ATP的活力测量表明，包封在ZIF-8中的哺乳动物细胞系如HeLa、A549、人前髓细胞白血病（HL-60）和小鼠巨噬细胞Raw 264.7的活力约为90%，并且这些测定还用于确定细胞的pH值和紫外线耐受性。64

另一类用于研究细胞活力的测定方法是线粒体测定。线粒体是细胞能量代谢的核心真核细胞器。通过氧化磷酸化，线粒体消耗氧气同时产生ATP作为主要的代谢能量载体。因此，线粒体的功能状态可以作为细胞活力的指标，并可以通过特异性靶向线粒体的染料来进行评估。122 市售的线粒体膜电位测定试剂盒使用阳离子、亲脂性染料（如JC-10），这种染料会在线粒体中积累并形成聚集体。在这种状态下，JC-10会产生红色荧光（激发波长=570–590纳米）。126 在细胞凋亡过程中，该染料会扩散到细胞质中，形成单体状态，导致发射波长转移到520–540纳米，并出现绿色荧光。126 另一种方法是使用calcein-AM与CoCl2的组合来评估线粒体膜的完整性。calcein-AM容易被细胞内的酯酶切割，产生的荧光可以被细胞质中的CoCl2轻易淬灭。在完好的细胞中，荧光保留在线粒体内，从而可以选择性地评估线粒体膜的完整性。迄今为止，只有少数研究应用线粒体测定来评估包封在MOF中的细胞的活力。例如，Wang等人证明了线粒体染料JC-1可以用来量化包封在ZIF-8中的线粒体（Mito@ZIF-8）的膜电位。127 虽然自由线粒体的膜电位在分离后迅速下降，但Mito@ZIF-8样本保持了相对稳定的膜电位，并且在48小时内持续产生ATP。这些结果表明JC-1测定在评估包封细胞活力方面的潜力，提供了一种敏感且定量化的方法，可以扩展现有的评估真核细胞活力的工具。特别是，像JC-1这样的线粒体染料可以在细胞膜受损之前检测到细胞死亡的早期迹象。这种测定受线粒体的形状、大小或密度等因素的影响较小，而这些因素可能会影响单组分测定中的荧光强度。128 然而，研究人员应仔细评估实施的潜在障碍：这些障碍主要可能来自框架壳体的特定多孔性质，这可能会限制测定试剂的扩散。此外，许多框架材料（如ZIF-8）在酸性或富含磷酸盐的环境中化学不稳定，可能与典型的标准代谢测定协议不兼容。此外，多孔壳体可能引入的光散射或背景自荧光可能会干扰JC-1等探针所需的精确比率读数。其他排除性染料

锥蓝染色是一种常用的技术，用于评估活细胞与死细胞的比例。129 将锥蓝染料加入细胞悬浮液中后，染料会在细胞膜受损的死细胞或濒死细胞内积累。相反，染料无法穿透完整细胞的细胞膜，因此这些细胞保持未染色状态。可以使用细胞计数室在显微镜下计数染色和未染色的细胞。锥蓝染色是一种简单且廉价的技巧，在细胞生物学和免疫学中广泛应用。129 其他常用的针对细胞质结构的染色剂包括伊红（eosin）、刚果红（Congo red）和 erythrosine B。Erythrosine B染色基于染料能够扩散到细胞膜受损细胞质中的能力，在那里它与碱性蛋白质结合。存活的细胞保持未染色状态，而死细胞或濒死细胞则呈现粉红色。刚果红是一种磺化偶氮染料，可以与细胞质中的淀粉样蛋白结合。130 伊红是荧光素的衍生物，是一种酸性染料，与碱性细胞成分结合。130 结合后，它保持粉红色。到目前为止，这些染料还没有被用于评估包封在MOF（金属有机框架）中的细胞的活力。以下部分建立了人工孢子、细胞类型和活力评估方法的基本原理，并总结了材料和涂层策略的当前进展，提供了对所报道的协议的详细见解。材料和涂层方法

最初的细胞封装研究集中在使用溶胶-凝胶方法制备多孔SiO2或TiO2的刚性细胞外骨骼。4,17,22,123 这些典型的氧化物基底壳层可以保护细胞免受机械应力的影响，同时允许环境与被包裹细胞之间的物质传递。尽管这些氧化物满足了选择透过性和耐久性等关键要求，但它们的化学稳定性使得控制降解变得具有挑战性，尤其是在不影响细胞活力的情况下。在工程化其他无机纳米粒子（如二氧化锰）方面取得的有趣进展可以转化为保护性壳层，因为MnO2纳米粒子可以通过谷胱甘肽（GSH）暴露来降解。然而，需要进一步的研究来探讨MnO2用于细胞涂层的优缺点。131 因此，无机纳米粒子的固有化学稳定性可能显著限制它们在需要控制细胞释放的特定生物技术应用（如细胞治疗）中的使用。为了解决这些挑战，当前的研究重点在于开发满足人工孢子形成所有四个标准的人工涂层（见上文）。正在密集研究多种天然和合成材料，以在保持细胞兼容性的条件下制造可降解的外骨骼。例如，基于多糖的涂层如淀粉、壳聚糖和海藻酸盐可以通过酶作用降解，132 使它们成为细胞治疗的理想候选者。此外，最近的研究将有机和无机材料的特性结合在混合涂层中。Caruso等人展示了在S. cerevisiae细胞上使用Fe3+和单宁酸自组装金属-有机涂层。这些金属-有机涂层在机械上稳定，但可根据需要降解，因此满足人工孢子形成的标准。通过选择适当的构建块，可以控制化学性质，如壳层功能化、自组装条件和降解性。在这些发展的基础上，三类微孔材料作为封装活细胞和脆弱生物分子的有希望的选择出现：MOFs（金属有机框架）、COFs（碳有机框架）和HOFs（氢有机框架）。31,33 MOFs由通过多点有机连接剂连接的无机簇组成，35,36 而COFs和HOFs分别通过共价和氢键相互作用组装而成。93 通过仔细选择分子构建块，可以微调这些材料的稳定性、孔隙率、晶体 phase 以及化学和结构性质。涂层的微孔性质提供了选择性的屏障，允许小分子（如葡萄糖和氧气）的传输，同时防止细胞膜与细胞毒性大分子（如胰蛋白酶和溶菌酶）接触。16 这些涂层还可以根据需要使用化学刺激（如MOFs的螯合剂或pH变化）31,56,134 或物理刺激（如HOF复合材料的光）33 进行降解。

尽管后合成修饰方法在该领域尚未得到广泛测试，但它们有潜力进一步扩大这些涂层的化学多功能性。114 鉴于MOFs、COFs和HOFs的特性，它们代表了开发类人工孢子系统的有希望的材料。已经使用了两种主要方法来制造cell@MOF和cell@HOF复合材料：（i）一锅法涂层策略和（ii）多步骤细胞保护封装策略。

细胞@壳层：一锅法封装

一锅法封装微生物：开创性的例子

通过一锅法封装微生物时，研究最广泛的MOF是沸石咪唑酸盐框架-8（ZIF-8）。这种材料由Zn2+阳离子通过2-甲基咪唑（mIM−）连接剂四面体排列而成。19 ZIF-8可以在温和的反应条件下合成，例如在水溶液和室温下。通过修改合成条件（如前体浓度、金属与配体的比例以及大分子的存在和类型），可以调节ZIF-8的拓扑结构。例如， sodium型拓扑（sod ZIF-8）是一个扩展网络，孔径为3.4 Å，孔径为11.6 Å。19 其他具有相同分子式Zn(mIM)2的拓扑结构也可以实现，包括diamondoid型（dia ZIF-8）、katsenite型（kat ZIF-8）和ZIF-L型。135 此外，Zn2+和mIM−在碳水化合物、蛋白质和细胞存在下的自组装可以形成具有不同化学组成的其他晶体材料。136 例如，观察到溶液中的其他阴离子（CO32−和OH−）可以替代部分mIM−分子，从而形成Zn2(mIM)2CO3（ZIF-C）56和Zn3(mIM)4OH（ZIF-EC1），而其他观察到的相（如U12）尚未解析。137 晶体排列（拓扑或相）和化学组成影响给定MOF的孔隙率、化学稳定性和疏水性。56,137,138 因此，Gan等人展示了不同的基于ZIF的细胞涂层将提供独特的性质。16 尽管所有基于Zn-咪唑酸盐的系统在暴露于酸性条件（pH < 6）、螯合剂（如EDTA）和某些缓冲溶液中时都会降解。139

2016年，Falcaro及其同事报告了在ZIF-8外壳中一锅法封装S. cerevisiae和Micrococcus luteus（M. luteus）的方法（图4a）。120 细胞涂层是通过将醋酸锌水溶液与预先混合的细胞和2-甲基咪唑（HmIM）水分散液混合而形成的。10分钟后，通过离心回收涂层细胞，并用去离子水（DI water）洗涤。X射线衍射（XRD）分析确认形成了具有sodalite拓扑的ZIF-8（sod ZIF-8），扫描电子显微镜（SEM）图像显示单个细胞被包裹在平均壳层厚度为100 ± 10 nm的连续ZIF-8外壳中（图4c–e）。共聚焦扫描激光显微镜（CLSM）也被用来评估ZIF-8涂层的均匀性（图4f–h）。通过将涂层细胞和未涂层细胞在含有葡萄糖（作为营养物）和溶菌酶（一种细胞毒性大分子，分子量=54.6 kDa）的培养基中孵育来测试cell@ZIF-8复合材料的选择性透过性。根据活力测试，涂层细胞在暴露于溶菌酶24小时后细胞活力下降了19%。另一方面，对照样本显示未涂层细胞在仅三小时的暴露后活力下降了95%（图4b）。生物保护能力通过将含有ZIF-8涂层的细胞复合材料暴露于一种名为filipin的抗真菌剂（分子量=655 Da）中得到了进一步验证。细胞活力测试表明，在接触filipin 24小时后，仍有90%的细胞保持代谢活性。相比之下，对照组样本（裸露的酵母细胞）几乎全部死亡。图4显示了这一结果。

在ZIF-8涂层中模拟酵母细胞的矿化过程。图中(a)展示了包封和释放过程的示意图。图(b)显示了酵母细胞（蓝色）和含有自由ZIF-8颗粒的酵母细胞（图案化蓝色）在接触裂解酶3小时后的存活情况，以及之前已接触裂解酶3小时（红色）和24小时（图案化红色）的酵母@ZIF-8细胞，这体现了MOF外壳所提供的保护作用。ZIF-8涂层的均匀性通过扫描电子显微镜（SEM）图像得到了证明（见原始酵母细胞(c)和ZIF-8涂层酵母细胞(d)的图像），以及通过用FDA（绿色）标记活酵母细胞和用Alexa Fluor 647荧光染料（红色）标记ZIF-8涂层来验证（见CLSM图像的3D重建(f)和(g)以及酵母@ZIF-8的横截面CLSM图像(h)）。改编自参考文献120，版权2016，Wiley-VCH。最后，从涂覆和未涂覆的细胞在富营养培养基中孵育后测得的λ=600 nm处的光密度（OD600）表明，MOF外壳的形成抑制了细胞分裂；这种配置模仿了孢子诱导的状态。当细胞@ZIF-8暴露于EDTA溶液中时，MOF外壳的分解使得在涂层/脱层过程后仍存活的细胞能够恢复分裂能力。在后续研究中，作者使用S. cerevisiae作为模型细胞来制造一种生物活性MOF外壳；这种外壳旨在使细胞能够在营养缺乏的环境中适应。首先，酵母细胞被β-半乳糖苷酶（β-gal）包覆，这种外源酶由于带正电的酶与带负电的细胞壁之间的静电相互作用而吸附在细胞壁上。然后，蛋白质修饰的细胞系统被重新悬浮在HmIM的水溶液中，随后迅速加入水溶性醋酸锌以诱导ZIF-8外壳的自发形成。使用CLSM展示了用紫色Alexa Fluor 568标记的β-gal与用红色Alexa Fluor 647标记的MOF涂层之间的共定位。SEM图像证实了形成了平均厚度为100 nm ± 10 nm的连续ZIF涂层。酵母@β-gal@ZIF-8复合材料在无法被S. cerevisiae细胞代谢的乳糖水溶液中孵育。β-gal在ZIF外壳中的固定使得乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，这两种糖可以被细胞作为营养物质利用。因此，将非天然酶（β-gal）固定在细胞壁和MOF涂层之间赋予了细胞在营养贫乏环境中的适应性。在同一研究中，裸露的酵母（对照组）和涂层细胞（酵母@β-gal@ZIF-8）在含有对酵母（例如裂解酶）和β-gal（例如蛋白酶）有害的生物大分子的营养缺乏培养基中孵育。细胞活力测试显示，在涂层过程后最初存活的涂层细胞中有约70%在七天后仍然存活，而裸露酵母的活力在孵育初期迅速下降到10%。总体而言，这项研究表明ZIF-8涂层作为半透性屏障（即分子筛）允许非营养物质扩散并通过固定的β-gal转化成营养物质，并防止细胞毒性裂解酶与细胞接触。最后，通过将酶功能化的ZIF涂层细胞暴露于EDTA溶液中，展示了保护性涂层的按需释放。Gan等人进一步扩展了无生物ZIF外壳的潜力，他们报告在酵母细胞（Y）上合成了生物活性多层ZIF涂层。具体来说，作者在构成无生物外骨骼的两个MOF层之间固定了一种蛋白酶抑制剂alpha-1-抗胰蛋白酶（AAT），以赋予细胞对富含蛋白酶环境的适应能力。通过模拟矿化策略诱导形成了sod ZIF-8层，从而得到了Y@ZIF-8生物复合材料。然后，Y@ZIF-8暴露于AAT，AAT被吸附到ZIF-8外骨骼的外表面，形成了Y@ZIF-8@AAT。最后，Y@ZIF-8@AAT暴露于新鲜的ZIF前体溶液中，预先吸附的AAT触发了第二个ZIF层的原位形成。这项工作表明，之前应用于合成基底（例如硅、玻璃、聚苯乙烯和聚丙烯）的生物复制方法可以成功应用于生物系统。我们注意到，通过改变Zn2+:HmIM的比例可以调整第二层酵母ZIF涂层的结晶相和组成，即外层MOF层可以是sod ZIF-8或ZIF-C（见图5b）。这样可以制备两种不同的系统：(i) Y@ZIF-8@AAT@ZIF-8和(ii) Y@ZIF-8@AAT@ZIF-C。值得注意的是，sod ZIF-8和ZIF-C在化学组成（sod ZIF-8为Zn(mIM)2，ZIF-C为Zn2(mIM)2CO3）、结晶结构和孔隙率方面存在差异。不同的MOF外层可以赋予MOF生物复合材料独特的性质。例如，在孔隙率方面，sod ZIF-8是微孔的，而ZIF-C是非多孔的。在pH=6.5时，ZIF-C对包封生物分子的释放速率更快，并且在特定癌细胞（例如人前列腺癌细胞（PC-3）中的细胞毒性更低。为了研究这两种材料（即sod ZIF-8和ZIF-C）的生物保存性能，作者将两种复合材料Y@ZIF-8@AAT@ZIF-8和Y@ZIF-8@AAT@ZIF-C在富含蛋白酶的培养基中孵育。后者是通过在磷酸盐缓冲溶液（pH=6.5）中溶解胰蛋白酶制备的；培养基中存在的磷酸根阴离子触发了ZIF外壳的缓慢降解，随后AAT在溶液中被可控释放（见图5c）。AAT的释放曲线显示Y@ZIF-8@AAT@ZIF-C在前2小时内释放了50%的生物大分子。相比之下，Y@ZIF-8@AAT@ZIF-8复合材料需要大约18小时才能释放50%的AAT。这些结果表明，外层壳的结晶相直接影响MOF的降解，从而影响AAT的释放动力学。最后，通过胰蛋白酶活性测试评估了蛋白酶抑制剂的效率。该测试显示，一旦AAT完全从无生物涂层中释放，胰蛋白酶就被完全抑制。随后，释放的细胞在酵母生长培养基（酵母提取物-胨-葡萄糖，YPD）中孵育，通过OD600测量评估细胞增殖情况。这个实验表明，释放的酵母细胞在营养丰富的培养基中表现出指数级的增殖。Zhan及其同事在2023年报告了类似的概念，即利用MOFs结合酵母和酶来增强酶活性。这些研究表明，酵母@ZIF-8复合材料可以作为生物相容性固定材料和有效生物催化剂的平台。Wang及其同事报道了一种来自酵母的MOF复合材料yeast@Mn-MOF-74@ZIF-8的疫苗佐剂应用。酵母和MOFs可以作为抗原展示载体，但它们会引起不同的免疫反应。酵母可以激活细胞免疫的佐剂特性，而MOFs可以诱导强烈的体液免疫反应。酵母@Mn-MOF-74@ZIF-8复合材料不仅可以作为亚单位疫苗抗原的递送系统，还可以作为亚单位疫苗和灭活病毒疫苗制剂中的免疫增强剂。在这项研究中，酵母@Mn-MOF-74@ZIF-8复合材料展示了有前景的应用潜力。

多层ZIF涂层的细胞。图(a)展示了包封过程的示意图。图(b)显示了Y@ZIF-8、Y@ZIF-8@BSA@ZIF-8和Y@ZIF-8@BSA@ZIF-C复合材料的SEM图像和横截面分析。图(c)展示了在胰蛋白酶存在下酵母细胞释放的示意图。改编自参考文献16，Royal Society of Chemistry。基于ZIF的无生物外壳的进展表明，可以通过生物大分子来工程化生物矿化MOFs的保护性外骨骼功能；通过选择MOF涂层的性质（例如相和厚度）和生物分子的性质（例如酶和酶抑制剂），涂层能够实现功能性适应，将恶劣环境（例如营养缺乏和富含裂解酶的介质）转化为生物相容的环境。随后，可以从ZIF涂层中程序化地释放细胞，从而恢复经历涂层/脱层过程后存活的细胞的增殖功能。微生物的一锅法包封：细胞活力。

虽然上述的概念验证研究主要集中在ZIF涂层的潜力上，但值得注意的是，人工外骨骼的组装应对细胞活力影响最小。为此，Chen等人使用S. cerevisiae和E. coli作为模型细胞，评估了ZIF-8前驱体对细胞活力的影响。作者通过分别将细胞暴露于不同浓度的三种锌前驱体（ZnSO4·7H2O、Zn(OAc)2·2H2O和Zn(NO3)2·6H2O）溶解在0.9% NaCl溶液中，比较了它们的细胞毒性。当酵母细胞单独暴露于浓度范围从4到20 mM的锌盐或HmIM时，没有显示出显著的毒性。然而，当同时暴露于锌盐和HmIM时，酵母细胞的活力显著变化，这取决于在包封过程中使用的锌前驱体。这些发现表明，细胞毒性效应主要是由MOF外壳的形成过程中产生的副产物引起的，而不是由单个前驱体引起的。值得注意的是，细胞毒性效应取决于用作前驱体的锌盐，这归因于MOF形成过程中产生的差异副产物。观察到的最高毒性出现在ZnSO4的情况下：细胞活力降至50%（最低浓度为4 mM）。相比之下，在相同的条件下，Zn(OAc)2和Zn(NO3)2下的细胞活力分别为70%和90%。此外，根据这项研究，当细胞被三种不同的锌源（ZnSO4、Zn(OAc)2和Zn(NO3)2）包覆时，S. cerevisiae的ζ电位从ζ = −7升高到ζ = 10、ζ = 5和ζ = 3。作者进一步使用Zn(OAc)2和Zn(NO3)2前驱体来研究它们在E. coli包封过程中的细胞毒性效应。与酵母细胞不同，MOF外壳的形成并未损害E. coli的活力。作者假设位于E. coli外细胞膜上的脂多糖（LPS）可能与锌离子发生强烈相互作用。与其他用作生物复制剂的生物大分子（脂肪酸、带负电的蛋白质和碳水化合物）类似，LPS可能诱导快速ZIF成核，从而形成保护性外壳，限制了自由金属离子与细胞之间的后续相互作用。微生物的一锅法包封：扩展多孔框架的组合。

ZIFs的应用已经扩展到ZIF-90，这是一种由Zn2+阳离子与咪唑烷-2-羧醛（ICA−）阴离子配位的单晶材料。ZIF-90形成了一个连续且无缺陷的外壳，通过最小化晶界的形成来增强MOF的选择性渗透性，这是多晶ZIF-8外壳中常见的问题。这一特性使得包封过程仅通过ZIF的微孔性来控制质量扩散，从而避免了晶界缺陷的影响。具体来说，一种E. coli菌株被遗传工程改造，使其含有一个质粒，该质粒在T7启动子的控制下表达红色荧光蛋白mCherry。加入IPTG后，mCherry基因的转录被诱导，从而产生了红色荧光蛋白。随后，对基因激活的E. coli进行了聚乙烯吡咯烷酮辅助的水相包封。表达的红色荧光蛋白大于ZIF-90的微孔；因此，Tsung团队证明活细胞中的蛋白质可以被无缺陷的ZIF-90外壳限制在细胞内。mCherry蛋白表达后，工程改造的细菌在580 nm绿光激发下显示出强烈的红色荧光（610 nm），使得用荧光显微镜可以容易地检测到ZIF-90包封的细胞。为了评估ZIF-90外壳的保护效果，E. coli@ZIF-90复合材料被暴露于有害的杀菌剂如苯甲醛、肉桂醛和卡那霉素中，而自由E. coli暴露于相同的有毒环境中作为对照。经过苯甲醛和肉桂醛处理后，自由细胞失去了荧光，而ZIF-90包封的细胞保留了荧光信号。这些结果表明，被封装在ZIF-90中的细胞在暴露于细胞毒性环境后仍然具有存活能力，并且在通过EDTA去除ZIF-90外壳后能够增殖。这一发现表明，基于ZIF-90的外壳是一种可行的系统，可以保护和延长细菌细胞的寿命。重要的是，这项工作还表明，ZIF涂层可以用来在活体生物体内保留表达的蛋白质，为生物工程应用提供了新的工具。除了上述的一锅法水基合成方法外，Shieh团队还提出了一种机械化学方法（即通过机械力，如研磨或球磨，使用最少的溶剂）来封装MOFs中的细胞。通过将机械力应用到大肠杆菌和ZIF-90前体的混合物中，作者成功地将大肠杆菌封装在ZIF-90中。这种方法不仅环保且超快速，只需几秒钟，还证明了球磨过程与细菌的存活性是兼容的，突显了这种快速机械方法在封装脆弱生物材料方面的适用性。这些发现表明，基于ZIF-90的外壳为保护和延长细菌细胞的寿命提供了一种可行的策略。最近，Luo等人报告了使用两种大肠杆菌菌株（pET28a-lrldh和pET28a-ladd2）在非晶态ZIF-90（aZIF-90）外壳中通过级联生物合成d-苯乳酸（d-PLA）的方法。通过将Zn(NO3)2与咪唑-2-羧醛（HICA）以1:1的比例在大肠杆菌菌株存在下混合，实现了细胞的封装。所得的非晶态大肠杆菌@aZIF-90复合材料通过SEM、红外光谱、热重分析（TGA）、XRD、X射线光电子能谱（XPS）和CLSM进行了表征，证实了成功的细胞封装以及有利于底物扩散的介孔结构。催化性能测试显示，aZIF-90封装增强了细胞的热稳定性和pH稳定性，提高了对金属离子和有机溶剂的耐受性，并且在四次重复使用后仍保留了超过75%的活性。在连续搅拌系统中， immobilized的生物催化剂在12小时后达到了9.00 g L−1的d-PLA峰值产量，转化率为89.4%。与自由细胞相比，大肠杆菌@aZIF-90的空间-时间产量提高了1.15倍，并且对恶劣环境条件具有更强的抵抗力。这些结果强调了aZIF-90作为工业生物生产d-PLA的全细胞催化平台的潜力。一锅法将活细胞封装在非生物MOF涂层中的方法并不局限于基于锌的MOFs。最近的研究表明，基于铁的MOFs也是适合一锅法封装活微生物的候选材料。Lee等人报道了使用两种大肠杆菌菌株（pET28a-lrldh和pET28a-ladd2）在非晶态ZIF-90（aZIF-90）外壳中通过级联生物合成d-苯乳酸（d-PLA）的方法。通过将Zn(NO3)2与咪唑-2-羧醛（HICA）以1:1的比例在大肠杆菌菌株存在下混合，实现了细胞的封装。所得的非晶态大肠杆菌@aZIF-90复合材料通过SEM、红外光谱、热重分析（TGA）、XRD、X射线光电子能谱（XPS）和CLSM进行了表征，证实了成功的细胞封装以及有利于底物扩散的介孔结构。催化性能测试显示，aZIF-90封装增强了细胞的热稳定性和pH稳定性，提高了对金属离子和有机溶剂的耐受性，并且在四次重复使用后仍保留了超过75%的活性。在连续搅拌系统中， immobilized的生物催化剂在12小时后达到了9.00 g L−1的d-PLA峰值产量，转化率为89.4%。与自由细胞相比，大肠杆菌@aZIF-90的空间-时间产量提高了1.15倍，并且对恶劣环境条件具有更强的抵抗力。这些结果强调了aZIF-90作为工业生物生产d-PLA的全细胞催化平台的潜力。一锅法将活细胞封装在非生物MOF涂层中的方法不仅限于基于锌的MOFs。最近的研究表明，基于铁的MOFs也是适合一锅法封装活微生物的候选材料。Lee等人报道了使用两种大肠杆菌菌株（pET28a-lrldh和pET28a-ladd2）在非晶态ZIF-90（aZIF-90）外壳中通过级联生物合成d-苯乳酸（d-PLA）的方法。通过将Zn(NO3)2与咪唑-2-羧醛（HICA）以1:1的比例在大肠杆菌菌株存在下混合，实现了细胞的封装。所得的非晶态大肠杆菌@aZIF-90复合材料通过SEM、红外光谱、热重分析（TGA）、XRD、X射线光电子能谱（XPS）和CLSM进行了表征，证实了成功的细胞封装以及有利于底物扩散的介孔结构。催化性能测试显示，aZIF-90封装增强了细胞的热稳定性和pH稳定性，提高了对金属离子和有机溶剂的耐受性，并且在四次重复使用后仍保留了超过75%的活性。在连续搅拌系统中， immobilized的生物催化剂在12小时后达到了9.00 g L−1的d-PLA峰值产量，转化率为89.4%。与自由细胞相比，大肠杆菌@aZIF-90的空间-时间产量提高了1.15倍，并且对恶劣环境条件具有更强的抵抗力。这些结果强调了aZIF-90作为工业生物生产d-PLA的全细胞催化平台的潜力。

这些结果证明，被ZIF-90包裹的细胞在暴露于细胞毒性环境后仍能保持活力，并且在去除ZIF-90外壳后能够继续增殖。这一发现表明，基于ZIF-90的外壳是一种有效保护并延长细菌细胞寿命的系统。重要的是，这项工作还展示了ZIF涂层能够在活体生物体内保留表达的蛋白质，为生物工程应用提供了新的工具。除了上述的一锅法水基合成方法外，Shieh团队还提出了一种机械化学方法（即通过机械力，如研磨或球磨，使用最少的溶剂）来封装MOFs中的细胞。通过将机械力应用于大肠杆菌和ZIF-90前体的混合物中，作者成功地将大肠杆菌封装在ZIF-90中。这种方法不仅环保且超快速，只需要几秒钟，还证明了球磨过程与细菌的存活性是兼容的，从而突显了这种快速机械方法在封装脆弱生物材料方面的适用性。这些发现表明，基于ZIF-90的外壳为保护和延长细菌细胞的寿命提供了一种可行的策略。最近，Luo等人报告了使用两种大肠杆菌菌株（pET28a-lrldh和pET28a-ladd2）在非晶态ZIF-90外壳中通过级联生物合成d-苯乳酸（d-PLA）的方法。通过将Zn(NO3)2与咪唑-2-羧醛（HICA）以1:1的比例在大肠杆菌菌株存在下混合，实现了细胞的封装。所得的非晶态大肠杆菌@aZIF-90复合材料通过SEM、红外光谱、热重分析（TGA）、XRD、X射线光电子能谱（XPS）和CLSM进行了表征，证实了成功的细胞封装以及有利于底物扩散的介孔结构。催化性能测试显示，aZIF-90封装增强了细胞的热稳定性和pH稳定性，提高了对金属离子和有机溶剂的耐受性，并且在四次重复使用后仍保留了超过75%的活性。在连续搅拌系统中， immobilized的生物催化剂在12小时后达到了9.00 g L−1的d-PLA峰值产量，转化率为89.4%。与自由细胞相比，大肠杆菌@aZIF-90的空间-时间产量提高了1.15倍，并且对恶劣环境条件具有更强的抵抗力。这些结果强调了aZIF-90作为工业生物生产d-PLA的全细胞催化平台的潜力。

这些结果表明，被封装在ZIF-90中的细胞在暴露于细胞毒性环境后仍然具有存活能力，并且在去除ZIF-90外壳后能够继续增殖。这一发现表明，基于ZIF-90的外壳是一种可行的系统，可以保护和延长细菌细胞的寿命。重要的是，这项工作还展示了ZIF涂层能够在活体生物体内保留表达的蛋白质，为生物工程应用提供了新的工具。除了上述的一锅法水基合成方法外，Shieh团队还提出了一种机械化学方法（即通过机械力，如研磨或球磨，使用最少的溶剂）来封装MOFs中的细胞。通过将机械力应用于大肠杆菌和ZIF-90前体的混合物中，作者成功地将大肠杆菌封装在ZIF-90中。这种方法不仅环保且超快速，只需要几秒钟，还证明了球磨过程与细菌的存活性是兼容的，从而突显了这种快速机械方法在封装脆弱生物材料方面的适用性。这些发现表明，基于ZIF-90的外壳为保护和延长细菌细胞的寿命提供了一种可行的策略。最近，Luo等人报告了使用两种大肠杆菌菌株（pET28a-lrldh和pET28a-ladd2）在非晶态ZIF-90外壳中通过级联生物合成d-苯乳酸（d-PLA）的方法。通过将Zn(NO3)2与咪唑-2-羧醛（HICA）以1:1的比例在大肠杆菌菌株存在下混合，实现了细胞的封装。所得的非晶态大肠杆菌@aZIF-90复合材料通过SEM、红外光谱、热重分析（TGA）、XRD、X射线光电子能谱（XPS）和CLSM进行了表征，证实了成功的细胞封装以及有利于底物扩散的介孔结构。催化性能测试显示，aZIF-90封装增强了细胞的热稳定性和pH稳定性，提高了对金属离子和有机溶剂的耐受性，并且在四次重复使用后仍保留了超过75%的活性。在连续搅拌系统中， immobilized的生物催化剂在12小时后达到了9.00 g L−1的d-PLA峰值产量，转化率为89.4%。与自由细胞相比，大肠杆菌@aZIF-90的空间-时间产量提高了1.15倍，并且对恶劣环境条件具有更强的抵抗力。这些结果强调了aZIF-90作为工业生物生产d-PLA的全细胞催化平台的潜力。

这些结果表明，ZIF-90为基础的外壳为保护和延长细菌细胞的寿命提供了一种可行的策略。最近，Luo等人报告了使用两种大肠杆菌菌株（pET28a-lrldh和pET28a-ladd2）在非晶态ZIF-90外壳中通过级联生物合成d-苯乳酸（d-PLA）的方法。通过将Zn(NO3)2与咪唑-2-羧醛（HICA）以1:1的比例在大肠杆菌菌株存在下混合，实现了细胞的封装。所得的非晶态大肠杆菌@aZIF-90复合材料通过SEM、红外光谱、热重分析（TGA）、XRD、X射线光电子能谱（XPS）和CLSM进行了表征，证实了成功的细胞封装以及有利于底物扩散的介孔结构。催化性能测试显示，aZIF-90封装增强了细胞的热稳定性和pH稳定性，提高了对金属离子和有机溶剂的耐受性，并且在四次重复使用后仍保留了超过75%的活性。在连续搅拌系统中， immobilized的生物催化剂在12小时后达到了9.00 g L−1的d-PLA峰值产量，转化率为89.4%。与自由细胞相比，大肠杆菌@aZIF-90的空间-时间产量提高了1.15倍，并且对恶劣环境条件具有更强的抵抗力。这些结果强调了aZIF-90作为工业生物生产d-PLA的全细胞催化平台的潜力。

这些结果表明，ZIF-90为基础的外壳为保护和延长细菌细胞的寿命提供了一种可行的策略。此外，Shieh团队还提出了一种机械化学方法（即通过机械力，如研磨或球磨，使用最少的溶剂）来封装MOFs中的细胞。通过将机械力应用于大肠杆菌和ZIF-90前体的混合物中，作者成功地将大肠杆菌封装在ZIF-90中。这种方法不仅环保且超快速，只需要几秒钟，还证明了球磨过程与细菌的存活性是兼容的，从而突显了这种快速机械方法在封装脆弱生物材料方面的适用性。这些发现表明，基于ZIF-90的外壳为保护和延长细菌细胞的寿命提供了一种可行的策略。最近，Luo等人报告了使用两种大肠杆菌菌株（pET28a-lrldh和pET28a-ladd2）在非晶态ZIF-90外壳中通过级联生物合成d-苯乳酸（d-PLA）的方法。通过将Zn(NO3)2与咪唑-2-羧醛（HICA）以1:1的比例在大肠杆菌菌株存在下混合，实现了细胞的封装。所得的非晶态大肠杆菌@aZIF-90复合材料通过SEM、红外光谱、热重分析（TGA）、XRD、X射线光电子能谱（XPS）和CLSM进行了表征，证实了成功的细胞封装以及有利于底物扩散的介孔结构。催化性能测试显示，aZIF-90封装增强了细胞的热稳定性和pH稳定性，提高了对金属离子和有机溶剂的耐受性，并且在四次重复使用后仍保留了超过75%的活性。在连续搅拌系统中， immobilized的生物催化剂在12小时后达到了9.00 g L−1的d-PLA峰值产量，转化率为89.4%。与自由细胞相比，大肠杆菌@aZIF-90的空间-时间产量提高了1.15倍，并且对恶劣环境条件具有更强的抵抗力。这些结果强调了aZIF-90作为工业生物生产d-PLA的全细胞催化平台的潜力。

这些结果表明，ZIF-90为基础的外壳为保护和延长细菌细胞的寿命提供了一种可行的策略。此外，Shieh团队还提出了一种机械化学方法（即通过机械力，如研磨或球磨，使用最少的溶剂）来封装MOFs中的细胞。通过将机械力应用于大肠杆菌和ZIF-90前体的混合物中，作者成功地将大肠杆菌封装在ZIF-90中。这种方法不仅环保且超快速，只需要几秒钟，还证明了球磨过程与细菌的存活性是兼容的，从而突显了这种快速机械方法在封装脆弱生物材料方面的适用性。这些发现表明，基于ZIF-90的外壳为保护和延长细菌细胞的寿命提供了一种可行的策略。最近，Luo等人报告了使用两种大肠杆菌菌株（pET28a-lrldh和pET28a-ladd2）在非晶态ZIF-90外壳中通过级联生物合成d-苯乳酸（d-PLA）的方法。通过将Zn(NO3)2与咪唑-2-羧醛（HICA）以1:1的比例在大肠杆菌菌株存在下混合，实现了细胞的封装。所得的非晶态大肠杆菌@aZIF-90复合材料通过SEM、红外光谱、热重分析（TGA）、XRD、X射线光电子能谱（XPS）和CLSM进行了表征，证实了成功的细胞封装以及有利于底物扩散的介孔结构。催化性能测试显示，aZIF-90封装增强了细胞的热稳定性和pH稳定性，提高了对金属离子和有机溶剂的耐受性，并且在四次重复使用后仍保留了超过75%的活性。在连续搅拌系统中， immobilized的生物催化剂在12小时后达到了9.00 g L−1的d-PLA峰值产量，转化率为89.4%。与自由细胞相比，大肠杆菌@aZIF-90的空间-时间产量提高了1.15倍，并且对恶劣环境条件具有更强的抵抗力。这些结果强调了aZIF-90作为工业生物生产d-PLA的全细胞催化平台的潜力。

这些结果表明，ZIF-90为基础的外壳为保护和延长细菌细胞的寿命提供了一种可行的策略。此外，Shieh团队还提出了一种机械化学方法（即通过机械力，如研磨或球磨，使用最少的溶剂）来封装MOFs中的细胞。通过将机械力应用于大肠杆菌和ZIF-90前体的混合物中，作者成功地将大肠杆菌封装在ZIF-90中。这种方法不仅环保且超快速，只需要几秒钟，还证明了球磨过程与细菌的存活性是兼容的，从而突显了这种快速机械方法在封装脆弱生物材料方面的适用性。这些发现表明，基于ZIF-90的外壳为保护和延长细菌细胞的寿命提供了一种可行的策略。最近，Luo等人报告了使用两种大肠杆菌菌株（pET28a-lrldh和pET28a-ladd2）在非晶态ZIF-90外壳中通过级联生物合成d-苯乳酸（d-PLA）的方法。通过将Zn(NO3)2与咪唑-2-羧醛（HICA）以1:1的比例在大肠杆菌菌株存在下混合，实现了细胞的封装。所得的非晶态大肠杆菌@aZIF-90复合材料通过SEM、红外光谱、热重分析（TGA）、XRD、X射线光电子能谱（XPS）和CLSM进行了表征，证实了成功的细胞封装以及有利于底物扩散的介孔结构。催化性能测试显示，aZIF-90封装增强了细胞的热稳定性和pH稳定性，提高了对金属离子和有机溶剂的耐受性，并且在四次重复使用后仍保留了超过75%的活性。在连续搅拌系统中， immobilized的生物催化剂在12小时后达到了9.00 g L−1的d-PLA峰值产量，转化率为89.4%。与自由细胞相比，大肠杆菌@aZIF-90的空间-时间产量提高了1.15倍，并且对恶劣环境条件具有更强的抵抗力。这些结果强调了aZIF-90作为工业生物生产d-PLA的全细胞催化平台的潜力。

这些结果表明，ZIF-90为基础的外壳为保护和延长细菌细胞的寿命提供了一种可行的策略。此外，Shieh团队还提出了一种机械化学方法（即通过机械力，如研磨或球磨，使用最少的溶剂）来封装MOFs中的细胞。通过将机械力应用于大肠杆菌和ZIF-90前体的混合物中，作者成功地将大肠杆菌封装在ZIF-90中。这种方法不仅环保且超快速，只需要几秒钟，还证明了球磨过程与细菌的存活对于神经干细胞，研究人员提出了一种替代策略，即用生物相容性的霍夫框架（HOFs）将其包裹起来。33 这些复合材料通过静电相互作用以及在细胞膜上蛋白质残基与霍夫框架构建块之间的氢键相互作用，在神经干细胞的细胞膜上形成。此外，多孔碳纳米球纳米zymes（PCNs）被掺入霍夫框架壳中，以赋予细胞外骨骼分层的氢键结构、近红外-II（NIR-II）触发降解能力和抗氧化活性。封装过程并未影响神经干细胞的生物活性或细胞活力。神经干细胞在治疗神经退行性疾病方面具有重大潜力，但由于在有害的病理微环境中氧化应激导致的“干性”丧失、细胞膜损伤和细胞凋亡，成功的移植常常受到阻碍。为了证明霍夫框架包裹的细胞可以用于移植，研究人员将它们注入了患有神经退行性疾病的小鼠模型的大脑中。这些小鼠确实表现出神经发生的改善。尽管这样的先例仍然有限，但它们表明这可能是未来制造高性能生物治疗剂和疫苗载体的有前景的方法。

多步骤封装微生物

多步骤封装策略的主要优势之一是能够将细胞封装进在生物相容条件下无法合成的金属有机框架（MOFs）中。这样就可以使用具有增强水解稳定性的MOFs（例如基于锆的MOFs）。例如，Yang、Yaghi及其同事报告了使用预合成的基于锆的MOF（Zr6O4(OH)4(BTB)2(OH)6(H2O)6）单层来包裹M. thermoacetica细胞。98 MOF层在微生物表面的沉积是通过锆簇与细胞表面磷酸基团之间的配位键形成的。扫描透射电子显微镜（STEM）分析显示形成了厚度为1-2纳米的均匀MOF涂层。有趣的是，用预合成的MOF单层包裹细胞并没有使细胞进入休眠状态；这些细菌在厌氧条件下培养时仍保持其繁殖能力。为了证明MOF涂层对M. thermoacetica在氧化应激下的保护作用，作者将涂层细胞和未涂层细胞暴露在21%的氧气环境中2天。氧气暴露后的活力测定表明，涂层细胞的活力为76 ± 8%，而裸细胞的活力下降到了50 ± 7%。随后，将涂层细胞和未涂层细胞暴露在不同浓度的H2O2中，以评估基于锆的涂层的ROS清除特性。这项研究进一步证实了MOF涂层可以防止由活性氧（ROS）引起的氧化应激。作者认为，对氧化应激的防护可能是由于锆簇上存在活性金属位点，这些位点促进了H2O2的分解并防止了其在细胞培养基中的积累。

某些细菌（如枯草芽孢杆菌）可以形成孢子，以在恶劣环境中生存。153 当孢子暴露在有利生长条件下时，它们可以发芽并开始生长。因此，使用非生物外骨骼包裹孢子而不是细胞进行人工孢子形成可能会带来额外的好处。153,154 首先，与细胞相比，孢子具有更强的环境抵抗力，并且能够适应某些外骨骼的苛刻封装条件。其次，孢子的可控发芽不仅延长了储存期，还提供了在实验室外使用的机会。第三，运输变得更加简单，避免了细胞通常所需的低温环境。鉴于孢子可以与多种材料结合并经过基因改造，基于孢子的生物材料具有巨大的应用潜力，但它们在MOF系统中的使用仍然很少。154–157 例如，Zhong、Chou及其同事展示了将枯草芽孢杆菌孢子封装在空心的ZIF-8中。154 空心ZIF-8壳是通过软模板方法合成的，使用微小的水包油滴。这种合成条件对细菌来说相对苛刻，这证明了孢子的适应性。空心ZIF-8层为孢子提供了增强的环境抵抗力，保护它们免受次氯酸、紫外线辐射甚至真空条件等恶劣条件的影响。孢子的释放和发芽可以根据营养浓度进行调控。此外，孢子还通过环境敏感的基因电路进行了基因工程改造，使细菌能够检测特定的分子，如IPTG或柠檬酸。

对于高等真核生物，使用纳米粒子（NPs）进行封装比起原位细胞封装难度要小，这可能是由于这种方法所需的毒性化合物浓度较低。Brinker实验室已经证明可以使用SupraCell方法来封装HeLa细胞。64 SupraCell的形成需要准备合成纳米粒子（例如来自ZIF-8、MIL-100或UiO-66-NH2），这些纳米粒子通过单宁酸附着在细胞表面，单宁酸既作为纳米粒子与细胞膜之间的化学粘合剂，也作为颗粒间的交联剂，形成一个连续的多孔外骨骼。使用不同的纳米粒子构建块可以形成不同大小的孔隙，从而实现选择性渗透性。SupraCell被证明能够在保持类似孢子状态的同时维持正常的细胞功能（例如活力和代谢）。人工外骨骼赋予了对机械应力、渗透压应力、活性氧（ROS）、pH变化和紫外线照射的抵抗力。采用类似的方法，已经制备并使用了功能性MOF纳米粒子，包括ZIF-8、MIL-100（Fe）、UiO-66-NH2、磁性氧化铁（Fe3O4）NPs@ZIF-8和混合介孔二氧化硅NP@MOF（MSNs、染料标记的MSNs、传感探针负载的MSNs@ZIF-8），来包裹红细胞。1,133 外骨骼通过基于金属-酚类配位和RBC膜/NP在细胞界面处的氢键相互作用在几秒钟内生成。封装的红细胞显示出对各种外部压力的增强耐受性，包括洗涤剂、毒素、抗体介导的凝集、渗透压压力和冷冻。有趣的是，MOF封装被发现对冷冻保存有积极影响，冷冻保存包括快速冷冻和解冻细胞的过程。冷冻保存是一种将细胞迅速冷冻并在极低温度（约−80°C）下储存，直到几个月或几年后解冻的方法。该方法用于保存各种类型的细胞，包括重要的医疗样本，这些样本用于输血、骨髓移植、人工授精和体外受精。冷冻保存中最麻烦的步骤是解冻步骤，这通常会损害细胞活力。多项研究表明，纳米粒子辅助的MOF封装可以提供一种更有效的解决方案，以保护哺乳动物细胞在冷冻和解冻过程中的安全性，并帮助细胞完全恢复。通过应用基于锆的金属-有机框架（MOF）纳米粒子（NPs），可以保存红细胞。64 总共选择了五种基于锆的MOF NPs，即UiO-66、UiO-66-NH2、UiO-66-OH、UiO-67和MOF-808，并根据报告的溶热方法进行了合成。这些Zr-MOF NPs表现出明确的表面化学性质，并被发现能够抑制冰晶再结晶，同时加速冰晶熔化。冷冻保存测试显示，冷冻和解冻后细胞恢复率可达40%。Jeon等人使用基于锆的MOF-801 NPs作为人类胚胎肾（293T）、非肿瘤性肺支气管上皮（BEAS-2B）和肺癌上皮（A549）细胞系的冷冻保护剂。124 制备了直径为10、35、100和250纳米的MOF NPs。在这种方法中，通过丙烯酸基功能化将缬氨酸和苏氨酸引入MOF NP表面，以模拟冰结合蛋白，提供亲水性和疏水性的双重特性。无论浓度或NP表面功能化如何，MOF-801 NPs都具有生物相容性，而较小尺寸的表面功能化NP在冷冻/解冻后通过抑制冰晶再结晶显示出良好的细胞恢复率。通过使用预合成的ZIF-8 NPs封装精子细胞，创造了所谓的ZIFSpermbots。114 通过与单宁酸的络合作用，促进了精子膜的包裹，形成了选择性渗透的多孔ZIF-8包装。这种细胞表面工程在优化条件下对精子活力几乎没有影响，同时有效阻断了抗精子抗体的结合。这些所谓的“ZIFSpermbots”可以通过利用ZIF-8 NPs的载药能力作为主动药物输送系统。MOF细胞-表面涂层也可以应用于哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢K1（CHO-K1）的细胞膜上。115 对于这种方法，通过简单的孵育和添加Ni阳离子，将金属化合物脂质（dabco-(CH2)15-CH3)2[MnN-(CN)4]插入哺乳动物细胞膜中，形成稳定的MOF微域并导致相分离。即使在缺乏肌动蛋白细胞骨架的情况下，诱导的相分离系统仍然稳定。此外，这些细胞由于P2嘌呤受体的激活而对ATP的细胞钙响应增强。

免疫疗法

在cell@shell形成过程中保持细胞活力的能力为这些复合材料在新的应用中打开了可能性。例如，使用可降解的非生物外壳包裹活细菌可以显著改善细菌介导的抗肿瘤治疗（BMAT）。27,43,158–160 尽管自19世纪以来就已知使用活细菌进行癌症治疗，但不可控的细菌感染风险阻碍了BMAT的临床应用。161 然而，随着新型抗生素和基因工程技术的发展，研究人员已经开发出使用减毒细菌进行癌症治疗的安全策略。158 与传统化疗相比，BMAT提供了几个优势：（1）肿瘤定位：缺氧的肿瘤微环境促进细菌定植，162 （2）肿瘤内渗透：细菌鞭毛增强了细菌在肿瘤内的渗透能力，163 （3）肿瘤定植：肿瘤微环境的免疫抑制促进了细菌在癌组织中的优先积累；43,158 以及（4）基于细菌的输送系统的开发，通过基因工程和细菌表面修改，可以创建使用活细胞作为载体的输送系统。43,158 因此，这些系统非常适合高空间和时间精度的抗肿瘤治疗药物的输送。14,158,161

增强基于细菌的疗法效果的一种有效方法是将活微生物封装在非生物外壳中。这种策略使得能够将治疗剂共同输送到癌细胞中，延长细菌的循环寿命，并改善治疗部位的细菌增殖调控。43,158 Yan及其同事的最新研究展示了非生物MOF涂层与基于细菌的癌症治疗之间的协同潜力。70 在这项工作中，作者报道了将大肠杆菌（ζ = −23）一次性封装在生物活性ZIF-8涂层中，生成了E. coli@ZIF-8复合材料（ζ = 7.5）。70 ZIF-8涂层保持了封装细胞的活力，同时防止了健康组织中细菌的失控复制。为了进一步提高E. coli@ZIF-8复合材料的治疗效果，研究人员使用MOF壳共同固定了两种治疗剂，多柔比星（DOX）和氯素e6（Ce6），从而得到了E. coli@DOX&Ce6@ZIF-8复合材料（ζ = −14）。DOX是一种常用的化疗蒽环类抗生素，164 而Ce6是一种FDA批准的光敏剂，用于癌症光动力治疗（PDT）。165 Ce6以其在温和近红外（NIR）辐射下高产生活性氧（ROS）的效率而闻名。NIR辐射范围从800到2500纳米，比紫外线或高能可见光的光毒性强。此外，在哺乳动物组织中，NIR光比可见光穿透得更深，使其更适合治疗深层伤口、感染和癌症。166

通过体外和体内实验评估了E. coli@DOX&Ce6@ZIF-8复合材料的化学光动力治疗效果。体外测试通过评估小鼠乳腺肿瘤（4T1）细胞在不同处理（有无激光照射L）后的活力来进行。这些处理包括：（1）自由E. coli，（2）E. coli@ZIF-8，（3）E. coli@DOX&Ce6@ZIF-8，（4）E. coli@Ce6@ZIF-8 + L，以及（5）E. coli@DOX&Ce6@ZIF-8 + L。结果显示，4T1细胞在暴露于E. coli@ZIF-8后保持了超过80%的活力。这一观察结果证实了E. coli@ZIF-8复合材料的生物相容性。然而，在暴露于E. coli@DOX&Ce6@ZIF-8复合材料后，细胞活力下降到了约60%。E. coli@DOX&Ce6@ZIF-8复合材料的适度毒性归因于化疗药物DOX的释放。尽管如此，E. coli@DOX&Ce6@ZIF-8复合材料的治疗效果可以通过NIR激光照射得到增强。因此，E. coli@DOX&Ce6@ZIF-8 + L治疗的双重化学光动力疗法使细胞活力达到了约25%。这些观察结果表明，Ce6和DOX之间的强烈协同作用在体外测试中提升了治疗效果。为了探索这种双化疗-光动力疗法的疗效，作者研究了E. coli@DOX&Ce6@ZIF-8在小鼠体内的生物分布情况。E. coli@DOX&Ce6@ZIF-8被注入含有肿瘤的小鼠体内，24小时后的生物分布分析显示，E. coli@DOX&Ce6@ZIF-8的积累效率约为6.1%。这一数值是通过肿瘤部位中的E. coli菌落数量与注入的E. coli@DOX&Ce6@ZIF-8数量之比得出的。随后，通过追踪肿瘤的大小和重量，作者证明了E. coli@DOX&Ce6@ZIF-8在一次近红外激光治疗（10分钟，λ = 600纳米）后能够抑制肿瘤生长。这项研究突显了使用细菌@MOF涂层作为基于细胞的递送平台在生物治疗应用中的多功能性。MOF生物保护作用也可以扩展到细胞器。周及其同事最近证明了一种新策略，即将分离出的线粒体生物矿化到ZIF-8中，以保持其生物活性并提高其移植到癌细胞中的效率，用于治疗目的。这些线粒体是从非肿瘤性乳腺上皮细胞（MCF-10A）中分离出来的。通过将新鲜分离出的线粒体与Zn2+和HmIM在0.9% NaCl溶液中混合，采用一锅合成法实现了封装。为了改善细胞内递送，进一步在合成过程中将聚乙烯亚胺（PEI）和细胞穿透肽TAT加入到了MIT@ZIF-8纳米结构中。透射电子显微镜（TEM）图像确认了线粒体周围形成了明显的ZIF-8层，切片分析揭示了包含结构。线粒体结合染料（MVG）的荧光寿命测量进一步证实了ZIF-8壳层对线粒体的完全包裹。这项研究表明，在室温下，封装的线粒体至少可以保持4周的生物活性，这通过线粒体膜电位和ATP合成能力来评估。相比之下，未经封装的对照组即使在冰上储存，也在6小时内失去了大部分膜电位。MIT@ZIF-8纳米结构在酸性环境下会释放封装的线粒体，在pH 5.0时大约有70%的线粒体释放，而在pH 7.4时释放量极小。表面修饰的MIT@ZIF-8通过PEI和TAT改善了在水中的分散性，从而增强了细胞摄取。改良后的MIT@ZIF-8成功递送到乳腺癌细胞系（BT-549和MDA-MB-231）中，4天后的摄取效率分别为11.8%和17.2%。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像显示这些外源性线粒体存在于受体癌细胞内，并观察到了移植线粒体与内源性线粒体之间的融合现象。Seahorse检测的功能分析显示，接受MIT@ZIF-8的癌细胞氧气消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）增加，表明线粒体功能得到改善。在治疗上，将这些非肿瘤性线粒体移植到癌细胞中显著抑制了癌细胞的增殖，将MDA-MB-231细胞中的癌干细胞数量从95.5%降低到76.5%，并抑制了这些细胞的上皮-间质转化（EMT）过程。作者得出结论，这种基于MOF的生物矿化技术代表了线粒体研究和移植领域的一项进展，提供了一种保护线粒体活性并增强其递送能力的强有力方法，具有潜在的癌症治疗用途。

另一个研究方向是探索细胞@ZIF-8复合材料的潜力，目标是封装益生菌。益生菌是当以适当剂量给予人类或动物时能够带来健康益处的微生物，因为它们可以维持、恢复和平衡肠道微生物群。后者对于临床控制肠道感染尤为重要。然而，只有当益生菌以活性状态到达肠道目标部位时，才能实现其有益效果。然而，从实际角度来看，这是一个重要挑战，因为口服益生菌在通过胃肠道的过程中会遇到强烈的酸性环境。这种酸性条件会严重损害益生菌的存活能力，限制了它们在恢复肠道菌群方面的效果。另一方面，肠道感染的临床治疗通常需要同时使用抗生素和益生菌。因此，为了确保治疗的有效性，开发出保护益生菌免受抗生素影响的策略至关重要，这样抗生素只能杀死致病菌而不改变益生菌的存活能力和功能。

微囊化技术作为一种有前景的解决方案，可以解决这些问题，并在与抗生素联合使用治疗肠道感染时提高益生菌的存活能力。传统的微囊化技术涉及将益生菌固定在有机基质中。微囊化的关键方面是确保封装材料能够在作用部位释放益生菌细胞。纳米技术的进步带来了新型非生物涂层的开发，这些涂层能够在受到外部刺激时实现益生菌的靶向递送，同时保护它们免受胃肠道的恶劣环境。在这方面，Busscher及其同事研究了在各种非生物涂层中封装益生菌，例如B. breve和L. acidophilus，包括（i）protamine辅助的SiO2纳米粒子卵黄-壳层涂层，（ii）藻酸盐水凝胶和（iii）ZIF-8。然后，作者比较了B. breve在模拟胃液（SGF††）和模型抗生素（例如四环素）下的生物保护特性。SiO2卵黄-壳层封装是通过将protamine薄膜预先吸附到细菌细胞上，然后暴露于SiO2纳米粒子胶体悬浮液来实现的。SiO2纳米粒子在protamine薄膜上聚集，形成二氧化硅壳层。随后将protamine薄膜内化到细菌内部，从而在细菌细胞表面和纳米粒子壳层之间创建了一个空腔。藻酸盐水凝胶壳层是通过将B. Breve或L. acidophilus的PBS悬浮液逐滴加入CaCl2溶液中制备的。通过加入聚乙烯亚胺（PEI）和细胞穿透肽TAT，在合成过程中进一步对MIT@ZIF-8纳米结构进行了表面修饰。TEM图像确认了线粒体周围形成了明显的ZIF-8层，切片分析揭示了包含结构。线粒体结合染料（MVG）的荧光寿命测量进一步证实了线粒体被ZIF-8壳层完全封装。这项研究表明，即使在室温下保存至少4周，封装的线粒体也有效地保持了其生物活性，这通过线粒体膜电位和ATP合成能力来评估。相比之下，未经封装的对照组即使在冰上储存，也在6小时内失去了大部分膜电位。MIT@ZIF-8纳米结构在酸性环境下会释放封装的线粒体，在pH 5.0时大约有70%的线粒体释放，而在pH 7.4时释放量极少。MIT@ZIF-8表面修饰用PEI和TAT处理后，提高了在水中的分散性，从而增强了细胞的摄取。改良后的MIT@ZIF-8成功递送到乳腺癌细胞系（BT-549和MDA-MB-231）中，4天后的摄取效率分别为11.8%和17.2%。CLSM成像显示这些外源性线粒体存在于受体癌细胞内，并观察到了移植线粒体与内源性线粒体之间的融合现象。Seahorse检测的功能分析显示，接受MIT@ZIF-8的癌细胞氧气消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）增加，表明线粒体功能得到改善。在治疗上，将这些非肿瘤性线粒体移植到癌细胞中显著抑制了癌细胞增殖，将MDA-MB-231细胞中的癌干细胞数量从95.5%降低到76.5%，并抑制了这些细胞的上皮-间质转化（EMT）过程。作者得出结论，这种基于MOF的生物矿化技术代表了线粒体研究和移植的一个进步，提供了一种保护线粒体活性并增强线粒体递送能力的强有力方法，具有潜在的癌症治疗用途。

另一种研究方向是探索cell@ZIF-8复合材料的潜力，目标是封装益生菌。益生菌是在适量给予人类或动物时能带来健康益处的微生物，因为它们可以维持、恢复和平衡肠道微生物群。这对于临床控制肠道感染尤为重要。然而，只有当益生菌以活性状态到达肠道目标部位时，才能实现其有益效果。然而，从实际角度来看，这代表了一个重要挑战，因为口服的益生菌在通过胃肠道的过程中会遇到强烈的酸性环境。这种酸性条件会严重损害益生菌的存活能力，限制了它们在恢复肠道菌群方面的效果。另一方面，肠道感染的临床治疗通常需要同时使用抗生素和益生菌。因此，为了确保治疗的有效性，开发出保护益生菌免受抗生素影响的策略至关重要，这样抗生素只杀死致病菌而不改变益生菌的存活能力和功能。

微囊化技术作为一种有前景的解决方案，可以解决这些问题，并在与抗生素联合使用治疗肠道感染时提高益生菌的存活能力。传统的微囊化技术涉及将益生菌固定在有机基质中。微囊化的关键方面是确保封装材料能够在作用部位释放益生菌细胞。纳米技术的进步导致了新型非生物涂层的开发，这些涂层能够在受到外部刺激时实现益生菌的靶向递送，同时保护它们免受胃肠道的恶劣环境。在这方面，Busscher及其同事研究了在各种非生物涂层中封装益生菌，如B. breve和L. acidophilus，包括（i）protamine辅助的SiO2纳米粒子卵黄-壳层涂层，（ii）藻酸盐水凝胶，以及（iii）ZIF-8。然后，作者比较了B. breve在模拟胃液（SGF††）和模型抗生素（即四环素）下的生物保护特性。SiO2卵黄-壳层封装是通过先将protamine薄膜预吸附到细菌细胞上，然后再暴露于SiO2纳米粒子胶体悬浮液上来实现的。SiO2纳米粒子在protamine薄膜上聚集，形成二氧化硅壳层。随后将protamine薄膜内化到细菌内部，在细菌细胞表面和纳米粒子壳层之间创建了一个空腔。藻酸盐水凝胶壳层是通过将B. Breve或L. acidophilus的PBS悬浮液逐滴加入CaCl2溶液中制备的。Ca2+离子与藻酸盐链之间的静电相互作用触发了微生物周围三维水凝胶的形成。最后，通过将醋酸锌的水溶液与预先混合的益生菌和HmIM的水分散液混合，沉积了ZIF-8涂层。作者证明，未封装的B. Breve细胞的ζ电位在整个pH范围内（从2（ζ = −0.1 mV）到9（ζ = −0.2 mV）保持负值。然而，protamine辅助的SiO2封装在整个pH范围内增加了ζ电位。例如，在pH = 2时，报道的ζ电位为ζ = 8 mV，而在pH = 9时，ζ电位为−18 mV。有趣的是，当使用ZIF-8作为细胞外骨架时，B. breve的ζ电位只在pH范围从7到9之间变化（见表1）。未报告封装在藻酸盐-水凝胶中的B. Breve细胞的ζ电位。通过XPS分析了cell@shell系统的元素表面组成。自由益生菌和cell@shell复合材料的元素组成明显不同，表明B. Breve和L. acidophilus在SiO2、藻酸盐和ZIF-8非生物涂层中的成功封装。然后，作者评估了每种非生物涂层对封装细胞（B. breve和L. acidophilus）存活能力的影响。通过菌落形成单位（CFU）技术确定了封装前后存活细胞的数量。细胞存活试验显示，在琼脂板上，涂有SiO2和藻酸盐水凝胶壳层的B. breve细胞的生长与未封装细胞（对照组）相当。然而，在琼脂板上，涂有ZIF-8的细胞显示出略微下降的细菌存活能力，表明MOF涂层具有增强的细胞毒性效应。为了评估不同非生物涂层可能造成的细胞壁损伤，作者使用了SYTO9/propidium iodide染色测试（BacLight细菌存活性试剂盒）。在这个实验中，具有细胞壁损伤的微生物呈现红色荧光，而没有细胞壁损伤的微生物呈现绿色荧光。这项研究得出结论，protamine辅助的SiO2涂层和藻酸盐水凝胶都没有损伤细胞壁。然而，ZIF-8涂层的形成引起了细胞壁损伤。作者推测这可能是由于细菌表面蛋白与锌阳离子之间的强烈相互作用。随后，作者确定了三种不同非生物涂层对SGF和抗生素四环素的保护作用。为了模拟益生菌在到达肠道感染部位时遇到的条件，将相同数量的未封装细胞和三种不同的cell@shell复合材料悬浮在pH = 2的SGF培养基中。然后，通过离心收集暴露的微生物并通过CFU测试进行分析。封装在ZIF-8和藻酸盐基壳层中的L. acidophilus在暴露于SGF后显示出约75%的存活率。相比之下，涂有SiO2卵黄-壳层的细胞存活率下降到50%。B. breve复合材料的获得结果表明，只有藻酸盐基涂层对细胞提供了有效的保护，防止了SGF的影响。同样，将涂覆和未涂覆的细胞培养在添加了模型抗生素（即四环素）的改良培养基中，然后对L. acidophilus和B. breve细胞进行CFU计数。L. acidophilus@shell复合材料的获得结果表明，没有任何非生物涂层能保护细胞免受带负电的四环素的影响。最后，作者进行了体外实验，以确定涂覆的益生菌对附着在肠道上皮层的致病性大肠杆菌的治疗效果。这个实验表明，B. breve@alginate与四环素协同作用，保护肠道上皮层免受四环素的侵害。除了益生菌外，研究人员还在研究酶（例如脂肪酶）的递送作为治疗策略，旨在提高消化效率，增强益生菌的存活能力和疗效，并改善代谢健康。2024年，Qi及其同事报告了使用ZIF-8外骨架对大肠杆菌进行工程改造，以实现脂肪酶的长期口服递送。首先将大肠杆菌的水分散液与脂肪酶混合，然后在搅拌下依次加入HmIM和Zn(NO3)2，持续10分钟；随后通过离心回收所得到的E. coli@ZIF-8复合材料，并用去离子水洗涤。透射电子显微镜（TEM）确认了每个大肠杆菌细胞周围形成了连续的ZIF-8壳层，而没有改变它们的棒状形态。共聚焦激光扫描荧光显微镜结合DPAI/SYTOX Green活-死染色和Cy5-脂肪酶成像，显示脂肪酶在ZIF-8外骨架中的均匀分布，并证明约10.3%的细菌在涂层后仍保持存活。红外光谱显示P–O伸缩带从1080 cm−1移动到1146 cm−1，这与细菌表面上的Zn2+和磷酸盐之间的配位一致，而X射线衍射（PXRD）图案与sod ZIF-8的拓扑结构相匹配。在模拟胃液（SGF，pH ∼ 2.0）和模拟肠道液（SIF）中，封装的脂肪酶分别保留了8.5%和23.4%的活性，而游离脂肪酶在SGF中的活性降至<5%，在SIF中严重受损，表明ZIF-8壳层提供了对胃肠道恶劣条件的保护。在BALB/c小鼠中口服给予Cy5标记的大肠杆菌@ZIF-8后，体内荧光成像显示其在胃肠道中的明显保留，因为脂肪酶@ZIF-8持续了约4小时，而E. coli&lipase@ZIF-8在给药后48小时仍然可检测到。最后，对48小时后主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）以及胃、小肠和大肠的组织学分析显示组织结构完整，没有炎症或损伤的迹象，证实了ZIF-8工程化大肠杆菌平台的生物相容性。

E. coli@ZIF-8复合材料还可以应用于生物修复。例如，2023年，Ghasemi等人通过仿生矿化合成了棒状的大肠杆菌@ZIF-8，方法是将大肠杆菌的水悬浮液与HmIM和Zn(OAc)2·2H2O混合，然后离心和干燥，得到了约3 µm的棒状颗粒，这些颗粒模仿了细菌的模板。SEM和PXRD分析确认了与sod ZIF-8拓扑结构的均匀涂层。然后将这些E. coli@ZIF-8颗粒（40 wt%）通过电纺（10 wt% PAN在DMF中，20 kV，15 cm）掺入聚丙烯腈（PAN）纳米纤维中，制备了E. coli@ZIF-8@PAN复合材料。所得材料随后用于苯甲酰脲杀虫剂（hexaflumuron和teflubenzuron）的薄膜微提取（TFME）。合成的E. coli@ZIF-8@PAN复合垫的性能通过与裸露的PAN和ZIF-8@PAN纤维垫进行比较，使用HPLC-UV评估了它们的提取效率。结果表明，E. coli@ZIF-8@PAN纤维的提取效果优于其他纤维垫。这一结果归因于将生物复合材料加入PAN纤维后增加了表面积和功能性基团的多样性。最近，Liu等人报道了使用ZIF-8和绿色改性剂柠檬酸（CA）对B. subtilis ZL09–26进行生物模拟矿化，形成保护性壳层（ZIF-8-CA），以增强菲（PHE）的生物降解。矿化是通过将B. subtilis与HmIM和醋酸锌共培养，随后进行表面改性实现的。SEM和EDS分析证实了形成了均匀的ZIF-8和ZIF-8-CA涂层，后者表现出更紧凑和带负电的壳层。封装的细菌在6天内显示出显著提高的PHE去除效率，达到了94.1%，这是未封装细胞的1.9倍。蛋白质组学和酶分析显示，MOF涂层减少了氧化应激，并上调了关键代谢途径，包括中心碳代谢和氧化磷酸化。此外，封装细胞在五次循环后仍保持了超过83.31%的降解效率，并表现出更好的活力和储存稳定性。这些结果强调了ZIF-8涂层在增强微生物抵抗性和环境压力下的生物修复效果方面的实用性。

最近的研究证明了即使在被封装过程中细胞被灭活，微生物@MOF的应用仍然是可行的。例如，Luzuriaga等人报道了将E. coli（CFT073）封装在ZIF-8中以治疗尿路感染。通过给予灭活的细菌或死亡细胞的裂解部分，可以产生针对细菌感染的免疫力。全细胞制剂含有特定于菌株的蛋白质，这些蛋白质可以触发对抗病原细菌的抗体产生。然而，全细胞疫苗往往无法提供长期的免疫保护，因为它们在体内的半衰期较短，且表面抗原会因严苛的固定方法而降解。因此，为了增强细胞表面抗原的生物保护作用，作者制备了E. coli@ZIF-8复合材料，方法是将醋酸锌水溶液与预先混合的细胞和水溶性HmIM水分散液混合。两种溶液都在盐介质（NaCl，100 mM）中制备，以保持细菌接近等渗状态。搅拌20分钟后，通过离心回收得到的复合E. coli@ZIF-8。然后，作者使用CFU测定法评估了封装细胞的活力。这个实验表明，ZIF-8壳层的形成过程本身就使细菌失活；这种效应是由于过度暴露于Zn2+导致细胞死亡。尽管如此，全细胞制剂面临的挑战是在最小程度损害表面表位（包括膜蛋白和寡糖）的情况下使细菌失活。为了证明封装过程在保持细菌天然蛋白质构象的同时使其失活，作者进行了凝聚试验，以监测细菌糖蛋白对碳水化合物的结合亲和力。这一测试表明，MOF涂层的生长不会显著影响表面表位。保留天然折叠的细菌蛋白质可能会产生比传统灭活方法更强的针对E. coli的免疫反应。为了验证这一假设，作者测量了注射了含有不同配方灭活E. coli的盐水溶液的小鼠的抗体滴度：（i）未涂层和热灭活的E. coli，（ii）甲醛固定的E. coli，以及（iii）E. coli@ZIF-8复合材料。用E. coli@ZIF-8复合材料免疫的小鼠产生了最高的抗体水平，而未涂层和热灭活的E. coli配方诱导的抗体产生最少。作者解释说，杀死细胞所需的高温度导致蛋白质和糖基表位的变性。相比之下，在E. coli@ZIF-8配方中，ZIF封装有助于防止蛋白质变性。此外，它通过延长E. coli@ZIF-8在组织中的存在时间，提供了 depot效应。

细胞@ZIF-8复合材料的另一个有吸引力的应用是用于能量存储。Gassensmith及其同事报告了使用E. coli@ZIF-8复合材料作为制备用于能量存储的层次多孔碳的软模板。E. coli@ZIF-8的制备采用了生物模拟矿化条件。然而，作者指出，与S. cerevisiae不同，E. coli的封装需要更高的配体与金属比例才能形成均匀的细胞涂层。E. coli@ZIF-8复合材料的TEM显微图显示形成了由紧密排列的纳米晶体组成的MOF壳层。有趣的是，E. coli@ZIF-8复合材料在77 K下收集的氮吸附等温线在P/P0为0.45–1.0时显示出滞后环。后者通常与吸附物在介孔中的毛细凝结有关。然后，孔径分布分析证实了存在约60纳米的介孔。介孔的形成归因于快速MOF成核过程中出现的晶体缺陷。随后，E. coli@ZIF-8复合材料经历了碳化过程以去除细菌物质。TEM图像显示，煅烧后的样品（calc-E. coli@ZIF-8）保留了起始生物复合材料的棒状形态。然而，与E. coli@ZIF-8不同，calc-E. coli@ZIF-8在棒状结构的内部分区域显示出的对比度降低。这一观察结果证实了生物实体的成功去除，导致材料具有高石墨碳含量。气体吸附等温线和孔径分布分析表明，calc-E. coli@ZIF-8材料保持了多孔性，证实了层次多孔碳（HPC）的形成。最后，作者比较了calc-E. coli@ZIF-8样品与calc-ZIF-8的电化学性质。循环伏安分析表明，calc-E. coli@ZIF-8表现出比calc-ZIF-8更好的电化学容量。总体而言，这项研究展示了细胞作为制备用于能量存储的层次多孔碳模板剂的潜力。最近，Teng及其同事使用E. coli@ZIF-8系统制造了生物纳米反应器。他们通过在E. coli中表达酒精脱氢酶（ADH）和葡萄糖脱氢酶（GDH），然后用ZIF-8涂覆细胞来实现这一点。ADH&GDH多酶级联催化系统在不对称还原酮类生成手性醇方面表现出高效率，对映选择性超过99%。研究人员还研究了E. coli@ZIF-8系统的可回收性。他们发现，尽管催化活性逐渐下降，可能是由于ZIF-8壳在酸性条件下的水解，但系统在四个循环后仍保留了80%的活性。同样，Wang及其同事报告了将两种细菌菌株（E. coli/pET28a-world和E. coli/pET28a-ladd2）封装在无定形的ZIF-90壳中，通过两步级联反应催化合成d-苯丙氨酸。使用E. coli@ZIF-90作为生物反应器生产d-PLA的产率为9.00克/升，转化率为89.4%。经过7个循环后，固定化的材料仍保持了43.8%的相对活性。在4摄氏度下储存9天后，固定化细胞的活性仍高于75%。相比之下，自由细胞在相同条件下几乎失去了活性。这证明了在不需要辅酶或中间产物的情况下，固定化细胞能够成功催化转化l-苯丙氨酸为d-PLA。此外，与自由细胞相比，固定化细胞表现出对高温、酸性、碱性和有机试剂以及金属离子的良好稳定性。这项工作表明，固定化细胞方法作为工业生产工具具有巨大的潜力，可用于经济高效的d-PLA生产。

最近，人们研究了从灭活微生物获得的细胞@MOF复合材料在生物传感中的应用。例如，Xiang及其同事报告了使用微生物@UiO-66-NH2作为诊断探针来检测结直肠癌。具体来说，使用了三种不同的微生物来制备细胞@壳层，包括（i）S. cerevisiae，（ii）E. coli（DH5a），和（iii）Synechocystis sp. PCC 6803（PCC 6803）。这些微生物在MOF涂层之前使用甲醛处理被灭活。然后，将休眠细胞悬浮在MOF前体（Zr(OnPr)4和H2BDC-NH2）的溶液中18小时。通过离心收集涂层细胞，并在60摄氏度下烘烤12小时。从三种不同的细胞@MOF复合材料中收集的SEM图像显示了均匀的无机涂层。这种人工涂层的结构表征证实了多孔UiO-66-NH2的形成。这种MOF的高表面积有助于固定生物相关分子，因为位于MOF壳外表面的Zr4+离子作为蛋白质固定的多个结合位点。接下来，作者将链霉亲和素（SA）吸附到MOF壳的外表面。然后，通过强烈的SA–生物素非共价相互作用固定了生物素化捕获探针。使用基于细胞计的分析技术，这些功能化的细胞@MOF复合材料被用来检测三种不同的miRNA生物标志物（miRNA-21、miRNA-17和miRNA-182）用于结直肠癌的检测。这项研究表明，由于大量蛋白质固定在细胞@MOF复合材料上，miRNA的检测灵敏度可以提升到皮摩尔级别。报告的miRNA-21、miRNA-182和miRNA-17生物标志物的检测限（LOD）值分别为0.75、0.30和0.25皮摩尔。

Chen及其同事开发了将酶（如菊粉酶和脂肪酶）和细胞（如S. cerevisiae）或细菌（如E. coli）共固定在一系列母体COFs（如NKCOF-98、COF-42-B和NKCOF-141）中的方案，以生产高效、稳定且可回收的级联生物催化剂（图7a和b）。本文研究的COFs基于1,3,5-三甲基苯和琥珀酰亚胺的衍生物，它们在是否含有亲水（NKCOF-98）、疏水（COF-42-B）或两亲性（NKCOF-141）官能团方面有所不同。作者表明，用NKCOF-98涂层并没有实现有效的表面覆盖，COF-42-B的涂层是不均匀的，只有NKCOF-141产生了均匀涂层的细胞。作者假设，由于细胞壁通常具有两亲性特征，NKCOF-141配体的两亲性质促进了COF在细胞表面上的均匀生长。作者进一步关注NKCOF-141进行生物催化测试。特别是，通过将菊粉酶整合到表达d-阿卢糖3-异构酶的E. coli细胞中，并用NKCOF-141进行涂层，作者开发了一种连续生产d-阿卢糖的流动反应装置。这些创新生物催化剂（例如，inulinase/E. coli@NKCOF-141）的性能显示，d-阿卢糖的生产率为161.3克/升每天，连续反应两周后初始催化效率仍保持超过76%。这表明，将酶和细胞共固定到COFs中可以导致创新的、可定制的生物催化平台，有利于开发高价值产品的酶–细胞级联生产。

细胞和酶在COFs中共封装的开创性例子。图中展示了酶&细胞@COFs的原位组装方法的示意图（a）以及一个代表性示例的SEM显微图（a）。另外还展示了在NKCOF-141中封装的inulin和E. coli/d-阿卢糖3-异构酶的连续流动反应示意图（b），以及室温（30摄氏度）和0.1毫升每分钟流速下连续流动反应随时间变化的d-阿卢糖含量（c）。该图经参考文献44许可改编（根据CC BY 4.0许可协议发布，https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。近年来，细胞@MOF复合材料被研究用于提高严格厌氧细菌的光催化性能，特别是在人工光合作用应用中。一个例子是M. thermoacetica：这种细菌利用太阳能和CO2作为唯一的碳源来生产醋酸，这对于碳修复应用非常具有吸引力。然而，M. thermoacetica对O2和活性氧（ROS）高度敏感，这降低了其作为光催化剂的性能。为了克服这一缺点，Yang、Yaghi及其同事报告了使用预合成的基于Zr的MOF（Zr6O4(OH)4(BTB)2(OH)6(H2O)6）来涂覆M. thermoacetica细胞，并利用基于Zr的涂层的ROS清除特性。作者测试了M. thermoacetica和M. thermoacetica@MOF在CO2光催化转化中的性能。研究表明，裸露的细胞在反应的第一天内只能固定CO2，因为ROS和O2副产品的积累导致了细胞损伤。相比之下，M. thermoacetica@MOF系统在2.5天内仍保持光催化活性。这些结果展示了细胞@MOF复合材料在增强增值化学品的生物生产方面的适用性。

除了研究活细胞的封装外，研究人员还致力于开发合成细胞样结构或系统，以在体外实现类似的生物功能。细胞能够高效且具有选择性地进行化学反应的能力，归因于细胞内特定反应介质和细胞成分的空间组织结构，这种结构使得细胞成分能够达到高浓度，并实现空间定向的运输。因此，制造出模拟细胞内部结构的微/纳米反应器（MNRs）成为仿生学研究中的一个活跃领域（图8）。这样的反应器可以被视为高度功能化的材料单元，它们既可以独立使用，也可以与其他材料基质结合，用作生物传感器、治疗手段，尤其是在生物催化方面（图187）。反应器中最关键的组成部分是外壳，也可以称作外骨骼。外涂层在反应器中扮演着双重角色：一方面提供对外部因素的坚固防护，另一方面调节物质和分子的运输。这一特性使得这些反应器能够执行特定的生物功能（图8）。

基于MOF的MNRs具有多种优势，包括对底物的尺寸选择性、保护内部客体免受外部环境因素的影响，以及利用具有不同催化剂的MNRs进行级联或并发催化反应的能力。最初，基于磷脂双层膜的脂质体是最常用的细胞类似反应器涂层类型（图188）。这是因为脂质体在结构上与自然界细胞膜的磷脂双层结构最为相似，因此它们有可能表现出与活细胞相似的状态和功能。除了脂质体，还开发了基于聚合物体（图189）、胶体体（图190）和蛋白质体（图191）的MNRs。然而，这些类型的MNRs仍然存在一些缺点，如膜通透性不佳、受到渗透压的限制、机械稳定性降低以及无法有效调节小分子。有机和混合框架材料的出现为设计类似的MNRs提供了新的途径，这些材料具有选择性的分子扩散能力和增强的保护作用。正如前文所述，MOF材料以其多孔性、可调合成性、可修饰性以及广泛的多样性而著称，这些特性使它们在多个领域成为有竞争力的工具。与活细胞的封装类似，MNRs的MOF外壳可以有效提升稳定性，为分子反应提供空间，并增加反应器的功能多样性（图192）。此外，MOF中可调的有机和金属成分能够创造出有利于反应器功能的丰富化学微环境（图193）。

基于Pickering乳液的核心特点是细胞具有隔室化结构，这保护了生物过程的完整性免受外部影响。因此，大多数类似细胞的MNRs也表现出明确的隔室化结构。为了实现这一结构特征，这些MNRs通常采用基于Pickering乳液的封装策略进行制备，即MOFs在乳液滴周围自组装形成外壳（图194）。尺寸大于MOF微孔的酶可以被封装进来，动态环境有助于在隔室内运输生物分子（图187）。此外，Pickering乳液策略还允许在油水（O/W）系统或水油（W/O）系统中封装具有不同性质的客体分子（图195）。例如，在W/O系统中，通过在油水界面自组装疏水性MOF纳米粒子，可以构建出称为MOF胶囊（MOF-Cs）的中空复合微球（图194）。通过沉淀聚合物可以增强胶囊的结构稳定性。Xu等人证明，这样的MOF-Cs具有调节分子迁移的MOF层、促进受限反应空间的中空结构，以及提供催化活性位点的封装能力（图187）。这些特性使得MOF-Cs能够封装不相容的物质，并促进串联反应中的质量扩散（图187）。因此，MOF-Cs可以与细胞相媲美，它们可以占据不同区域来隔离可能会相互干扰的酶或分子，同时允许外部分子自由扩散以进行反应。尽管某些疏水性分子（如有机染料和有机催化剂）具有出色的功能性，但由于其疏水性，将它们分散在水溶液中可能会阻碍实际应用。因此，研究人员将疏水性分子（也称为客体）引入油相，随后通过在水油界面自组装UiO-66-NH2纳米粒子形成稳定的O/W乳液（图196）。疏水性客体被封装在MOF-Cs内，随后沉积PMMA（图196）。成功将疏水性染料尼罗红（Nile red）封装在MOF-Cs中，提高了能量传递效率并促进了尺寸选择性的催化（图196）。因此，O/W系统对于利用疏水性分子非常重要。最近，研究人员致力于将单室MOF-Cs扩展为多室MOF微反应器，这种结构更接近于活细胞，能够催化级联反应。Tian等人通过一种通用的基于Pickering双乳液的界面合成方法制备了多层次多室MOF微反应器（图9a）（图9a）。稳定的Pickering双乳液（油-水-油双乳液，O/W/O）可作为结晶MOF结构在大型液-液界面区域形成的导向模板，从而创建密集的MOF层。双乳液系统受到多种力的影响，包括液滴表面之间的范德华力、由界面张力产生的液滴内在迁移相互作用，以及金属节点与有机连接剂之间的相互作用（图198, 199）。这些力共同影响了MOF外壳的形成。通过调整O/W液滴的体积分数，可以修改多室MOF微反应器的内部微观结构（图197）。结果表明，基于Pickering双乳液的合成方法具有很强的可扩展性（图197），这将进一步加速基于MOF的MNRs的快速发展和应用。MOF封装的MNRs结构逐渐趋近于活细胞的整体结构。MOFs既可作为反应器的外壳，也可作为内部分隔的关键元素，为基于MOF的细胞类似反应器和人工细胞提供了更广泛的可能性（图9）。

基于Pickering双乳液和多界面生长的多室MOF微反应器构建示意图（经参考文献197许可改编，许可协议为CC BY 4.0，https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/），以及MOF-MNRs与化学催化剂之间的静电相互作用示意图（图9b）。级联催化的发展

级联催化在自然系统中普遍存在，其中多个酶被限制在亚细胞隔室内。细胞内高效且高度选择性的催化反应系列对于维持正常的代谢过程和整个生物体的功能至关重要。除了必要的反应物和催化剂外，这些生物催化反应发生的空间环境尤为重要。更准确地说，受限空间可以有效隔离和分隔不相容的物质，而其中的级联反应可以通过促进中间体的扩散来增强催化剂之间的有效通信（图200）。鉴于这一自然现象，MOF-Cs被用来作为类似细胞的结构，将酶封装在胶囊内。外部MOF外壳具有类似细胞膜的功能，提供保护和尺寸选择性，从而确保特定的底物进入胶囊进行反应。保护和尺寸选择的能力归因于MOF-Cs的层次化孔结构，这是通过MOF纳米粒子（MOF NPs）的自组装实现的（图187）。特别是MOF NPs的内在微孔结构调节了分子运输，而胶囊内的中空结构则允许装载不同的酶。例如，Xu等人合成了含有UiO-66-NH2 NPs组分的W/O乳液中的MOF-Cs，并在其中封装了GOx（GOX@MOF-Cs）。他们的研究表明，GOx@MOF-Cs在不受外部环境中蛋白酶影响的情况下能够高效氧化葡萄糖（图187）。因此，MOF-Cs表现出运输、封装和分隔的能力。在一锅内实现生物级联反应

研究MOF-Cs是否能够实现类似的亚细胞或细胞间分子运输，从而实现级联反应将非常有趣。因此，除了GOx之外，Xu等人还在另一组MOF-Cs中封装了一种蛋白酶。这两种酶本身不兼容，但MOF外壳提供的保护使它们能够在同一系统中共存。实验结果表明，它们能够在串联反应中实现葡萄糖的生产和氧化（图187）。换句话说，MOF-Cs能够实现中间体的转移，使蛋白酶催化产生的葡萄糖能够到达GOx，从而将这两种酶联系在一起。在一锅内实现化学-生物级联反应

MOF MNRs不仅能够进行生物级联反应，它们还是无生物催化的反应器，因此扩展了仿生反应器能够催化的催化反应范围，例如实现化学-生物级联反应。化学催化剂比酶面临更严格的反应条件，酶容易受损，只能在相对温和的条件下工作。显然，生物催化剂和化学催化剂通常在不同的环境中运作，这使得将这两种类型的催化剂整合到一个统一的反应系统中进行级联反应变得具有挑战性（图201）。鉴于MOF-Cs的独特属性，研究人员成功建立了来自不同领域的催化剂之间的连接。Zhang等人在Pickering W/O乳液中合成了MOF-Cs，其中内部封装了酒精脱氢酶（AlcDH），并在胶囊的外部环境中分散了Pt化学催化剂。Pt化学催化剂与AlcDH之间的连接是通过NAD+和NADH之间的氧化还原反应建立的，结果显示Pt催化的甲酸盐消耗使AlcDH能够在同一锅中将丙酮酸转化为乳酸（图9b）（图9b）。MOF-Cs的隔室化效应有效地将化学催化剂和生物催化剂与周围环境分离。同时，MOF外壳显示出强大的运输性能，这一点通过NADH和NAD+在其内部的移动得到了证明，促进了两种催化反应之间的连接。在单个MOF微反应器中实现级联反应

之前提到的生物和化学-生物级联反应依赖于合成两个封装不同物种的MOF-Cs，并将它们放在一个锅中进行反应。然而，研究人员通过将不同的催化组分封装到多室化的MOF-Cs微反应器中，扩展了这种方法。如涂层策略部分所述，可以使用O/W/O Pickering双乳液导向的界面封装方法合成多层次多室MOF-Cs结构（图197）。MOF微反应器的多室结构类似于细胞中的亚细胞结构。每个内部O/W胶囊作为不同的分子隔室，而隔室外的走廊状部分有助于不相容分子的分散。此外，反应的中间体通过MOFs的孔隙进出隔室，从而完成级联反应。例如，研究人员验证了多室MOF微反应器表现出优异的封装效率和尺寸选择性。他们接着在微反应器的内部油相隔室和水相隔室中分别封装了两种不同的化学-生物级联催化剂：著名的Grubbs催化剂/CALB脂肪酶和GOx/Fe-卟啉（图197）。这两种级联反应的成功证明了多室MOF-Cs在级联反应中的良好适用性。未来，这类级联反应可能会在微反应器中应用于复杂的级联生物催化过程。未来的机会和挑战

关于封装在MOF、COF和HOF外壳中的活细胞的研究已经取得了相当大的进展，但仍有一些关键挑战和问题尚未解决。随着MOF这一新兴多孔材料领域的发展，我们主要将讨论这一类别。下面，我们将重点介绍几个有前景的方向，从先进的治疗手段到合成生物学，并强调必须克服的障碍，以实现大规模的应用。生物医学应用

下一代免疫疗法和协同组合策略



免疫疗法

癌症免疫疗法作为一种强大的临床治疗方法已经出现，它利用专门的细胞（如T淋巴细胞、NK细胞和树突细胞）和细菌介导的癌症疗法（BMCT）来针对恶性肿瘤。虽然BMCT利用了特定细菌菌株的天然肿瘤靶向能力，但临床应用一直受到系统毒性风险、细菌不受控制的增殖以及药物装载不足的阻碍。在这种情况下，将细胞封装在多孔框架（MOFs、COFs和HOFs）中提供了一种变革性的解决方案。框架外壳，特别是锌咪唑olate框架（ZIFs），在运输过程中物理上限制了与病原体相关的分子模式（如脂多糖）。这种屏蔽作用延缓了免疫系统的识别，并减少了到达肿瘤微环境之前的非目标炎症。协同递送的机会

该领域最重要的机会在于从简单的细胞载体向多功能组合疗法的转变。除了保护 cargos（货物）之外，多孔框架还可以作为双递送系统，将小分子化疗药物或免疫调节剂与细胞载荷共同封装。这些系统被设计为在响应肿瘤微环境特定刺激（例如，酸性pH值和高ATP浓度）时降解，从而确保治疗剂和生物载荷的同时、局部释放。此外，将能够分泌抗癌蛋白的基因工程细菌整合到这些封闭框架中，是提高药物装载能力并推进更强效组合疗法的高潜力途径。

下一代组织工程

在组织工程中，控制细胞之间的空间组织和通讯至关重要。多孔框架外骨骼可以被设计成促进或抑制特定的细胞-细胞相互作用，通过选择性地允许生长因子、细胞因子或其他信号分子扩散通过框架材料。这样的涂层还有助于细胞承受早期组织支架阶段常见的机械应力或营养波动。

将封装的细胞整合到更大的3D支架中是一个重大进步，在那里必须长时间（例如，数周和数月）保持生物相容性和结构稳定性。未来对混合材料的研究，结合有机聚合物（例如，胶原蛋白和海藻酸盐）与MOF/COF/HOF，可能会产生同时提供机械支持和分子筛选的复合支架。实现这一目标可能会提供新的方法来设计具有更高生存能力和功能性的组织，但这将需要新的表征方法（例如，原位成像外壳的完整性）和在复杂多组分系统中的标准化生存能力测试。

尽管具有前景，但确保从组织工程到癌症免疫疗法在内的体内应用中细胞@框架系统的安全性仍然是一个复杂的挑战。主要关切是MOF降解产物的生物相容性。虽然框架分解过程中释放的金属离子和有机连接器（例如，锌离子和咪唑衍生物）在低剂量下通常被认为是无毒的，但它们的局部积累可能在非目标组织中引起细胞毒性或加剧炎症。例如，在涂层过程中，观察到使用某些MOF涂层 protocol 时细胞的生存能力会下降。此外，即使细菌被减弱或封装， administration（行政）活细菌也存在持续的系统感染或细胞因子风暴的风险，如果框架过早降解或细菌负荷超过网状内皮系统的清除能力。此外，还有关于基于细菌的疗法的抗生素耐药性的担忧。ZIF封装的细菌通常表现出对抗生素和紫外线照射的更好的耐受性。因此，使用耐抗生素质粒——这会引发安全和监管问题——可能是不必要的，而紫外线消毒可以用来提高制造安全性，而不影响细菌的生存能力。在免疫疗法应用中，这将通过降低抗生素耐药性的风险并促进良好生产规范（GMP）协议来简化临床转化。

为了弥合实验室成功与临床应用之间的差距，未来的研究必须平衡外壳的稳定性和精确的降解性。材料设计应优先考虑具有固有低免疫原性的配体以及具有既定代谢清除途径的金属中心。最终，该领域必须超越简单的细胞毒性测试，转向严格的体内评估，包括长期免疫激活、生物分布和毒理学，以验证这些下一代细胞@MOF/COF/HOF疗法。

在生物制造中，下游加工，特别是蛋白质纯化，通常需要多个昂贵的步骤。虽然目前的细胞封装策略主要集中在细胞保护上，但有一个尚未充分利用的机会，即将框架外壳设计为选择性的半透膜，用于集成生产和纯化。通过调整封装多孔层的孔径和功能，研究人员可以为目标蛋白质、辅酶或其他生物分子设计选择性结合位点。目前大多数研究使用微孔外壳（例如，ZIF-8，孔径约3.4 Å），这些外壳能有效传输小营养分子，但限制了大分子蛋白质产品的扩散。通过转向介孔框架（孔径>2 nm），工程化框架外壳可以作为具有定义的分子量截止值的分子筛。这允许治疗蛋白从封装细胞中分泌出来，同时物理阻挡破坏性外源蛋白酶的侵入，从而在源头上保持产品的完整性。此外，通过用带电基团（例如，胺或羧酸）功能化孔壁，研究人员可以实现基于等电点的目标分子的原位分级，可能简化纯化工作流程并提高连续生物处理的可行性。

为细胞内的酶使用而设计的涂层

全细胞生物催化，其中酶在活细胞内表达和发挥作用，而不是作为自由酶，提供了包括增强酶稳定性和有效辅因子再生在内的优势，如在精细化学品的合成中所示。然而，即使在这种细胞环境中，酶的性能也常常受到快速降解、次优反应环境和未经控制的底物扩散的影响。工程化的多孔框架涂层提供了一种有前景的方法来解决这些挑战。通过将酶封装在定制的多孔框架外壳中，研究人员可以保护酶免受细胞内蛋白酶的破坏，同时创造一个增强催化性能的微环境。通过调整多孔层的孔径和表面功能，可以实现基于等电点的目标分子的选择性进入和产品输出，确保只有所需大小或化学性质的分子与封装的酶相互作用。

用人工膜涂层活细胞可以增强对生物催化过程的控制，提供诸如改善细胞和酶稳定性、选择性渗透性和保护免受外部压力源的好处，这在各种全细胞生物转化中得到了证明。然而，在平衡质量传输、维持催化效率和确保长期稳定性方面仍存在挑战。基于先进复合材料的人工细胞涂层，包括聚合物层、脂质双层和基于MOF/HOF/COF的外壳，可以提供一种可调策略，以优化底物扩散、催化微环境和底物/产品的连续分离/纯化，同时保护细胞免受抑制性条件的影响。

多孔壳的设计及其稳定性

MOF壳的第一个要求是它应对细胞代谢和凋亡途径的干扰降到最低，以维持细胞的存活。例如，不同浓度的不同阳离子显示出不同的细胞毒性效应；因此，应优先选择能够被活生物体更好容忍的阳离子。减少金属阳离子细胞毒性的另一种策略是促进MOF壳的快速自组装。另一种解决方法是设计完全有机的网络材料（例如，COFs和HOFs）。此外，在温和的水/缓冲条件下形成稳定且透气的壳仍然很复杂。例如，某些阴离子（例如，磷酸盐）或亲核基团（例如，COO−）的存在可能导致某些MOFs（例如，ZIFs）的分解。在框架设计中经常被忽视的一个方面是化学功能化对所用配体的影响。针对开发与细胞生长介质兼容的壳的多孔框架材料的研究对于在生物技术过程中的广泛采用至关重要。

在合成生物学和多孔框架细胞封装的交叉点可以发现令人兴奋的机会。例如，已经证明，功能化的MOF壳可以在外部刺激下分解，释放特定的蛋白质，从而改变环境，提高生物相容性。然而，一个重大的概念改进可能涉及预先编程的细胞生物途径，通过感知细胞微环境的变化，使细胞能够触发多孔壳的修改。例如，如果细胞检测到ROS（活性氧）升高，反馈回路可能会诱导框架的降解，释放保护性的天然产生的（酶和维生素）或人工抗氧化剂。

在人工孢子制造领域的一个挑战是建立稳健的制造过程，以确保可重复性和一致的材料性质。保护壳的形成是一个高度敏感的过程：它严重依赖于诸如框架的前体比例和浓度、细胞类型和密度、反应时间和温度、使用的特定介质以及随后的后处理（例如，洗涤）等因素。这些参数中的任何小偏差都可能改变壳的厚度、均匀性、晶体相和细胞的生存能力。在当前的批式合成方法中，这些参数中的任何小偏差都可能导致批次间的显著差异，阻碍可靠的数据比较和产品验证。

为了解决这些不一致性，该领域必须转向自动化、连续的生产方法。虽然已经成功地使用连续流动方法对蛋白质@ZIF系统实现了对颗粒大小和晶体相的控制，但这项技术尚未用于细胞@MOF、COF或HOF系统。实施微流控或连续流动反应器为实现克级生产提供了有希望的途径。这些系统允许仔细调节前体浓度、温度、pH和混合动态，预计将产生可靠、均匀的涂层和高细胞存活率。可重复的大规模涂层活细胞与精细调整的多孔框架壳将推进细胞@MOF/COF/HOF的工业应用。

技术升级本身是不够的，还需要建立严格的社区标准。未来的努力应集中在开发标准化协议上，从框架前体溶液的制备到封装后的洗涤或储存的每一个步骤都必须详细说明。此外，应鼓励社区系统地发表成功和次优实验的详细信息（例如，那些导致部分壳或较低存活率的实验）。建立这样的透明度将创建稳健的基准，允许研究人员验证新的涂层策略，并在不同实验室之间比较数据集。最终，将先进的连续制造与标准化报告相结合，对于加速细胞@框架材料从概念验证研究到高通量工业应用的转化至关重要。

总之，基于MOF、COF和HOF的涂层功能属性为从分离技术到医疗治疗的细胞应用提供了前所未有的机会。通过 engineering（工程）框架材料，控制孔径分布、孔化学、刺激响应行为以及承载和共同递送功能剂的能力，研究人员可以设计新型的微生物疗法和工程组织。然而，仍然存在重大的科学和监管障碍，包括可重复性挑战、存活能力的稳健评估、精细调整的“按需”降解性、大规模过程优化和安全性评估。通过化学家、材料科学家、生物工程师和临床研究人员之间的跨学科合作，可以解决这些挑战，使涂有孔壳的细胞克服细胞技术在工业生物催化和生物医学中的当前限制。

作者贡献

FC和MVH：数据整理、可视化、写作——原始草稿；AEM、DK、QW、RK、LYC、JG、FKS、CD：写作——原始草稿；PF：概念化、可视化、资金获取、项目管理、写作——原始草稿；FC和PF：写作——审查和编辑。

没有需要声明的利益冲突。

数据可用性

没有包括任何主要研究成果、软件或代码，也没有作为本综述的一部分生成或分析任何新数据。补充信息：视频S1展示了人工细胞涂层作为分子筛的作用。详见DOI：https://doi.org/10.1039/d4cs00071d。

致谢

我们感谢PMWS Lead Project (LP-03)和TU Graz的支持。

注释

†

同等贡献。

当前隶属机构：Belgium Leuven的Center for Membrane Separations, Adsorption, Catalysis, and Spectroscopy (cMACS)，B-3001。

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凋亡描述了细胞的有序崩溃，其特征是膜泡胀、细胞收缩、染色质浓缩和DNA片段化，随后被邻近细胞迅速吞噬。这是一个调节过程，对于维持组织稳态、胚胎发育和免疫系统功能至关重要。凋亡的失调可能导致各种病理状况，例如癌症（例如细胞永生化）和退行性疾病。

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坏死是一种被动的、偶然的细胞死亡，由环境扰动触发，导致炎症细胞成分的无调控释放。

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可培养性被定义为单个细胞产生可被观察者识别的群体的能力，通常是在营养琼脂平板表面形成的可见菌落。这类基于文化（或特定环境）的技术已经使用了许多十年，积累了大量有条理的信息，并且在以相对较低的成本保护公共卫生方面展现了良好的效果。147,217

**F2N12S：N-[[4′-N,N-二乙氨基-3-羟基-6- flavonyl]-甲基]-N-甲基-N-(3-磺丙基)-1-十二烷胺基】是一种荧光染料，其对脂质双层中的脂质排列状态具有高度敏感性。218

††SGF：模拟胃液，一种实验室制备的溶液，用于模拟人体胃内的酸性环境。