**摘要**
**背景**
免疫细胞转录组的变化可以预测临床结果。这些效应可能是手术特有的，并可能受到糖皮质激素的调节。我们研究了接受全膝关节置换术（TKA）患者的免疫反应以及地塞米松对该反应的影响。
**方法**
使用Nanostring nCounter平台和Immunology V2试剂盒，对63名接受TKA并在围手术期接受地塞米松（DXM，n=46）或安慰剂（n=17）治疗的患者的全血中的转录本水平（n=579）进行了分析。样品在手术前和术后第一天（POD1）收集。
**结果**
地塞米松诱导了113个基因的差异表达（|log2倍数变化| > 0.5，校正后的p值[p-adj] < 0.05）。通过过度表达分析（ORA）进行的通路富集分析显示IL6/JAK-STAT3信号通路上调（p-adj 0.016），而与移植物排斥相关的通路下调（p-adj 0.032）。免疫反应本身也诱导了169个基因的差异表达，但ORA仅发现移植物排斥通路具有显著性（p-adj 0.016）。细胞类型解卷积显示地塞米松增加了粒细胞的百分比（69.6% vs 73.6%，p-adj = 0.005），并减少了B细胞和浆细胞的百分比（10.1% vs 8.4%，p-adj = 0.016）。在DXM组和安慰剂组中，POD1时的粒细胞百分比存在显著差异（73.6% vs 70.1%，p-adj = 0.048）。
**结论**
在TKA围手术期使用地塞米松会导致与IL6-JAK/STAT3信号通路相关的基因差异表达，这是通过Immunology V2试剂盒检测到的。然而，这一结论并未得到现有文献的支持，也可能与基因差异表达的排名解释有关，很可能由于技术原因所致。未来的研究应关注更广泛的基因组学面板、不同的技术方法或改进的质量控制措施，以更全面地表征TKA和地塞米松对免疫反应的影响。
**编辑评论**
这项转录组子研究显示，围手术期使用地塞米松并非简单地抑制免疫反应，而是显著地重塑了全膝关节置换术后的早期全血免疫反应。然而，该研究仅考察了单次围手术期剂量后的早期免疫状态，因此无法评估与炎症和损伤相关的循环生物标志物以及临床结果之间的纵向关联。因此，这项研究应被视为提出假设的起点，需要在进一步的多模态、以结果为导向的研究中验证地塞米松的广泛临床效应。
**1 引言**
全膝关节置换术（TKA）的外科创伤会立即引发免疫反应，先天免疫细胞被招募到受伤部位以启动炎症、清除碎片并促进组织重塑[1]。同时，补偿性的免疫抑制反应会导致适应性免疫反应减弱[2]。愈合过程涉及先天免疫细胞和适应性免疫细胞之间的协调和复杂相互作用，共同参与组织修复[3]。为了确保适当的愈合，T辅助1（Th1）细胞和T辅助2（Th2）细胞之间的微妙平衡对于调节术后免疫反应至关重要。naive CD4+ T细胞分化为Th1或Th2细胞取决于手术创伤部位存在的细胞因子和白细胞介素。Th1反应与免疫监视和增强CD8+ T细胞的细胞毒性有关，而Th2反应则导致适应性免疫抑制，最终促进组织重塑和愈合[4]。TKA相关的组织重塑有利于术后恢复，而免疫失调则与术后并发症风险增加相关[5-8]。免疫反应是更大范围的外科应激反应的一部分[9]，也会影响下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴和代谢，减少术后免疫失调的努力可能有助于预防并发症。围手术期使用糖皮质激素作为一种可能的干预措施，因为它们的免疫调节作用可能减弱外科应激反应[10-14]。研究表明，甲基泼尼松龙可增加健康志愿者的中性粒细胞数量并减少CD4+ T细胞数量[15]。在择期全髋关节置换术中，甲基泼尼松龙增加了中性粒细胞和CD14+单核细胞的数量，同时降低了CD4+/CD8+细胞的比例，且CD14+单核细胞的增加与临床恢复改善相关[5]。此外，甲基泼尼松龙还能减弱手术触发的多种细胞内信号通路[16]。临床数据显示，糖皮质激素可以减少TKA后的恶心、呕吐和疼痛[17-19]。尽管糖皮质激素在TKA和THA中的临床效果已有充分描述，但迄今为止仅深入研究了与THA相关的免疫信号通路及其影响。因此，关于TKA特异性信号通路的研究可以填补现有文献的空白。在本研究（DEX-2-TKA试验的子研究）中，我们假设围手术期使用地塞米松会在TKA术后第一天（POD1）改变免疫反应。我们通过测量随机临床试验DEX-2-TKA期间收集的全血样本中的免疫反应转录谱，来表征这种改变。
**2 方法**
本研究是多中心随机试验DEX-2-TKA（ClinicalTrials.gov: NCT03506789；丹麦西兰地区伦理委员会标识符：SJ-695；EudraCT 2018-001099）的子研究。该研究得到了丹麦西兰地区伦理委员会（SJ-887）和丹麦数据保护局（REG-174-2020）的批准。由于研究是回顾性的，因此无需重新获取知情同意。这些批准也包括了一项蛋白质组学研究（Mølgaard等人[20]）。DEX-2-TKA试验比较了一次或两次地塞米松剂量与安慰剂对TKA术后阿片类药物需求和疼痛的影响[18]。干预措施在麻醉诱导后（以下简称基线）和24小时后实施。患者被随机分配到以下组别：静脉注射24毫克地塞米松两次、围手术期使用24毫克地塞米松以及安慰剂两次（图1A）。安慰剂为等渗盐水[18]。
**（A）CONSORT图根据干预措施、血液采样和样本纳入本研究的示意图时间轴进行了调整。蓝色代表地塞米松，绿色代表安慰剂。图由BioRender.com制作。**
（B）由地塞米松治疗引起的差异表达（DE）基因的火山图。
（C）根据Th1和Th2反应分层的（A）和（D）中上调和下调的前五个基因。
（D）由全膝关节置换术引起的免疫反应导致的DE基因。n表示数量；T表示手术开始后的时间（小时）；POD表示术后第一天；log2FC表示log2倍数变化；p-adj表示校正后的p值；DXM表示地塞米松。在本研究中，我们重点关注地塞米松对基线和术后第一天早晨（Post-Operative Day 1；POD1）之间转录变化的影响。因此，我们将两个地塞米松治疗组合并为一个组（称为DXM），因为第二次干预是在POD1时进行的血液采样之后（图1A）。在研究开始前，通过文献回顾和专家讨论确定了研究糖皮质激素和对重大关节置换术免疫反应影响的关键基因列表：CCL-、IFN-、IL-和TNF家族基因[1, 2, 21-23]，NR3C1（糖皮质激素受体，GR）及其共调节因子（NCOR1、SRC1、GRIP1）[23-27]，TSC22D3（GILZ）[23, 24, 26]，BCL-2、BAX、BIM和PUMA[24]，STAT3、p38 MAPK、AP-1和NF-κB等[6, 15, 16]。这些基因突出了手术诱导的免疫反应与糖皮质激素作用之间的关键通路，强调了它们作为优化手术结果和恢复的生物标志物或治疗靶点的潜力。
**2.1 结果**
我们的主要结果是围手术期地塞米松对基线和POD1之间相关转录本的影响。次要结果是TKA本身对基线和POD1之间相关转录本的免疫反应。
**2.2 血液采样**
血液样本在手术当天到达医院时以及术后每天大约早上8点收集。干预措施在0小时和24小时进行（图1A）。全血使用PAXgene Blood RNA管（PreAnalytix GmbH；Feldbachstrasse；8634 Hombrectikon；CH）采集。样品在室温下储存2小时后，冷冻至-20摄氏度至少24小时。24小时后，样品转移到西兰地区生物库并储存于-80°C冷冻柜中。
**2.3 样本制备和Nanostring基因表达面板**
样本在西兰大学医院Køge外科手术科学中心的实验室进行分析。总RNA使用Paxgene Blood RNA kit V2（Qiagen，Franklin Lakes，NJ，美国）提取。RNA的数量和质量分别使用NanoDrop spectrophotometer ND-8000（NanoDrop Technologies）和Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，Palo Alto，CA）进行检测。Message-AmpTM III RNA扩增试剂盒（Ambion，Austin，TX）将300 ng纯化的总RNA转化为生物素标记的aRNA，然后使用Nanostring nCounter Human Immunology V2 Panel（Nanostring Technologies，530 Fairview Ave N，Seattle，WA 98109）进行片段化和杂交。该面板包含579个内源性基因、15个内部参考/管家基因、8个阴性基因和6个阳性“假”基因（详见支持信息）。选择此面板是因为它包括了先前文献综述中确定的126个基因中的92个，这些基因涵盖了TNF-、NF-kB-和T细胞受体信号等核心免疫过程。
**2.4 数据分析**
数据分析使用R版本4.4.1进行。数据的质量控制（QC）和标准化遵循Bhattacharya等人描述的迭代过程[28]。质量控制包括评估技术样本质量、主成分分析（PCA）图、Spearman相关性热图和基因计数直方图。数据通过上四分位数标准化并进行方差稳定化转换。使用RUVSeq包（v1.38.0）的‘RUVg’函数估计了不必要的变异。一个转录本计数非常低的样本以及与患者匹配的样本被排除，同时排除了所有POD2的样本。对原始数据进行了背景阈值处理。为了最终标准化，从数据集中去除了两个不必要的变异向量。使用DESeq2包（v1.44.0）的‘DESeq’函数通过Wald显著性测试识别差异表达（DE）基因[29]，实验设计公式为=W_1 + W_2 + dex + time + dex:time。主要结果从dex:time相互作用中提取，次要结果从时间中提取。使用Benjamini-Hochberg方法进行了多重检验校正，除非另有说明，否则将调整后的p值（p-adj）< 0.05视为显著。DE基因使用‘EnhancedVolcano’包（v1.22.0）进行可视化[30]。使用‘clusterProfiler’包（v4.12.6）和Hallmark数据集（[32, 33]）进行通路富集分析[31]，以比较DE基因与整理的数据库，从而确定这些基因可能反映的疾病状态/生理功能。ORA概念上与基因集富集分析（GSEA）相关，但通常适用于较小的数据集。Hallmark基因集反映了生物学状态和过程（如炎症、凋亡等）[33]，它是Molecular Signatures Database（MSigDB）[32]的一个子集，旨在消除基因冗余和生物学过程的异质性。使用CIBERSORTx（https://cibersortx.stanford.edu/）进行细胞类型解卷积，以基于DE基因预测细胞类型比例[34]。使用了包含22种免疫细胞类型的修改版Leukocyte Matrix（LM22）数据集作为签名参考矩阵，并过滤出T细胞（CD4+、CD8+和γδ）、NK细胞、B细胞/浆细胞、单核细胞和树突状细胞的签名。值得注意的是，由于参考矩阵的基因重叠有限，我们的数据集中仅预测了CD4+ T细胞、B细胞/浆细胞、粒细胞和NK细胞的存在。基于标准化数据，训练了一个事后随机森林模型来将样本分类为术前（基线）或术后第一天的干预组（DXM或安慰剂）。一个能够正确分类样本的随机森林模型可以支持数据集中的地塞米松和时间特异性转录组模式。数据集被随机分为70%/30%的训练集和测试集。随机森林模型使用了500棵树进行拟合，调整参数mtry在10折交叉验证中进行了优化。还使用类似的设置进行了留一法交叉验证敏感性分析以检查调整参数的稳健性。预测因子的重要性通过Gini的均值减少来提取。使用了R统计软件包randomForest [35]、caret [36]和pROC [37]。
**2.5 人口统计数据**
各组之间在临床变量（表1）或基线时的DE基因（支持信息）方面没有发现差异。表1. 患者人口统计信息。学生t检验用于连续数据，Mann–Whitney U检验用于中位数分析，Fisher精确检验用于分类数据。安慰剂组（N=17）
地塞米松组（N=46）
总计（N=63）
p值
性别
男性：5（29.4%）；18（39.1%）；23（36.5%）；0.56
女性：12（70.6%）；28（60.9%）；40（63.5%）
年龄（岁）中位数（最小值，最大值）：73（61, 86）；72（48, 87）；72（48, 87）；0.27
ASA评分：
1：4（23.5%）；7（15.2%）；11（17.5%）；0.61
2：9（52.9%）；30（65.2%）；39（61.9%）
3：4（23.5%）；9（19.6%）；13（20.6%）
身高（cm）平均数（标准差）：167（10.1）；171（8.74）；170（9.21）；0.15
体重（kg）平均数（标准差）：78.6（13.9）；84.8（17.5）；83.1（16.7）；0.15
BMI（kg/m²）平均数（标准差）：27.9（3.68）；28.6（4.66）；28.4（4.40）；0.55
麻醉类型：
脊柱麻醉：14（82.4%）；38（82.6%）；52（82.5%）；1.00
全身麻醉：2（11.8%）；6（13.0%）；8（12.7%）
从脊柱麻醉转为全身麻醉：1（5.9%）；2（4.3%）；3（4.8%）
膝关节置换类型：
非水泥固定型：1（5.9%）；3（6.5%）；4（6.3%）；1.00
水泥固定型：16（94.1%）；43（93.5%）；59（93.7%）
手术时间（分钟）中位数（最小值，最大值）：56 [47, 100]；57 [40, 87]；57 [40, 100]；0.73
3 结果
从2019年9月23日至2020年3月10日期间共收集了64名患者的135个样本，并在2022年3月3日至2022年8月15日期间进行了分析。基线样本的收集时间为07:10至12:00（中位数08:16），POD1样本的收集时间为07:15至09:16（中位数08:03）。样本采集间隔时间为平均23小时43分钟（最短20小时13分钟，最长25小时44分钟）。有10个样本被排除：8个是在第二次干预后收集的，1个是因为转录本数量过低，以及相应的患者匹配样本也被排除。因此，共有63名患者的125个样本被纳入数据分析（图1A）。质量控制（QC）和标准化指标在支持信息中提供。背景阈值处理排除了150个基因，将数据简化为429个内源基因。此外，还去除了两个不必要的方差向量。
3.1 主要结果：地塞米松的效果
通过比较接受安慰剂的17名患者和接受围手术期地塞米松的46名患者，研究了静脈注射24毫克地塞米松对TKA诱导的免疫反应的影响。共有113个基因的表达发生了显著变化（61 ≥ 0.5 log2FC，52 ≤ −0.5 log2FC，p-adj < 0.05；图1B、图2和支持信息）。ORA发现地塞米松影响了五个通路（p值 < 0.05）。在调整p值后，只有两个通路仍然显著：IL6-JAK/STAT3信号通路的上调（p-adj 0.016）和与移植物排斥相关的通路的下调（p-adj 0.032；表2）。
（A）由于围手术期地塞米松（DXM）导致差异表达（DE）的基因热图，变化幅度大于0.5 log2FC。列（匿名样本）按干预组（安慰剂或DXM）和时间（术前或术后）进行聚类。（B）由于DXM导致差异表达（DE）的基因的Spearmann相关性图，变化幅度大于0.5 log2FC。（C）安慰剂组中差异表达（DE）的基因热图，即对全膝关节置换术（TKA）的免疫反应。列（匿名样本）按时间（术前或术后）进行聚类。（D）由于对TKA的免疫反应导致差异表达（DE）的基因的Spearmann相关性图。图2A–D也包含差异表达（DE）大于1.0 log2FC的基因。DXM，地塞米松；0，术前；1，术后第1天。表2显示了通过Over-Representation Analysis（ORA）方法发现的受地塞米松（DXM）或对全膝关节置换术（TKA）的免疫反应影响的通路。
3.2 次要结果：免疫反应
通过比较接受安慰剂的17名患者和接受围手术期地塞米松的17名患者在POD1时的免疫反应，研究了TKA诱导的免疫反应。共有169个基因的表达发生了显著变化（68 ≥ 0.5 log2FC，101 ≤ −0.5 log2FC，p-adj < 0.05；图1D和图2以及支持信息）。ORA识别出四个受显著影响的通路（p值 < 0.05）。在调整p值后，只有与移植物排斥相关的通路下调（p-adj 0.016）仍然显著。细胞类型去卷积分析发现免疫反应对估计的细胞比例没有影响（图3和支持信息）。
3.3 后验随机森林分析
随机森林模型正确分类了77.8%的测试集样本（95%置信区间：60.9%–89.9%，p = 0.0006），Cohen's κ = 0.62，表明一致性较高。混淆矩阵见表3。CD36、LILRB4和LILRB1是最重要的预测因子。十折交叉验证的平均准确率为74.3%，κ = 0.56（最佳模型：mtry = 458）。留一法交叉验证的宏平均多类曲线下面积（AUC）为0.84。表3显示了混淆矩阵和随机森林模型统计信息。
4 讨论
本研究考察了全膝关节置换术和围手术期静脉注射24毫克地塞米松治疗对429个与免疫反应相关基因的影响。免疫反应导致了169个基因的表达差异（DE），而围手术期地塞米松的单独作用导致了113个基因的表达差异。有68个DE基因在这两种结果中都有上调或下调，而只有9个基因的表达因结果不同而相反。ORA表明地塞米松上调了IL6-JAK/STAT3信号通路，而TKA的免疫反应和地塞米松都下调了与移植物排斥相关的通路。估计的细胞比例显示地塞米松降低了术前B细胞和血浆细胞的比例，并在POD1时增加了粒细胞的比例。此外，与安慰剂相比，地塞米松在POD1时增加了粒细胞的比例。考虑到我们使用了专门设计用于评估免疫反应的基因面板，并且假设手术会引发地塞米松可以调节的免疫反应，预计TKA和地塞米松会影响大量基因。令人惊讶的是，只有9个基因的表情因情境不同而相反，因为地塞米松通常被认为是抗炎的，而手术一般被认为是促炎的。因此，我们没有预料到有68个基因在不同情境下表现出相似的上调或下调。使用靶向基因面板推断生物学通路的局限性在于它引入了针对特定基因选择所富集通路的偏见。此外，数据库对于它们的基因簇有特定的范围（即生物过程或疾病）。将数据库的选择限制在Hallmark基因集上是为了减少通路之间的冗余并避免假阳性结果。然而，由于DE基因之间的大量重叠，移植物排斥过程被TKA和地塞米松都下调了。但这不应解释为TKA保护了移植物排斥，而是因为TKA引起的DE基因模拟了移植物排斥中观察到的基因簇。令人惊讶的是，ORA显示地塞米松上调了IL6-JAK/STAT3信号通路。这是违反直觉的，因为已知糖皮质激素会减弱JAK/STAT信号通路[16]，而IL6和TNF-α对手术的反应[10, 11]。不过，这一发现可能是假阳性结果，因为这两个标志基因在质量控制期间（IL6；支持信息）或在ORA中被排除，因为它们的表达差异小于0.5 log2FC（STAT3 log2FC 0.37，p值5.09 × 10−8，p-adj 4.2 × 10−7，数据未展示）。因此，使用有限的靶向基因面板可能不是研究TKA和地塞米松生理效应的正确方法，即使使用了经过验证的数据方法和单个数据库通过ORA进行推断（Hallmark基因集[33]）。基于排名的过滤可能允许进行有针对性的分析，但无法整合数据中的更大模式。由于ORA的结果最多只是中等程度的确信，手动解释表达上调和下调的前五名基因（表4和表5以及支持信息）表明地塞米松促进了Th2免疫反应，而TKA促进了先天免疫反应，包括M2巨噬细胞的水平增加。然而，糖皮质激素通常被认为会增强Th2细胞免疫反应并抑制Th1细胞反应[24, 26, 38]，这一基于排名的过滤结果支持了这一点。然而，糖皮质激素也被认为具有情境（生理状态与病理状态）和亚组特定的效应（例如，诱导TLR2与抑制TLR信号通路[26]）。表4总结了地塞米松治疗导致的上调和下调的前五名基因。
缩写：DXM，地塞米松；POD1，术后第1天。总体而言，随机森林模型在分类性能上表现良好，特别是在基线和安慰剂POD1样本方面。这些发现表明存在不同的基因表达模式，可以根据时间点和地塞米松治疗来区分样本。该基因的下调也与向Th2型免疫的转变及远离Th1型免疫的趋势一致。GZMB
−1.29
9.58 × 10−8
丝氨酸蛋白酶
由自然杀伤（NK）细胞和细胞毒性CD8+ T细胞分泌。参与抗癌和抗病毒免疫。在接受静脉注射地塞米松治疗的患者中，由于向Th2细胞介导的免疫转变，该基因可能下调，从而导致Th1相关免疫反应减弱。MX1
−1.41
9.75 × 10−4
细胞质蛋白，GTP酶
参与细胞抗病毒反应。由I型和II型干扰素诱导。能针对DNA和RNA病毒
地塞米松治疗可能导致干扰素水平降低，从而解释该基因的下调。FCER1A
−1.99
3.06 × 10−9
α多肽
存在于嗜碱性粒细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞中，其激活会引发炎症性细胞因子的分泌
由于其他免疫反应受到优先处理，该基因可能下调。缩写：CD163，分化簇163分子编码基因；CD36，分化簇36（血小板反应蛋白受体）编码基因；FCER1A，IgG Fc ε受体Ia编码基因；FCGR1A/B，IgG Fc片段高亲和力Ia或Ib受体编码基因；GBP5，鸟苷酸结合蛋白5编码基因；GZMB，颗粒酶B编码基因；IL18R1，白细胞介素18受体1编码基因；IL1R2，白细胞介素-1受体2型编码基因；IL1RL1，白细胞介素-1受体类似物1编码基因；log2FC，对数变化倍数；MX1，MX动力蛋白样GTP酶1编码基因；p-adj，调整后的p值。表5. 总膝关节置换术引发的免疫反应导致的上调和下调前五名基因总结。安慰剂组中POD1与基线的对比
基因
Log2FC
p-adj
特征
相关性
解释
ARG1
2.76
5.15 × 10−29
酶
M2巨噬细胞的特异性标志物。M2巨噬细胞参与组织重塑，在手术后可能上调。S100A8
1.85
3.39 × 10−16
钙结合蛋白
参与促炎信号传导。与S100A9一起形成称为calprotectin的异二聚体。手术后的S100A8和Calprotectin水平通常升高。S100A9
1.59
1.63 × 10−37
钙结合蛋白
参与促炎信号传导。与S100A8一起形成称为calprotectin的异二聚体。手术后的S100A8和Calprotectin水平通常升高。CD163
1.44
3.62 × 10−13
膜蛋白 marker
特异性针对M2亚型巨噬细胞，并在急性期调节。M2巨噬细胞参与组织修复并促进Th2免疫反应。LILRA5
1.42
6.59 × 10−25
白细胞免疫球蛋白样受体（LIR）家族
对该基因和蛋白质了解不多。可能参与白细胞的激活和抑制。可能表明手术后白细胞活性增加。CD5
−1.11
1.58 × 10−21
糖蛋白
T细胞和某些B细胞的通用标记物。可能表明手术后细胞免疫减弱。IL-8
−1.16
4.24 × 10−7
促炎细胞因子
由巨噬细胞分泌。作为趋化因子吸引中性粒细胞到炎症/感染部位。巨噬细胞在IFN-γ的作用下产生IL-8。下调可能是由于NK细胞和细胞毒性T细胞产生的IFN-γ减少。LEF1
−1.17
1.37 × 10−10
DNA结合蛋白
在激活的T细胞上表达。可能表明手术后T细胞水平降低，从而细胞免疫减弱。TCF7
−1.18
3.82 × 10−7
转录因子
参与T细胞分化。下调可能表明适应性免疫反应受到抑制。CD40LG
−1.20
7.29 × 10−20
膜蛋白
在T细胞上表达，并与抗原呈递细胞上的CD40结合。CD40LG基因的下调与细胞免疫相关反应的减弱一致。缩写：ARG1，精氨酸酶1编码基因；CD163，分化簇163编码基因；CD40LG，分化簇40配体编码基因；CD5，分化簇5编码基因；IL8，白细胞介素8编码基因；LEF1，淋巴细胞增强因子编码基因；LILRA5，白细胞免疫球蛋白样受体A5编码基因；log2FC，对数变化倍数；p-adj，调整后的p值；POD1，术后第1天；S100A8，S100钙结合蛋白A8编码基因；S100A9，S100钙结合蛋白A9编码基因；TCF7，T细胞特异性，HMG-box编码基因。尽管我们的ORA分析未能提供有意义的见解，且一些DEGs与组织修复和Th2反应相关（尤其是ARG1、IL1RAP、IL4R），但仅基于上调和下调前五名基因得出生理效应的结论会简化数据。术后免疫变化会持续数周[14]，适应性免疫反应可能在术后长达1个月内发生变化，具体取决于手术类型。此外，糖皮质激素在术后1小时起就影响免疫反应，并至少持续48小时，尤其是在适应性免疫系统中影响最明显[16]。因此，本研究应被视为基于目标基因组在TKA术后13–22小时观察到的免疫变化的快照。例如IL1R2，它是地塞米松组中上调最多的基因，因为IL1R2被认为是一种快速响应基因。然而，本研究受限于缺乏外部验证，但随机森林模型显示了可接受的准确性，表明结果具有合理的稳健性，并且在类似的研究中可能具有可重复性。我们的细胞类型去卷积结果与之前关于糖皮质激素效应的研究一致，因为发现地塞米松治疗导致粒细胞比例上升[16]。例如，使用流式细胞术对样本中的总免疫细胞类型进行验证作为真实值，有助于对细胞组成变化做出具体结论。在基准研究中，细胞类型去卷积与真实值技术的相关性良好（Pearson r约为0.87–0.98），但在估计细胞比例时可能受到RNA测序 panels和样本数量的影响[34]。这可能解释了为什么我们的数据集中只预测到了CD4+ T细胞、B/浆细胞、粒细胞和NK细胞的存在。这项研究的优点是在 blinded、随机化的临床试验中进行了血液采样[18]。隐蔽的干预分配和随机化确保了系统 bias 的控制，这反映在患者特征（表1）和PCA图中，且PCA图不受任何协变量的影响（支持信息）。我们的发现表明，TKA术后的单次剂量的围手术期地塞米松可能对骨科患者有益，不仅在于减轻疼痛和降低阿片类药物的需求[19]，还在于促进愈合和组织重塑，因为Th2反应已知可以促进这一过程[4]。在癌症手术中，手术本身已知会由于细胞免疫降低而减少术后癌症监测[14]，而Th2反应可能会加剧这一情况[4]。我们的结果引发了这样一个问题：此类患者术后的糖皮质激素是否可能会无意中激活休眠的癌细胞或促进癌症的进展。最近的一项综述未发现围手术期全身性糖皮质激素与全髋关节或膝关节置换术后的高血糖或严重不良事件有显著关联[19]。报告的不良事件包括深静脉血栓形成、伤口愈合延迟、感染等。因此，作者得出结论，严重不良事件可能被低估了[19]。由于我们的发现没有明确表明围手术期糖皮质激素是抑制还是促进细胞免疫，未来在评估围手术期糖皮质激素使用的临床试验中，需要关注癌症复发或发生的数据。
5 结论
我们发现，在TKA手术期间静脉注射24毫克地塞米松会基于ORA诱导与IL6-JAK/STAT3信号通路相关的基因差异表达。这一非显著的结论可能是由于技术因素造成的，因为现有文献并未支持这一结果。基于排名对最显著的DEGs进行解释表明，地塞米松促进了Th2免疫反应，而手术则促进了M2巨噬细胞的反应，这与现有文献一致。估计的细胞比例显示，地塞米松组术后粒细胞比例上升。TKA手术引发的免疫反应导致与促炎和先天免疫反应激活相关的基因差异表达，但对估计的细胞比例没有影响。未来的研究应关注包含更多基因的面板、不同的技术或方法，以减少质量控制过程中的基因排除，从而更好地表征TKA和地塞米松的免疫反应。
作者贡献
K.S.G.、O.M.和D.H.G.构思了生物库的概念。A.K.M.、K.S.G.、O.M.、D.H.G.和I.G.构思并计划了具体研究。B.C.进行了实验室工作。A.K.M.和L.B.进行了统计分析。所有作者都对数据解释和手稿撰写（包括初稿、审稿和最终编辑）做出了贡献。
资金支持
本工作得到了Næstved、Slagelse和Ringsted医院的研究基金（资助编号A572和A825）的支持。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
数据可用性声明
支持本研究发现的数据可根据合理请求从相应作者处获取。
作者贡献：KSG、OM和DHG构思了生物库的概念。AKM、KSG、OM、DHG和IG构思并计划了具体研究。BC进行了实验室工作。AKM和LB进行了统计分析。所有作者都对数据解释和手稿撰写（包括初稿、审稿和最终编辑）做出了贡献。
打赏
