摘要：本研究结合了基于信度的质谱/质谱（MS/MS）代谢组学方法和传统的化学筛选技术，对从龟粪中分离出的Botryotrichum murorum DSM 113281的代谢组进行了分析。代谢组学调查显示了高度的化学多样性；然而，由于产量较低，需要大规模的固态培养来纯化主要成分。通过这种方法，我们发现了tortoisellide A（1），它具有罕见的聚酮γ-内酯骨架，以及14元双大环内酯抗生素grahamimycin A的硫代取代类似物2，同时还发现了已知的倍半萜类化合物eremophilane cryptosphaerolide（3）和isocochliodinol（4）。所有平面结构均通过高分辨率质谱（HR-MS）和核磁共振（NMR）分析得到了阐明。tortoisellide A（1）在其半缩醛碳C–23位置表现出明显的互变异构现象，这体现在大多数NMR信号的重复上。Mosher酯分析支持化合物2的2’S构型，而C–2和C–8位置的构型则根据天然（−）-grahamimycin A1进行了初步推断。通过NMR化学位移和基于J的构型分析（Murata方法），以及计算建模，确定了化合物3的侧链构型为17S, 19S, 21S。这些化合物对哺乳动物细胞系表现出不同程度的细胞毒性，其中isocochliodinol的活性最强，其效力在纳摩尔范围内。Botryotrichum murorum的代谢多样性扩展了嗜粪真菌的化学库，并增加了对Sordariales目次级代谢多样性的认识。
引言：真菌次级代谢产物长期以来一直是新型抗菌分子和治疗剂的重要来源。许多真菌代谢产物激发或促进了商业药物的开发，包括抗生素、抗真菌剂、心血管药物、免疫抑制剂和抗寄生虫药物。尽管市场上没有源自真菌的抗癌药物（与早期关于紫杉醇的说法相反，现在已知紫杉醇仅由植物产生），但半合成illudins目前正在临床试验中用于治疗耐阉割的转移性前列腺癌。嗜粪真菌作为生物活性分子的重要来源已有充分记录。其中一些真菌为了应对环境中的高微生物竞争，进化出了产生次级代谢产物的能力。Sordariales目的真菌普遍存在于这种环境中，许多已被认为是生物活性次级代谢产物的丰富生产者。例如，Chaetomiaceae科的真菌是该目中生物活性代谢产物的最大来源，其中包括已知的chaetoglobosins。这些分子是由杂合聚酮合酶非核糖体肽合酶（PKS-NRPS）产生的，能够阻断真核细胞中的肌动蛋白聚合，这一过程在分子水平上尚未得到充分理解，因此需要全面的构效关系（SAR）研究。针对这一真菌群体的持续研究不断产生有前景的分子，如Amesia hispanica产生的强效抗真菌化合物dactylfungins，Amesia的另一种成员产生的具有C-11a′-S-N交联的不寻常chetracin型epithiodiketopiperazines，以及从土壤真菌Arcopilus navicularis中分离出的Staphylococcus aureus生物膜破坏剂arcopilins。在我们的研究中，选择了嗜粪真菌Botryotrichum murorum，通过基于信度的分子网络方法结合传统化学筛选技术来研究其代谢组。结果分离并阐明了四个不同生物合成类别的次级代谢产物：新的聚酮衍生物内酯tortoisellide A（1）、14元聚酮双大环内酯grahamimycin A的硫代取代衍生物2、倍半萜类化合物eremophilane cryptosphaerolide（3）以及氨基酸衍生物isocochliodinol（4）。
结果与讨论：
**真菌分离与鉴定**
DSM 113281菌株是从龟粪中分离出来的，根据其具有孔口的子囊果和围绕孔口的毛状结构，以及单细胞、椭圆形至梭形的子囊孢子及顶生孢子孔，初步鉴定为Chaetomiaceae科成员。通过对ITS（575 bp）、LSU（541 bp）、rpb2（525 bp）和tub2（772 bp）序列的RAxML分析得到的系统发育树显示（图1），我们的菌株与参考菌株B. murorum CBS 163.52位于一个得到良好支持的支系中（100 bp）。其形态特征和繁殖结构的大小与Wang等人之前描述的该物种特征一致（图2），从而在物种水平上确认了鉴定结果。
**固态培养与基于MS/MS的去重复**
由于仅报道了少数Botryotrichum的代谢产物，我们决定在固态水稻培养基（BRFT）上培养这种嗜粪真菌，使用超高效液相色谱与二极管阵列检测和离子迁移串联质谱（UHPLC-DAD-IM-MS/MS）技术来研究其代谢组。使用MetaboScape软件预处理原始数据后，排除了培养基空白中的特征，剩余的特征通过SpecReBoot21进行去重复和进一步分析。尽管检测到的信号数量众多（MS = 3,374；MS/MS = 3,076），但只有六个特征基于准确质量（质量偏差< 2 mDa）、同位素模式质量（mSigma < 20）和MS/MS光谱匹配（MS/MS得分> 900）被可靠标注（表S1）。其中一个潜在的标注表明BRFT提取物中的主要化合物是cochliodinol，这是Chaetomiaceae科成员广泛产生的化合物，也是Pyrenopolyporus（Hypoxylaceae, Xylariales）培养物中的特征，使其成为家族水平的可靠化学分类标记。另外两个特征被标注为curvicollides A或B，它们具有相同的分子式。然而，在我们的双阈值基于的分子网络（MN）中，这些特征仅作为单个点出现，该网络仅保留满足两个标准的边：平均修饰余弦相似度高于0.7且边支持度高于0.5（图3A）。
**扩展对BRFT培养后B. murorum产生的化学空间的认识**
我们使用SIRIUS软件中的CANOPUS工具预测了这些检测到的MS/MS特征的化学类别，进一步了解了结构多样性。结果显示，BRFT提取物中的主要化合物类别属于氨基酸和肽、萜类和生物碱类，而其他类别如shikimates和phenylpropanoids或碳水化合物在样本中相对较少或未被充分代表。值得注意的是，对于1,325个节点，CANOPUS没有预测出化合物类别，这些节点占MS/MS水平检测到的特征总数的约43%。由于去重复后大部分化学空间仍不明确，我们着手目标分离粗提物中的主要代谢产物。
**主要代谢产物的结构阐明**
从放大培养的B. murorum（在50个烧瓶中）的粗提物中分离出了主要化合物1–4（图4）。化合物1以无色油的形式分离出来；其准分子离子簇在m/z 401.3046 [M + H]+处表明分子式为C26H40O3，具有7个不饱和度。1H和13C NMR光谱中的信号（表1）与这一数字不符，因为至少检测到40个碳信号，表明在NMR时间尺度上存在两种缓慢转化的互变异构体，导致信号重复。最大的化学位移差异出现在C–23位置，因此需要同时阐明这两种异构体的结构。COSY和HMBC NMR数据直接确定了两种互变异构体1a/1b的平面结构（图S1），揭示了一个中心2-羟基-3,5-双酰基-4-甲氧基环烷与两个部分不饱和碳链的连接。随后，基于ROESY相关性确定了C–9/C–10/C–11段的相对立体化学结构，其中H–9和H–11之间的强交叉峰具有诊断性。然而，C–23的构型无法仅通过ROESY数据确定，因此通过HSQC-Hecade NMR实验确定了C,H耦合常数。大多数耦合非常相似，但2JH9a, C23a = −2.5 Hz和2JH9b, C23b = −9.4 Hz是区分1a和1b构型的关键。因此，化合物1被命名为tortoisellide A，以指代其产生菌株所在的动物粪便。这种不规则组装的聚酮与已鉴定的curvicollides和fusaequisin A的骨架相似，这些结构因其内酯环中的非醛立体三角结构而引人注目。前者来自菌核定殖真菌Pseudoechria curvicolla（同义词Podospora curvicolla），后者来自Fusarium equiseti。这些代谢物的复杂性和独特的化学性质表明它们可能由两种不同的聚酮亚单位缩合而成，这激发了多种全合成研究以明确其完整结构。值得注意的是，化合物1与这些分子具有相同的C26骨架，但较少的氧化修饰表明tortoisellide A可能是更复杂的curvicollides生物合成过程中的早期产物。这一假设与我们的去重复结果一致，因为在我们的MN中，两个分子式为C26H40O5的特征被标注为curvicollide A/B，表明它们具有共同的生物合成起源。尽管这些curvicollide相关特征在双阈值基于的MN中仅作为单个点出现，但通过进一步恢复具有低光谱相似度但支持值超过0.5的边，SpecReBoot恢复了它们与化合物1之间的联系（图3C）。此外，1作为不可分离的异构体混合物的分离表明观察到的互变异构可能反映了后期自发的半缩醛形成，这意味着只有一个构象可能对应于真正的天然产物。未来的专门研究将有助于澄清这一点，并揭示这些γ-内酯代谢物的独特聚酮化学性质。
**表1**：1的NMR数据（700 MHz，DMSO-d6）。
**化合物2**：基于HR-ESI-MS数据确定其分子式为C17H24O9S，具有6个不饱和度。钠加合物离子峰m/z 517.2237 [M + Na]+中的同位素模式以及CH2−1’的磺化亚甲基（δC 35.5, δH 2.93和2.77）和甲基CH-9（δC 36.4, δH 2.87）的特征NMR位移值支持了硫原子的存在。此外，1H和HSQC（表2）光谱显示了两个烯烃亚甲基、四个氧亚甲基和一个硫亚甲基以及四个亚甲基的信号。HMBC数据揭示了一个酮和一个三个羧基的存在。COSY相关性表明CH–4/CH2–5/CH–6/CH3–16、CH–9/CH2–10、CH–12/CH2–13/CH–14/CH3–15和CH2–1’/CH–2’部分通过COSY相关性连接。HMBC相关性还确认化合物2含有一个grahamimycin A骨架，连接着一个（2-羟基-3-羧基丙基）硫代取代基，尽管后者在B. murorum的化学空间中未被检测到。然而，HMBC数据本身无法明确侧链连接在C–12还是C–13。这种歧义通过ROESY数据得到了解决，数据显示H–10与C–12处的两个亚甲基质子之间存在明显的相关性，表明它们在空间上非常接近。这些相关性与侧链连接在C–13的位置一致，而如果侧链连接在C–12，则无法解释观察到的ROESY交叉峰。表2显示了2的NMR数据（700 MHz，DMSO-d6）。图4的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图片。图4中的化学结构来自Botryotrichum murorum DSM 113281的BRFT培养物中的分离代谢物。天然（−）-grahamimycin A1的绝对构型之前已经通过全合成方法确定。化合物2显示出负的光学旋转（[α]20D −43，MeOH），这与天然（−）-grahamimycin系列一致，与报道的合成（+）-对映体相反。因此，C–2和C–8的构型是根据类比暂时指定的。这一指定进一步得到了支持，因为这类大环内酯类化合物中含甲基中心的立体化学在链组装过程中就已经确定，并且每当PKS处理相同的底物时应该保持不变，而PKS后的羟基化反应的立体化学可能会发生变化。与此一致的是，来自Diplogelasinospora grovesii（Diplogelasinosporaceae，Sordariales）的colletodiol在相应的C–2和C–8也显示出相同的构型，这些是生物合成中保守的含甲基中心。C–2’的构型通过Mosher酯分析进行了研究。尽管光谱质量较差，只能进行部分指定（见图5，表S2），但从HSQC和COSY光谱数据中可以得出H3–15、H–14、H–12a和H–12b的ΔδSR值为正，从而确认了10R的绝对构型。此外，H–1’a和H–1’b的ΔδSR值为负，表明其构型为2’S。因此，C–2’的构型可以指定为2’S，而C–2和C–8的构型仍然基于生物合成类比和光学旋转数据暂时指定。2-羟基-3-巯基丙酸基团的引入与多种天然产物中的自我解毒机制有关，例如硫酸化的pleurotin衍生物。然而，在berkeleylactones中，这一结构基团的存在对于观察到的生物活性是必需的。在Sordariales中，这类代谢物较为罕见，迄今为止只在Diplogelasinospora grovesii中报道了colletodiol及其异构体，而它们缺乏2-羟基-3-巯基丙酸的硫代取代。这种大环内酯骨架上的硫代修饰是来自酶促修饰步骤还是自发反应尚不清楚，这需要进一步探索Sordariales中大环内酯多酮类的生物合成多样性。图5的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图片。MPTA酯的ΔδSR值对于诊断12R,2’S构型的thio-grahamimycin 2具有诊断意义。同样，cryptosphaerolide（3）是通过将其HR-ESI-MS和NMR数据与文献值进行比较而鉴定的。特别是，在氯仿-d中测量的1H、13C、COSY、ROESY、HSQC和HMBC NMR数据几乎完全相同（见表S3，图S21–S25）。3的结构，包括倍半萜核心的绝对构型，之前已经阐明。然而，侧链的立体化学尚未确定。为了解决这个问题，我们采用基于NMR的方法进行了立体化学指定。根据Breit的规则，起始质子H–20a（δH 1.15 ppm）和H–20b（δH 0.95 ppm）之间的较大化学位移差ΔδH = 0.20 ppm表明CH3–25和CH3–26基团处于顺式构型。为了指定氧亚甲基CH2–24和甲基CH3–25之间的相对构型，进行了基于J的构象分析。相关的耦合常数分别从H,H耦合常数的H和J分辨NMR实验以及H,C耦合常数的HSQC–Hecade和J-HMBC光谱中获得。C–17/C–18键的数据解释清楚地表明甲基基团CH3–25和CH3–26处于顺式构型。耦合常数排除了D-F中描绘的所有相对构型，以及左侧的两种可能构型（B和C）。不幸的是，C–18/C–19键的数据解释较为困难，因为一些诊断耦合常数值不显著。然而，仅通过解释显著的耦合常数值3JH18aH19 = 4.8 Hz、3JC20H18b = 2.9 Hz和3JC25H18b = 5.6 Hz，就可以生成图S3–S6中描绘的结构提案。由于这些显著的耦合常数，其他潜在的旋转异构体不太可能是实际构型。这一指定进一步得到了甲基基团CH3–25与氧亚甲基CH2–24之间的ROESY相关性的支持，这是顺式链的特征。综合来看，J分辨分析表明侧链的构型为2R,4R,6R或2S,4S,6S。观察到CH2–24和CH3–14之间的较强ROESY相关性，这有助于将Eremophilane中心基团的绝对构型（通过Mosher方法确定）转移到2-羟基-2-(羟甲基)-4,6-二甲基辛酸侧链上。因此，2R,4R,6R和2S,4S,6S两种可能性都使用ORCA 6.0.0程序进行了计算。2R,4R,6R和2S,4S,6S构型的C–14/C–24距离分别为4.800 Å和4.137 Å。由于观察到的ROESY交叉峰仅与大约4 Å的距离相符，因此绝对构型被指定为2S,4S,6S。最初，BRFT提取物中的主要代谢物的分子式被确定为C32H32N2O4，基于其作为cochliodinol的假定注释。然而，与从相关Chaetomiaceous真菌中分离出的真实标准品进行直接比较后，发现保留时间和UV/Vis光谱存在差异，表明它是一个不同的异构体（见图S7）。经过纯化后，详细的NMR分析以及与文献的比较，揭示了其身份为isocochliodinol（4）。由B. murorum产生的代谢物的生物特性所有分离的代谢物都对其抗菌和细胞毒性进行了评估（见表3和S6）。遗憾的是，化合物1的量不足以进行生物测试。相关分子如curvicollides和fusaequisin A表现出多种活性，包括抗真菌作用（curvicollides）、抗菌特性（fusaequisin A）以及通过DNA结合和转录阻断抑制非洲锥虫病病原体Trypanosoma brucei（curvicollide D）。值得注意的是，这种从Amesia属Chaetomiaceous真菌中分离出的分子，尽管名称相同，但其碳骨架和氧化模式与“原始”curvicollides不同，这表明Chaetomiaceae和其他Sordariales科内的生物合成途径存在多样性。未来对Botryotrichum和Amesia或甚至相关分类单元中这些代谢物的多样性进行研究将阐明它们的生物特性，包括1的生物特性，并确定它们是否在其他家族成员中也是保守的。另一方面，thio-衍生物grahamimycin A（2）在最高测试浓度下也没有显示出抗菌活性，并且只有有限的细胞毒性，IC50值分别为56.9 µM和47.0 µM，针对A549和KB 3.1细胞系。2缺乏抗菌特性证实了2-羟基-3-巯基丙酸基团的引入起到了解毒作用，因为已知的grahamimycin A已被证明对多种微生物有效。相比之下，cryptosphaerolide（3）显示出选择性的抗菌效果，包括对Bacillus subtilis和Staphylococcus aureus的强活性，对Mycolicibacterium smegmatis的中等抑制作用，以及对Mucor hiemalis和Rhodotorula glutinis的弱抗真菌活性（见表S6）。化合物3还表现出显著的细胞毒性，IC50值分别为2.5 µM和2.8 µM，针对KB 3.1和L929细胞系。值得注意的是，cryptosphaerolide已被报道为抗凋亡蛋白Mcl-1的抑制剂，这是一种临床相关的癌症药物靶点。然而，正如本研究中所发现的，其低产量可能阻碍了对其治疗潜力的进一步药理学和机制研究。此外，为了比较两种cochliodinol异构体，本研究中的isocochliodinol（4）与之前从Amesia hispanica中分离出的cochliodol（见表S6）进行了测试。Isocochliodol显示出对B. subtilis的中等抑制作用和对M. hiemalis的弱活性，但对其他测试菌株无活性。相比之下，cochliodol对B. subtilis和R. glutinis显示出弱活性，但对M. hiemalis无活性。这两种化合物都表现出细胞毒性，尽管4的效力显著更强，范围从0.058到1.8 µM，涵盖了所有测试的细胞系，包括A431、A549和A431细胞。上述结果表明，位置异构性显著影响这种化合物骨架的抗菌和细胞毒性，为它们的生物特性提供了新的见解。表3显示了分离代谢物对哺乳动物细胞系的细胞毒性[半最大抑制浓度（IC50）：µM]。全尺寸表格。结论受到Chaetomiaceae最近分类修订及其属迄今未被充分探索的系统发育多样性的启发，我们探索了从龟粪中分离出的嗜粪真菌Botryotrichum murorum的次级代谢组。基于置信度的分子网络和CANOPUS引导的注释揭示了高度新颖的化学结构或未注释的特征，这使我们能够分离并表征BRFT固体培养物中产生的主要代谢物，并调和了这种嗜粪真菌的化学多样性。所得到的次级代谢物可以归类为不同的生物合成类别，突显了B. murorum的化学创造力，并揭示了以前在Chaetomiaceae中未描述过的或Sordariales中罕见的化学骨架。在这些代谢物中，我们表征了一对γ-内酯类异构体，它们类似于curvicollides/fusaequisin A家族，都具有独特的碳骨架和氧化模式。虽然curvicollides已在远缘的Sordariales分类单元中报道，但这些骨架的生物合成机制是否在Sordariales内的不同家族中广泛分布，或者反映了更有限的遗传模式（如潜在的水平基因转移事件），仍然是一个未解之谜。尽管1在化学上具有新颖性，但其生物特性对我们来说仍然不清楚，这需要通过未来的实验努力以及基因组挖掘和定向生物合成实验来阐明，以了解这些分子的独特多酮化学，并最终将其与它们的生物学作用联系起来。同样，计划在Chaetomiaceae和其他Sordariales类群中进行更全面的调查，以评估这些分子的结构和生物多样性。方法真菌分离和鉴定菌株DSM 113281是从德国下萨克森州Essehof动物园收集的龟粪中分离出来的，采用湿润室方法并在室温下培养样品。真菌菌落使用Zeiss Stemi 508立体显微镜（德国耶拿）检查了长达2个月，然后使用无菌针头将真菌的繁殖结构转移到含有酵母麦芽琼脂（YM琼脂；麦芽提取物10 g/L，酵母提取物4 g/L，D-葡萄糖4 g/L，琼脂20 g/L，pH 6.3）的Petri培养皿中，并在高压灭菌前加入250 mg/L青霉素和250 mg/L链霉素以防止细菌，以及50 mg/L伊维菌素以防止螨虫或线虫。在YM中生长的可育真菌结构被安装在乳酸中测量。这些结构的光显微照片使用Keyence（德国Neu-Isenburg）VHX-970 F显微镜和Nikon eclipse Ni复合显微镜拍摄，使用DS-Fi3数字相机（日本东京）和NIS-Elements成像软件v. 5.20。DNA提取和PCR扩增按照Charria-Girón等人的方法进行。PCR产物在Microsynth Seqlab GmbH（德国哥廷根）使用Sanger Cycle Sequencing方法进行测序，共识序列使用Geneious® 7.1.9（http://www.geneious.com）获得。为了多相鉴定真菌，基于我们的分离株和属于Botryotrichum属的类型和参考菌株的四个位点进行了系统发育分析（见表4）。每个位点分别使用MAFFT v. 7（Katoh等）对齐，然后使用MEGA v. 10.2.4（Kumar等）手动优化。然后使用SequenceMatrix（Vaidya等）将四个位点连接起来，检查没有冲突。最大似然（ML）分析在CIPRES门户（www.phylo.org）上使用RAxML-HPC BlackBox v8.2.12和默认参数进行，bootstrap支持（bs）≥70%被视为显著。本研究中生成的序列已存入GenBank（见表4），最终对齐结果可在补充材料中找到。表4中列出了我们的分离株以及用于系统发育研究的Botryotrichum属的类型和参考菌株。本研究中研究的菌株和生成的序列用粗体表示。ABRIICC：伊朗农业生物技术研究所，伊朗卡拉吉；CBS：Westerdijk真菌生物多样性研究所，荷兰乌得勒支；CCF：查尔斯大学理学院植物学系真菌培养物收藏，捷克共和国布拉格；DSM：德国微生物和细胞培养物收藏，德国不伦瑞克；NIBR：韩国仁川国家生物资源研究所培养中心；UAMH：多伦多大学全球微真菌生物多样性中心，加拿大多伦多。T表示模式材料。
**通用实验程序**
分离出的化合物的一维（1D）和二维（2D）核磁共振（NMR）光谱分别使用Bruker公司的Avance III 700光谱仪（5 mm TXI冷冻探头）（1H NMR：700 MHz，13C：175 MHz，美国马萨诸塞州比勒里卡）和Avance III 500光谱仪（1H NMR：500 MHz，13C：125 MHz，美国马萨诸塞州比勒里卡）记录。化学位移δ以溶剂DMSO-d6为参考（1H，δ = 2.50；13C，δ = 39.51）。光学旋转在20°C下使用Anton Paar公司的MCP 150圆偏振仪测量，UV/Vis光谱使用Shimadzu公司的UV-2450分光光度计测量。光学旋转在MeOH中测定，UV/Vis光谱在ACN中测量。
**非靶向代谢组学分析**
每个样品以450 µg/mL的浓度在Thermo Scientific公司的Dionex Ultimate 3000RS上进行分析，使用Kinetex C18柱（1.7 μm，21 × 150 mm，100 Å），样品注入量为2 µL。流动相由A（H2O + 0.1%甲酸）和B（ACN + 0.1%甲酸）组成，流速恒定为0.3 mL/min。梯度从1% B开始，持续0.5分钟，然后在1分钟内增加到5% B，接着在19分钟内增加到100% B，并在100% B下保持5分钟。DAD-UV数据在190–600 nm范围内记录，柱温设定为40°C。质谱（MS）数据使用Bruker Daltonics公司的timsTOF Pro质谱仪收集，参数如下：tims斜坡时间100 ms，光谱速率9.52 Hz，PASEF开启，循环时间320 ms，MS/MS扫描2次，扫描范围（m/z，100–1800 Da；1/k0，0.55–2.0 V.s/cm²）。非靶向分析数据和标准品的测量分别在ESI正离子和负离子模式下进行。
数据首先使用MetaboScape®2022软件（Bruker Daltonics，德国不伦瑞克）在0.5至25分钟范围内进行预处理。首先，排除三个生物重复样本之间方差系数大于80%的质谱特征，以及存在于空白介质中的特征。然后使用SpecReBoot软件根据我们内部的特征性真菌代谢物标准品光谱数据库对特征进行去重复处理。基于特征的分子网络构建方法如下：首先，使用DEFAULT_FILTERS和CLEAN_PEAKS对导出的MGF文件进行一般光谱清洗。清洗后的MGF文件作为输入用于SpecReBoot自举工作流程。光谱相似性使用FlashSimilarity软件中的修改后的余弦得分计算，片段质量容忍度为0.02 Da，100次自助复制，k = 10，光谱相似性阈值为0.7，边缘支持阈值为0.5，最小光谱相似性阈值为0.1，以恢复连接的恢复。CANOPUS预测的进一步整合遵循Valencia-Revelo等人的方法。
**发酵、提取和分离**
培养和提取过程如先前报道16,20,43所述。扩大规模培养在30个500 mL的烧瓶中进行，使用固体水稻BRFT培养基，提取后获得2.9克粗提物。甲醇提取物使用闪蒸色谱法（Grace Reveleris®，美国哥伦比亚）进行预分离（硅胶柱80 g，溶剂A：DCM，溶剂B：丙酮，溶剂C：[DCM/丙酮 8:2]：MeOH），梯度：100% A持续5分钟，然后增加到100% B持续20分钟，接着增加到100% C溶剂混合物持续5分钟。收集了十个组分（F1–F10），尽管发现F1组分几乎只含有脂肪酸，因此被舍弃。
F2组分（383 × 2 mg）通过制备反相（RP）-HPLC进一步纯化（VP Nucleodur 100–10 C18 ec柱（250 × 40 mm；Macherey-Nagel，德国杜伦），溶剂A：H2O + 0.1%甲酸，溶剂B：ACN + 0.1%甲酸，流速45 mL/min，紫外检测波长210、240和300 nm，梯度：从50% B增加到75% B持续10分钟，从75% B增加到86%持续30分钟，从86% B增加到100% B持续5分钟），得到tortoisellide A（1）（1.5 mg，tR = 25–28 min）和isocochliodinol（4）（376 mg，tR = 19–21 min）。F3和F4组分（301 mg）合并后，通过Sephadex®LH 20材料（Pharmacia Fine Chemicals，美国纽约）进行尺寸排阻色谱分离（溶剂：MeOH；流速3.4 mL/min），收集六个组分（F11-F16），其中F11组分（43 mg）使用RP-HPLC进一步纯化（Gemini柱，10 μm，Phenomenex，美国托伦斯），溶剂A：H2O + 0.1%甲酸，溶剂B：ACN + 0.1%甲酸，流速45 mL/min，紫外检测波长210、240和300 nm，梯度：从5% B增加到65% B持续15分钟，从65% B增加到100% B持续35分钟，然后100% B等渗持续10分钟），得到cryptosphaerolide（3）（7.3 mg，tR = 42–44 min）。F6和F7组分也合并后使用RP-HPLC纯化（XBridge® Prep C18柱，5 μm OBDTM，Waters，美国米尔福德），溶剂A：H2O + 0.1%甲酸，溶剂B：ACN + 0.1%甲酸，流速45 mL/min，紫外检测波长210、240和300 nm，梯度：从5% B增加到65% B持续15分钟，从65% B增加到100% B持续35分钟，然后100% B等渗持续10分钟），得到thio-grahamimycin A（2）（3.4 mg，tR = 30–33 min）。
**光谱数据**
**tortoisellide A（1）**：蓝色至绿色油状物；UV：232, 322 nm；1H NMR（700 MHz）和13C NMR（175 MHz）数据在DMSO-d6中见表1；ESI-MS：m/z 399.18 [M – H]− 和 401.30 [M + H]+；HR-ESI-MS：m/z 383.2941 [M – H2O + H]+, 401.3046 [M + H]+ 和 423.2867 [M + Na]+（计算分子量C26H40O3，400.2977）。SMILES：CC(=O)/C(C) = C/C = C/C = C/C(C) = C/[C@H]1C(O)O[C@H]([C@@H]1C)/C(C) = C/C = C/C(C)CCCC。
**thio-grahamimycin（2）**：棕色油状物；[α]20D −43°（c 0.001，MeOH）；UV（MeOH）λmax (log ε) 218 (2.2)；1H-NMR和13C-NMR见表2；ESI-MS：m/z 402.95 [M – H]− 和 405.10 [M + H]+；HR-ESI-MS：m/z 387.1108 [M – H2O + H]+, 405.1215 [M + H]+ 和 427.1034 [M + Na]+（计算分子量C17H24O9S，404.1141）。SMILES：O=C1O[C@H](C)C/C = C/C = O[C@H](C)C[C@@H](O)C(C=O)CC1SC[C@H](O)C(O) = O。
**cryptosphaerolide（3）**：棕色至黄色油状物；1H-NMR和13C-NMR见表S3；ESI-MS：m/z 465.36 [M – H]− 和 467.34 [M + H]+；HR-ESI-MS：m/z 467.3000 [M + H]+（计算分子量C26H42O7，466.2931）。SMILES：C[C@@]12C[C@H]3C(=C)CO[C@@]3(O)[C@H]3O[C@]32[C@@H](CC[C@@H]1C)OC(=O)[C@@](O)(CO)C[C@@H](C)C[C@@H](C)。
**isocochliodinol（4）**：深紫色粉末；1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δH 11.22 (br s, NH–1’, NH–1’’), 10.65 (br s, 2–OH, 5–OH), 7.44 (d, J = 2.6 Hz, H–2’, H–2’’), 7.32 (d, J = 8.2 Hz, H–4’, H–4’’), 7.17 (br s, H–7’, H–7’’), 6.82 (dd, J = 8.2, 1.5 Hz, H–5’, H–5’’), 5.36 (m, H–11’, H–11’’), 3.39 (dd, J = 7.3, Hz, H–10’, H–10’’), 1.73 (m, H3–14’, H3–14’’), 1.72 (m, H3–13’, H3–13’’) ppm；13C-NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δC 136.1 (C, C–8’, C–8’’), 134.1 (C, C–6’, C–6’’), 131.0 (C, C–12’, C–12’’), 126.9 (CH, C–2’, C–2’’), 124.6 (CH, C–9’, C–9’’), 124.3 (CH, C–11’, C–11’’), 121.5 (CH, C–4’, C–4’’), 119.7 (CH, C–5’, C–5’’), 111.0 (CH, C–3, C–6), 110.3 (CH, C–7’, C–7’’), 104.4 (CH, C–3’, C–3’’), 33.9 (CH2, C–10’, C–10’’), 25.6 (CH3, C–13’, C–13’’), 17.7 (CH3, C–14’, C–14’’); ESI-MS：m/z 505.14 [M – H]− 和 507.32 [M + H]+；HR-ESI-MS：m/z 507.2438 [M + H]+（计算分子量C32H30N2O4，506.2362）。
**生物测定**
每种化合物的抗菌活性通过测定其对五种真菌（即Candida albicans、Mucor hiemalis、Rhodotorula glutinis、Schizosaccharomyces pombe和Wickerhamomyces anomalus）以及不同革兰氏阳性（Bacillus subtilis、Mycolicibacterium smegmatis和Staphylococcus aureus）和革兰氏阴性（Acinetobacter baumannii、Chromobacterium violaceum、Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa）细菌的最小抑制浓度（MIC）来评估，使用nystatin作为所有测试真菌的阳性对照，使用氧四环素作为所有细菌的阳性对照（除了A. baumannii、Mycolicibacterium smegmatis和Ps. aeruginosa，分别使用ciprobay、kanamycin和gentamycin）。所有化合物对来自DSMZ（德国不伦瑞克微生物和细胞培养物收藏）的七种哺乳动物细胞系（即人类宫颈腺癌KB 3.1（ACC 158）、乳腺癌MCF-7（ACC 317）、肺癌A549（ACC 107）、卵巢癌SK-OV-3（ACC HTB 77）、前列腺癌PC-3（ACC 465）、鳞状细胞癌A431（ACC 91）和小鼠成纤维细胞L929（ACC 2）的细胞毒性通过MTT方法测定，使用epothilone B作为阳性对照。这两种生物测定均按照先前描述的协议进行16。
