摘要：微藻因其能够产生高质量生物质而日益被视为应对气候变化和人口增长相关挑战的可持续资源，这些生物质可用于饲料、食品和化妆品领域。然而，基于微藻的产业扩张仍受到有害生物污染物（HBCs）的限制，这些污染物会迅速降低生产力，通常表现为培养物外观的可见变化（例如细胞聚集和变色），最终可能导致培养物崩溃和重大经济损失。在本研究中，通过高通量扩增子测序18S rDNA基因，确定Paraphysomonas sp.（金藻门）是大规模生产设施中Tisochrysis lutea培养物崩溃的最可能原因。为了在扩大生产规模的过程中早期检测这种有害生物污染物，开发并优化了一对针对18S rDNA基因的特异性引物，能够检测到低至0.1%相对丰度的Paraphysomonas sp.。该污染物首次在扩大生产规模的最后阶段，在管状光生物反应器中被发现。为了进一步了解这种污染物的影响并支持缓解策略，对其摄食行为进行了研究。实验室规模的缓解试验表明，使用1 mg L⁻¹浓度的二氧化锗（GeO2）处理可以有效延缓污染物的繁殖并防止培养物崩溃，同时不会对T. lutea的生长产生不利影响。这些发现强调了将分子监测与有针对性的缓解策略相结合的价值，以改善工业微藻生产系统中有害生物污染物的早期检测和管理。
引言：过去二十年里，过度捕捞、耕地减少以及缺乏可持续产品是气候变化和人口增长的后果。为应对这些挑战，需要新的解决方案来生产食品、饲料、营养保健品和化妆品（Torres-Tiji等人，2020年）。微藻作为一种有前景的可持续产品开发选择，因为它们可以循环利用大气中的碳，并能在非耕地或废水中生长（Levasseur等人，2020年）。作为光合生物，它们利用光、水和营养物质来生产高价值化合物。然而，在大规模生产系统中存在有害生物污染物（HBCs）仍然是一个严重但常被忽视的问题。这些污染物会降低产量、降低产品质量，甚至导致培养物完全崩溃，从而造成重大经济损失（Lam等人，2018年）。HBCs通常分为三类：竞争者（例如其他光合微生物）、寄生虫（例如真菌、病毒）和摄食者（例如变形虫和/或鞭毛微生物）（Lam等人，2018年）。摄食者被认为是最具破坏性的，因为它们会主动摄食微藻，并且常常会产生囊肿，在条件适宜时才会重新活跃（Day，2013年）。最近，已经开发了多种HBC检测方法，包括光学或电子显微镜、流式细胞术、高通量扩增子测序和其他分子方法（Di Caprio，2020年）。已经提出并应用了几种物理（例如过滤、改变非生物因素）和化学（例如生长抑制剂）策略来进行控制（Molina等人，2019年）。然而，这些缓解策略的有效性受到微藻和污染物种类以及所用培养方法的强烈影响。因此，早期识别HBCs对于理解和预测它们对微藻培养的影响至关重要。本研究聚焦于海水甲藻Tisochrysis lutea，这种微藻具有光合和混合营养生长能力。其生物质含有多种潜在的高价值生物化合物，如多不饱和脂肪酸（PUFAs）和岩藻黄质，使其成为水产饲料和化妆品配方中非常受欢迎的原料（Mayer等人，2021年）。本研究旨在使用高通量技术识别导致T. lutea培养物崩溃的HBCs，包括针对18S核糖体DNA（rDNA）基因高度可变区V9的扩增子测序，因为大多数影响这种甲藻的摄食者和寄生虫都是真核生物。此外，为了便于早期检测和控制，设计了特定的引物对，并通过显微镜分析研究了HBCs的摄食行为，以支持有效缓解策略的开发。
材料与方法：
HBCs的分子鉴定：
为了建立生物污染物筛查的基线，进行了两种采样程序（图1）。第一种程序包括四个不同的样本：一个作为阴性对照的接种样本（无真核生物污染）、一个来自前一年的样本用于与当前采样进行比较，以及两个含有高浓度HBCs的T. lutea培养物的反应器样本（图1A；表1）。这组样本被选用于扩增子测序，以确定工业规模下存在的生物污染物的分类多样性。它们代表了在操作中的光生物反应器中发生的独立污染事件，作为案例研究观察而不是对照实验，并用于设计HBC早期检测的引物。第二种采样程序涉及跟踪培养物，以确定生物污染物首次出现的位置（图1D）。在T. lutea扩大生产过程的每个步骤（从5 L到27 m³）之前，收集了培养物和生长基质的样本。为了重复实验，在2021年的8月（培养物1）和9月（培养物2）监测了两次扩大生产。
图1：用于T. lutea培养物中生物污染物采样、分子鉴定和缓解策略评估的实验设计示意图
表1：选定的18S rDNA扩增子测序（V9区域）样本
每个样本被收集到50 mL的Falcon管中（图1A和D），以5,752 × g离心5分钟，然后丢弃上清液。所得生物质在-20°C下储存，之后使用PowerSoil Pro DNA Kit（QIAGEN，德国）进行DNA提取，稍作修改。简要来说，在第一步中，将Solution CD1直接加入收集的生物质中并涡旋以重新悬浮细胞；然后将悬浮液转移到PowerBead Pro管中。此外，在第16步中加入50 µL的Solution CD6；离心后，重复此步骤以获得最终体积100 µL。所有离心步骤都以最大速度（20,000 × g）进行。使用0.8%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop分光光度计（Thermo Scientific）评估DNA的质量和数量。
扩增子测序和分类鉴定：
从第一种采样程序中选出的四个样本被送往MR DNA（Shallowater，TX，美国）进行100—bp扩增子测序，以检测所有存在的真核生物（图1B），使用文献中先前描述的通用引物euk1391F（5′-GTA CAC ACC GCC CGT C-3′）和EukBr（5′-TGA TCC TTC TGC AGG TTC ACC TAC-3′）（Zahedi等人，2019年）。这些引物针对18S rDNA基因的V9高度可变区域，测序在Illumina MiSeq平台上进行。
所得序列被聚类为零半径操作分类单元（zOTUs），代表独特的微生物群体。每个zOTU使用BLASTn（Altschul等人，1990年）与NCBI数据库中的序列进行比较。通过使用引物18SUnivFor和18SUnivRev（Pereira等人，2011年）对18S V1–V5高度可变区域进行测序，进一步确认分类鉴定。使用MUSCLE（v3.5）（Edgar，2004年）通过phylogeny.fr平台（Dereeper等人，2008年）进行多序列比对。使用PhyML（v3.0）（Guindon等人，2005年）实现的最大似然系统发育推断，自动选择了最佳拟合进化模型（GTR + Γ；形状参数=0.540）。使用非参数SH-like近似似然比测试（aLRT）评估分支支持。使用FigTree（v1.4.3）可视化系统发育树。通过将假定的污染物与已发表的参考显微照片进行比较来进行形态学确认（Scoble和Cavalier-Smith，2014年）。
引物设计、PCR优化和测序：
在识别出导致崩溃的摄食者Paraphysomonas sp.后，本研究内部设计了针对18S rDNA基因的特异性引物对Paraphysomonas_1376F（5’- TTA GAG GGA CTT TCG GTG ACT-3’）和Paraphysomonas_1549R（5’- TCT ATC CCT AAC ACG ATA CAC A-3’）。这些引物在四种市售微藻培养物（Tetraselmis chui、Chlorella vulgaris、T. lutea和Phaeodactylum tricornutum）以及第一次采样程序中的三个受污染的T. lutea培养物上进行了测试（表1），在标准PCR条件下进行。优化的PCR条件包括初始变性步骤在94°C下进行5分钟，随后是35个循环的94°C变性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸1分钟，最后在72°C下延伸10分钟。根据制造商的说明使用GoTaq G2 Flexi DNA聚合酶（Promega，美国）。简要来说，准备了一个20 µL的反应混合物，包含1 × Colorless GoTaq Flexi缓冲液、2.5 mM MgCl₂、0.2 mM dNTPs、每种引物0.2 µM、1 U的GoTaq G2和1 µL的DNA模板（0.5–2 ng µL−1）。
PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳并在GelRed（Biotium，CA，美国）染色下进行可视化。使用来自污染最严重和最轻微样本的DNA系列稀释液评估引物敏感性，范围为0.1–77%的相对读数丰度。通过Sanger测序单个PCR产物的样本验证引物特异性（Applied Biosystems 3130XL DNA测序仪，Life Technologies，美国）。最后，使用设计的引物对来确定污染物首次出现的扩大生产步骤（图1C和D）。
培养条件和实验设计：
在采样过程中，受污染的T. lutea培养物在100 mL Erlenmeyer烧瓶中维持，在连续光照（PPFD = 38 µmol photons m−2 s−1）下，以140 rpm的速度搅拌，平均温度为30 ± 5°C。每7天，将HBC感染的培养物（约5 × 105细胞/mL）以1:50的比例稀释到新鲜的T. lutea培养基（约5 × 106细胞/mL）中。新鲜的微藻培养物在富含Nutribloom®（Phytobloom，Necton S.A., 葡萄牙）的无菌海水中生长。培养物在1 L玻璃反应器中维持，在连续光照（PPFD = 140 µmol photons m−2 s−1）下，以0.2 µm过滤器过滤的空气以0.4 L min−1的速度连续通气和24小时的光周期。
为了更好地了解导致T. lutea崩溃的HBC的摄食行为，使用Zeiss Axioscope 5 Z2显微镜以400倍放大倍数和ZEN Blue软件（v3.3）每天获取显微照片。使用Hitachi UH5300分光光度计通过光密度（OD₇₅₀）监测微藻生长，并在用Lugol溶液（1%）固定后使用Neubauer血细胞计数器确定细胞浓度（CC）。OD₇₅₀值与CC相关联，以监测整个实验过程中的生物量生长（图1E）。此外，通过分光光度法测量培养基中的硝酸盐浓度，以评估微藻细胞的生理状况并区分营养限制和摄食者引起的下降。样品在2000×g的离心力下离心10分钟，通过计算220纳米处的吸光度差值减去275纳米处吸光度的两倍来确定硝酸盐浓度，使用的是硝酸钠校准曲线（Armstrong 1963）。在初步实验中，对感染了HBC的实验室规模T. lutea培养物测试了各种环境和化学缓解策略（图1F）。环境处理包括增加盐度，而化学处理包括二氧化锗（GeO2）、磷酸二钾（K2HPO4）、十二烷基硫酸钠（SDS）和过氧化氢（H2O2），这些处理是根据先前的研究以特定浓度应用的（表2）。所有处理都在上述条件下进行了三次重复实验，持续6天。通过显微镜观察和OD750测量来监测微藻和HBC的生长情况。未受污染的T. lutea培养物作为阴性对照，而感染HBC的培养物作为阳性对照。在验证实验中，最有效的处理方法（1 mg L−1的GeO2）在相同的实验条件下进一步评估了14天的效果，以验证其缓解潜力。通过显微镜、细胞计数（CC）和硝酸盐浓度来监测微藻和HBC的生长情况，使用的是上述相同的对照处理方法。
统计分析使用Xlstat Premium（v2022.5.1.1386）进行。处理之间的差异通过单因素方差分析（ANOVA）进行评估，随后进行Tukey多重比较测试（α=0.05）。图表使用GraphPad Prism（v8.0.2）生成。
**HBC的鉴定**
对18S rDNA基因的V9区域进行测序后，共得到224个zOTU。第一次采样程序的样品受到严重污染，与T. lutea培养物崩溃相关的生物污染物相对丰度很高。虽然低丰度的分类单元可能具有负面的生物学效应，但本分析重点关注了主导的zOTU，以确定大规模培养物崩溃的最可能主要原因（表S1，补充材料）。使用严格的BLASTn标准（E值<1×10–50，身份>95%），对112个zOTU进行了分类，揭示了十个潜在的HBC群体（图1）。这些包括变形虫门（真变形虫）、硅藻门（硅藻）、细菌门、鞭毛虫门（微鞭毛虫和变形虫状原生生物）、纤毛虫门（纤毛虫）、蜕皮动物门（无脊椎动物）、眼虫门（如眼虫）、金藻门（“金色”微鞭毛虫）、真菌门和蛋白石虫门（非光合丝状菌）（Keeling和Burki 2019）。工业监测提供的显微镜观察结果与测序揭示的分类组成一致。所有样品中都检测到了细菌序列，其中接种物中的丰度最低（约2700个读数），而在PBRs中的丰度显著更高（20,000–30,000个读数）（图2A）。真核污染物在接种物中不存在，但在PBR样品中以高丰度检测到（2,966至11,572个读数），相对于目标微藻而言。样品2（来自前一年）主要由眼虫门（zOTU28—50%）主导，而样品3和4分别主要由金藻门（zOTU4—77%）和纤毛虫门（zOTU9—88%）主导（图2）（表S1，补充材料）。这三个分类单元被选为进一步的系统发育分析对象。
**系统发育分析和与已发表序列的比较**
系统发育分析和与已发表序列的比较显示，生物污染物zOTU28、zOTU4和zOTU9分别属于双鞭毛虫科（Diplonemidae）、副噬菌体属（Paraphysomonas）和优氏噬菌体属（Euplotes）（图S1、S2和S3，补充材料）。然而，T. lutea培养物崩溃的最可能候选者是金藻（zOTU4）。对18S V1-V5区域的扩增和测序确认了这种HBC与Paraphysomonas longispina（JQ967305）和Paraphysomonas aff. longispina（Z28335）的密切关系，它们共享一个分支支持值为0.88的节点（图3）。
**Paraphysomonas sp.的分子检测**
在扩大生产规模期间，设计了针对Paraphysomonas sp.的物种特异性引物（图1E）。PCR优化显示引物具有高特异性和敏感性，即使在污染物仅占Illumina 18S V9测序读数的0.1%的样品中也能成功检测到Paraphysomonas DNA（图4和S4 – 补充材料）。随后将优化后的引物对应用于第二次采样程序收集的样品，以确定Paraphysomonas sp.首次出现的阶段。PCR筛查显示，HBC在实验室规模的培养物、平板PBRs和水样中不存在，但在工业PBRs中培养五天后被检测到（表S2，补充材料）。每天对受污染的实验室规模T. lutea培养物的显微镜观察揭示了Paraphysomonas sp.的不同进食阶段。两天后，观察到小的（约2 µm）鞭毛细胞，它们无法捕食较大的T. lutea细胞（约6 µm直径）（图5A）。到第四天，这些细胞发展成较大的（15–20 µm）鞭毛变形虫形态，能够捕食多个微藻细胞（图5B-E）。
**缓解策略的评估**
在确认Paraphysomonas sp.对T. lutea培养物的生物学影响后，评估了几种环境和化学缓解策略控制HBC同时维持微藻生长的能力。培养物的颜色变化，从棕色（健康）变为黄色（受污染）再到透明（崩溃），被用作培养状态的定性指标（图6）。阴性对照（未受污染的T. lutea培养物）在0到2天之间表现出滞后阶段，然后在2到3天之间呈指数增长，到第6天进入稳定阶段，最终浓度约为2×10⁷细胞/mL（图7A）。相比之下，阳性对照（感染HBC的T. lutea培养物）的T. lutea细胞浓度没有显著增加。从第二天开始观察到鞭毛变形虫状细胞，到第6天培养物变得透明（图6C）。基于光密度的估计由于碎片和HBC细胞的光散射而高估了剩余细胞浓度，导致最终浓度约为4×10⁶细胞/mL。
**GeO2的缓解效果**
在1 mg L−1和2 mg L−1的盐度下，GeO2处理防止了培养物的崩溃，T. lutea细胞浓度与阴性对照没有显著差异，且未观察到污染物的存在（图7C）。相比之下，2 mg L−1的K2HPO4不仅未能防止污染物的发展，还导致细胞浓度显著下降。在20 mg L⁻1的盐度下，所有时间点的细胞浓度都显著高于阴性对照；然而，显微镜检查显示微藻细胞受到压力，且细胞碎片较多。因此，从OD750测量估计的细胞浓度升高归因于碎片的光散射而非真正的生物量增加（图7D）。
**其他处理效果**
SDS和H₂O₂处理对Paraphysomonas sp.的生长没有抑制作用，培养物的动态与阳性对照相似（图7E、F）。三天后观察到鞭毛变形虫状细胞，到第六天培养物变得透明（图6C）。总体而言，1 mg L−1的GeO2和高盐度（60 ppt）有效控制了Paraphysomonas sp.，同时维持了T. lutea的生长。鉴于反复增加盐度可能带来的生理压力，选择GeO2进行进一步评估。
**验证实验**
进一步评估了1 mg L−1 GeO2的有效性（图8和9）。阴性对照（未受污染的T. lutea培养物）从第14天开始持续指数增长，细胞数量从4×10⁶增加到2×10⁷细胞/mL，硝酸盐吸收量保持稳定（约2 mM）。阳性对照（感染HBC的T. lutea培养物）在第四天之前与阴性对照相当，但在第七天崩溃（图8），同时Paraphysomonas sp.细胞浓度显著增加（6×10⁶细胞/mL），硝酸盐吸收量减少（<1 mM）（图9）。由于本研究的重点是真核食草生物，因此没有进一步分析细菌组（bacteriome）。在所有检测到的微生物单元（zOTUs）中，选择了三个主要候选者进行进一步分析：一种眼虫（zOTU28）、一种金藻（zOTU4）和一种纤毛虫（zOTU9）。眼虫是无色的双鞭毛原生生物，能够以微藻为食，但很少以细菌为食（Kostygov等人，2021年）。然而，显微镜观察并未发现与Diplonema类似的鞭毛生物，因此没有进一步研究这一分类单元。Euplotes属的纤毛虫以微藻（如Chlorella vulgaris、Dunaliella salina和Nannochloropsis salina）为食，并且据报道会导致培养物迅速崩溃（Day等人，2017年）。尽管如此，基于显微镜的观察表明，纤毛虫仅在培养物开始衰退后出现，这表明它们是次级机会主义者，而非崩溃的主要原因。此外，纤毛虫通常对多种缓解策略敏感，包括硫酸奎宁和SDS（Molina-Grima等人，2022年），因此在实际应用中问题较小。
相比之下，Paraphysomonas属的金藻是无色的金藻，能够形成囊肿并带有通常只有通过电子显微镜才能看到的硅质鳞片（Scoble和Cavalier-Smith，2014年）。该属已知以细菌（例如Vibrio natrigens）和甲藻（如T. lutea和Pavlova lutheri）为食（Davidson和John，2001年）。当这两种猎物同时存在时，Paraphysomonas更倾向于摄取浮游植物。根据系统发育分析、摄食行为和显微镜观察，Paraphysomonas sp.被认为是导致T. lutea培养物崩溃的最可能原因。本研究开发的物种特异性引物对对检测Paraphysomonas sp.表现出高特异性和敏感性。在扩大规模的应用中，发现这种污染物在接种后几天内首次出现在工业光生物反应器中。这表明Paraphysomonas sp.可能以抗性囊肿的形式存在于工业系统中，能够存活于常规清洁程序中，并在适宜的生长条件下脱囊。尽管光生物反应器是封闭的，但由于空气、水或灭菌不完全，污染仍可能发生，尤其是对于具有变形虫行为和抗性形态阶段的生物（Zhu等人，2017年）。
先前的研究表明，Paraphysomonas属物种可以以多种浮游植物和细菌为食，在食物有限的情况下甚至表现出同类相食的行为（Goldman和Caron，1985年）。形成物种特异性口囊的能力使这些生物能够在恶劣的环境条件下生存，并促进其全球传播（Nicholls和Wujek，2003年）。结合其小体积、异养代谢和快速生长特性，这些特点使得在大规模培养中难以早期发现它们。因此，分子监测方法对于早期检测这些食草生物非常有用，可以在培养物不可逆崩溃之前及时采取干预措施。
缓解策略的有效性
缓解试验的目的是在受控条件下污染健康的T. lutea培养物，并评估能够限制食草生物增殖同时保持藻类生长的环境和化学策略。这种方法将生物学见解直接转化为适用于大规模培养系统的实际解决方案。培养物的颜色变化被用作污染状态的定性指标，反映了食草事件期间微藻生物量的减少。在其他藻类系统中也报告了类似的颜色变化，其中食草行为导致叶绿体降解、色素减少和细胞密度降低（Ma等人，2018年）。定量测量（包括细胞浓度和营养吸收）补充了这些视觉观察结果。提高盐度有效抑制了HBC的增殖，这与先前的研究一致，即大多数Paraphysomonas物种主要是淡水生物，只有少数海洋物种能在超过35 ppt的盐度下生存（Nicholls和Wujek，2003年）。相比之下，T. lutea是一种耐盐物种，能够在广泛的盐度范围内生长（35–75 ppt），这解释了在本研究中观察到的其在高盐度条件下的适应性（Ishika等人，2017年）。GeO2也被证明能有效延缓培养物崩溃。它天然存在于水生环境中，可以替代具有硅质结构的生物中的硅。研究表明，GeO2通过干扰硅代谢和细胞分裂来抑制硅藻的生长（Lewin，1966年）。由于Paraphysomonas sp.细胞具有硅质鳞片，加入GeO2可能会破坏鳞片的形成或干扰DNA聚合酶等细胞过程，从而限制其种群增长（Leet，1978年）。K2HPO4在较高浓度下对Paraphysomonas sp.具有抑制作用；然而，这些浓度也会对T. lutea产生负面影响，限制了其作为选择性缓解策略的适用性。同样，尽管SDS和H2O2被报道对其他微生物污染物有效（Witono等人，2020年；Wen等人，2021年），但它们对Paraphysomonas sp.无效，可能是由于硅质鳞片保护细胞膜免受化学损伤。提高盐度和使用GeO2都能将Paraphysomonas引起的崩溃延迟约一周，而不会显著影响T. lutea的生长。然而，在连续培养系统中反复施加环境压力可能不可行，因为这最终可能损害藻类的表现。相比之下，使用GeO2的化学缓解措施可以在检测到污染物后重复应用。类似的定期化学处理策略已在其他藻类系统中成功用于控制食草生物（Méndez和Uribe，2012年；Pradeep等人，2015年）。总体而言，这些发现表明GeO2是一种有前景的缓解选项，可以延长T. lutea培养物的存活时间，尽管需要进一步研究处理频率和长期效果。
结论
本研究证明，18S rDNA扩增子测序是检测工业T. lutea培养物中多种真核生物的有效方法。导致培养物崩溃的HBC被鉴定为Paraphysomonas sp.（金藻门），这是一种具有显著形态可塑性的食草生物，这可能有助于其在大规模培养系统中的持续存在及其捕食微藻的能力。使用新设计的物种特异性引物对进行分子检测提供了一种敏感的早期预警工具，能够在显微镜难以观察到的极低丰度下检测到Paraphysomonas sp.。同时，实验室规模的缓解试验表明，使用1 mg L⁻1 GeO2处理能有效延缓污染物的增殖和培养物崩溃，而不会对T. lutea的生长产生不利影响。这些结果共同强调了将分子监测与针对性缓解策略相结合的价值，有助于提高大规模微藻生产中食草生物的早期检测和管理，从而实现更具韧性和经济可行性的培养系统。
