摘要
尽管已有许多研究探讨了银纳米颗粒（AgNPs）的绿色生产方法，但只有少数研究专门探讨了使用Ocimum gratissimum（OG）提取物作为还原剂和稳定剂合成这些纳米颗粒时的抗菌性能。在本研究中，使用OG提取物合成了AgNPs，并改变了关键参数，包括硝酸银（AgNO3）的浓度（0.01–0.05 M）、溶液pH值（6.0–10.0）以及OG提取物与AgNO3的比例。合成得到的纳米颗粒处于纳米范围内，具有良好的多分散性指数值。AgNPs-OG的抗菌活性针对了临床相关的病原体，包括铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）。值得注意的是，这些合成的纳米颗粒不仅表现出杀菌效果，还能有效消除这些病原体的浮游形式和生物膜形式。此外，AgNPs-OG配方对多重耐药性肺炎克雷伯菌菌株也显示出有效性，这突显了其在对抗这些细菌威胁引起的感染中的潜在应用。
1 引言
纳米技术已成为现代科学中的一个关键领域，促进了先进材料的发展，这些材料在医学、工业和环境科学中都有应用[1]。在研究的各种纳米材料中，银纳米颗粒（AgNPs）因其独特的物理化学性质而受到广泛关注，包括其导电性、光学特性和强大的抗菌效果。这些性质使AgNPs在生物医学应用中非常有用，例如用于医疗设备的涂层、伤口敷料和医疗环境中的抗菌剂[2]。然而，传统的合成方法通常依赖于有毒的化学还原剂，这引发了关于环境可持续性、潜在的细胞毒性以及纳米颗粒废物长期生态影响的担忧[3, 4]。现代医学面临的一个主要挑战是抗菌耐药性的日益普遍，这对全球健康构成了重大威胁。根据世界卫生组织的数据，抗菌剂的过度和无节制使用加速了耐药菌株的出现，导致发病率和死亡率升高，特别是在低收入和中等收入国家[5]。由多重耐药（MDR）细菌引起的感染，包括铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌，尤其令人担忧，因为这些细菌能够形成生物膜[6]。生物膜是由细菌组成的结构化社区，嵌入在自我产生的细胞外基质中，这增强了对抗生素和宿主免疫反应的抵抗力。与生物膜相关的感染的持续存在在临床环境中是一个重大挑战，特别是在慢性伤口、植入式医疗设备和呼吸道感染中[7]。因此，开发能够有效针对生物膜相关MDR病原体的新型抗菌策略是一个紧迫的优先事项。为了解决这些问题，绿色合成AgNPs已成为传统化学合成的一种有前景的替代方法。这种环保方法利用植物提取物作为还原剂和稳定剂，具有多种优势，包括生物相容性、降低毒性和环境可持续性[3, 8]。植物提取物含有多种生物活性化合物，如多酚、黄酮类和萜类化合物，这些化合物不仅有助于银离子的还原，还有助于纳米颗粒的稳定[9]。这种方法符合绿色化学的原则，减少了有害化学物质的使用，同时增强了合成纳米颗粒的生物医学潜力。在用于纳米颗粒合成的药用植物中，Ocimum gratissimum（OG），通常被称为非洲罗勒，因其抗菌、抗氧化和抗炎特性而受到认可[10-13]。OG中存在的植物化学物质不仅能够合成稳定的AgNPs，还可能增强其抗菌效果。研究表明，植物介导的AgNPs与化学合成的AgNPs相比，可以表现出更强的抗菌活性，这是由于植物化学物质和银离子的协同作用[14]。然而，尽管人们对绿色纳米技术的兴趣日益增长，但专门研究使用OG提取物合成的AgNPs的抗菌潜力的研究仍然有限，特别是针对形成生物膜的MDR病原体[15, 16]。本研究旨在通过使用OG提取物合成AgNPs并评估其对临床相关病原体的抗菌活性来填补这一空白。该研究重点评估这些纳米颗粒对浮游形式和生物膜相关细菌形式的效力，突显了它们作为对抗耐药性感染的替代治疗剂的潜力。通过提供关于植物介导的AgNPs生物活性的新见解，本研究为开发可持续和有效的抗菌策略以对抗MDR细菌做出了贡献。此外，实验部分在支持信息中提供。
2 结果与讨论
合成路线在决定AgNPs的环境影响、安全性和功能质量方面起着关键作用。传统的化学合成方法虽然在产生均匀纳米颗粒方面有效，但通常依赖于强还原剂，如硼氢化钠（NaBH4），这些还原剂成本高昂、反应性强，并会产生需要严格处理程序的有毒副产品。此外，这些试剂通常由专门的化学制造商提供，从而增加了对外部供应商的依赖性并提高了生产成本。相比之下，绿色合成作为一种可持续、更安全、更环保的替代方法出现，使用植物衍生的植物化学物质或农业工业废弃物作为天然的还原剂和稳定剂。这种方法消除了对合成化学还原剂的依赖，并减少了控制储存或专门处理基础设施的需求。此外，它可以直接使用天然提取物或低价值的农业副产品，这些副产品同时充当还原剂和稳定剂，从而消除了对额外稳定剂的需求。在这种方法中，成功使用了一种天然可用的还原剂，它同时也起到了稳定剂的作用。这种方法不需要购买昂贵的化学试剂，只需要最少的储存和处理基础设施。此外，由于这些化合物天然存在于植物提取物中，因此不需要额外的稳定剂。因此，绿色合成显著降低了生产成本和废物产生，为没有先进化学基础设施的实验室或工业提供了实用且可行的途径。这种环保路线减少了有害废物的产生，降低了能源消耗，并通常增强了纳米颗粒的稳定性和生物相容性。因此，绿色合成符合绿色化学的原则，为AgNP的生产提供了一种高效、可扩展且生物相容的途径——特别是对于生物医学和抗菌应用而言。
2.1 银植物纳米颗粒的UV–vis表征
图1展示了OG叶提取物、AgNPs-OG溶液和标准AgNPs（通过柠檬酸钠或硼氢化钠还原）的UV–可见光谱。首先，需要强调的是，OG叶提取物在AgNPs表面等离子体共振（SPR）范围内没有吸收带，这是分析胶体溶液形成的一个重要因素。
2.2 DLS和Zeta电位表征
图4显示了在不同溶液pH值下合成的AgNPs-OG的流体动力学尺寸和多分散性指数（PDI），以及透析前后的情况。数据表明，介质的pH值和AgNPs–OG对纳米粒子的性质有显著影响：随着介质碱性的增加，粒子尺寸减小。此外，当pH值超过8时，多分散指数（PDI）下降，表明粒子尺寸分布变得更窄。然而，所有介质pH值下的ζ电位值仍处于不稳定区域。经过透析后，纳米粒子的胶体稳定性提高，表现为ζ电位值变得更负。这种负偏移归因于OG提取物中的酚类和黄酮类化合物产生的表面活性物质，这些化合物含有羟基和羧基官能团，有助于形成表面电荷。根据Cacua等人的研究（2019年），ζ电位值在-30至+30 mV范围内时，粒子倾向于聚集，形成更大的聚集体[27]。透析后，可见吸收峰的最大强度降低，并向445 nm处红移，同时pH值也有所下降。这种行为，加上在较短波长（约370 nm）处出现低强度的肩峰，表明纳米粒子是由较大粒子及其聚合物链段的断裂形成的。
2.3 FT-IR光谱表征
对合成的AgNPs-OG和OG叶提取物的FT-IR光谱进行了分析，以确定参与AgNPs还原和稳定的潜在生物分子。图5显示了不同pH值下AgNPs-OG的FT-IR光谱。提取物光谱中的强吸收峰位于3240和2932 cm^-1，对应于O─H伸缩振动，表明提取物中存在酚类和醇类化合物。在AgNPs-OG的光谱中，相应的峰位略微移动到3370和2940 cm^-1，表明多酚的羟基与银离子在纳米粒子形成过程中发生了相互作用。其他植物介导的AgNP合成中也报告了类似的峰位移动，其中─OH和C═O基团作为电子供体，负责Ag+离子的还原和生成的纳米粒子的封端[23, 28]。图5显示了从OG水叶提取物中合成的AgNP的FT-IR光谱。在低频区域，提取物中的以下峰位被识别：1045 cm^-1与C─C键的伸缩振动和羧酸的C─OH伸缩振动相关，而1388和1590 cm^-1分别对应于酰胺I的C─O伸缩振动和酰胺II的NH基团弯曲振动，表明存在蛋白质[4, 29]。这些生物分子可能通过配位或吸附在AgNP表面来促进纳米粒子的稳定。在不同pH值下获得的FT-IR光谱显示出相似的吸收峰，尽管在pH 6.0时1715 cm^-1处的峰消失了，这表明质子化状态和分子相互作用受到pH值调整的影响。总体而言，FT-IR结果与之前关于绿色合成AgNP的研究一致，证实了酚类、羧基和酰胺官能团在还原和稳定过程中的双重作用[23, 28]。尽管本研究没有进行形态学成像（SEM/TEM），但UV–vis、DLS、ζ电位和FT-IR数据的综合提供了纳米粒子形成和稳定性的有力证据，与之前关于绿色合成AgNP的报道相符。
2.4 AgNPs对浮游细菌和早期生物膜的抗菌活性
最后一步是评估合成的AgNPs-OG对临床相关多重耐药（MDR）细菌（如K. pneumoniae和P. aeruginosa）的抗菌活性。微生物评估分为两个阶段：（i）使用扩散抑制方法进行初步筛选；（ii）通过肉汤稀释和生物膜灭活试验进行定量评估。在第一阶段，使用了上述病原体的浮游培养物（自由漂浮的细菌），并使用标准定性扩散试验测试了合成的AgNPs-OG。图6显示了在不同pH值（7和10）下合成的AgNPs-OG对K. pneumoniae和P. aeruginosa的抑制圈。抑制圈直径的平均值分别为14毫米和20毫米。重复实验中抑制圈直径的相似性表明，无论合成时使用的pH值如何，AgNPs-OG对这两种微生物都表现出一致的抑制效果。尽管两种细菌都出现了抑制圈，但P. aeruginosa的抑制圈比K. pneumoniae的更大。这种差异可能归因于Klebsiella菌株的特定特性，特别是其产生多糖荚膜的能力，这种荚膜作为主要的毒力因子，可能阻碍银离子的渗透。其他作者也使用扩散抑制方法记录了这两种细菌的抑制圈形成[30, 31]。值得注意的是，Sharma等人（2019年）也使用OG合成了AgNPs，并观察到其对革兰氏阴性细菌（包括K. pneumoniae）的抑制圈比革兰氏阳性细菌更大，这表明革兰氏阴性细菌可能对AgNPs更敏感[4]。尽管初步试验确认了AgNPs-OG的抗菌潜力，但并未确定最小抑制浓度或杀菌浓度。因此，第二阶段使用肉汤稀释方法进行了定量评估。测试了一系列AgNPs-OG浓度，表示为原始透析溶液的稀释倍数（最大AgNPs-OG浓度），范围从1/16384到1/8（269.7 µg/mL）。结果显示，P. aeruginosa的MIC和MBC值分别为1/512（4.2 µg/mL）和1/128（16.85 µg/mL），而K. pneumoniae的MIC和MBC值分别为1/64（33.7 µg/mL）和1/32（67.42 µg/mL），证实了其更高的内在抗性。这些发现与Alotaibi等人的研究结果一致（2022年），他们报告称浮游P. aeruginosa对AgNPs更敏感（MIC：16 µg/mL），而K. pneumoniae则不然[32]。同样，Siddique等人（2020年）报告K. pneumoniae的MIC和MBC值分别为62.5至125 µg/mL和250至500 µg/mL，而Kamer等人观察到耐药P. aeruginosa分离株的MIC值为2.65–21.25 µg/mL，表明该物种的敏感性更高[33]。相比之下，这里合成的AgNPs-OG表现出更强的杀菌活性，能够抑制并消灭测试的病原体。
2.4 AgNPs对浮游细菌和早期生物膜的抗菌活性
最后一步是评估合成的AgNPs-OG对临床相关多重耐药（MDR）细菌（如K. pneumoniae和P. aeruginosa）的抗菌活性。微生物评估分为两个阶段：（i）使用扩散抑制方法进行初步筛选；（ii）通过肉汤稀释和生物膜灭活试验进行定量评估。在第一阶段，使用了上述病原体的浮游培养物（自由漂浮的细菌），并使用标准定性扩散试验测试了合成的AgNPs-OG。图6显示了在不同pH值（7和10）下合成的AgNPs-OG对K. pneumoniae和P. aeruginosa的抑制圈。抑制圈直径的相似性表明，无论合成时使用的pH值如何，AgNPs-OG对这两种微生物都表现出一致的抑制效果。尽管两种细菌都出现了抑制圈，但P. aeruginosa的抑制圈比K. pneumoniae的更大。这种差异可能归因于Klebsiella菌株的特定特性，特别是其产生多糖荚膜的能力，这种荚膜作为主要的毒力因子，可能阻碍银离子的渗透。其他作者也使用扩散抑制方法记录了这两种细菌的抑制圈形成[30, 31]。值得注意的是，Sharma等人（2019年）也使用OG合成了AgNPs，并观察到其对革兰氏阴性细菌（包括K. pneumoniae）的抑制圈比革兰氏阳性细菌更大，这表明革兰氏阴性细菌可能对AgNPs更敏感[4]。尽管初步试验确认了AgNPs-OG的抗菌潜力，但并未确定最小抑制浓度或杀菌浓度。因此，第二阶段使用肉汤稀释方法进行了定量评估。为此，测试了一系列AgNPs-OG浓度，表示为原始透析溶液的稀释倍数（最大AgNPs-OG浓度），范围从1/16384到1/8（269.7 µg/mL）。结果显示，P. aeruginosa的MIC和MBC值分别为1/512（4.2 µg/mL）和1/128（16.85 µg/mL），而K. pneumoniae的MIC和MBC值分别为1/64（33.7 µg/mL）和1/32（67.42 µg/mL），证实了其更高的内在抗性。这些发现与Alotaibi等人的研究结果一致（2022年），他们报告称浮游P. aeruginosa对AgNPs更敏感（MIC：16 µg/mL），而K. pneumoniae则不然[32]。同样，Siddique等人（2020年）报告K. pneumoniae的MIC和MBC值分别为62.5至125 µg/mL和250至500 µg/mL，而Kamer等人观察到耐药P. aeruginosa分离株的MIC值为2.65–21.25 µg/mL，表明该物种的敏感性更高[33]。相比之下，这里合成的AgNPs-OG显示出更强的杀菌活性，能够抑制并消灭测试的病原体。
3 结论
使用OG提取物合成的银纳米粒子表现出强烈的抗菌活性，有效抑制了临床相关病原体的生长并消除了生物膜，包括耐抗生素菌株。这些结果证实，绿色合成方法是一种可重复的、多功能的、环保的途径，可用于获得稳定的、具有生物活性的AgNPs，适用于生物医学应用。本研究强调了OG培养质量的重要性，特别是还原性植物化合物的含量，这些化合物显著影响AgNPs的形成和抗菌效果。这些发现为开发用于医疗设备、伤口敷料和其他需要抗菌表面的抗菌涂层提供了新的可能性。尽管AgNPs在自由状态下可能表现出细胞毒性，但本工作设想将其固定在材料表面上，从而减少细胞直接暴露。未来的研究将重点评估细胞相容性并优化表面负载，以确保安全性和有效性。
致谢
本研究得到了圣保罗研究基金会（FAPESP [2022/07411-5]和CNPq [授权号302158/2022-7和152322/2022-1]的支持。本文的发表费用由巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES）（ROR标识符：00x0ma614）资助。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向通讯作者索取，如有合理要求。
