穆罕默德·M·Y·卡达（Mohamed M.Y. Kaddah）、特蕾莎·W-M·范（Teresa W-M. Fan）、贾希德·M·M·伊斯兰（Jahid M.M. Islam）、林鹏辉（Penghui Lin）、特蕾莎·A·卡塞尔（Teresa A. Cassel）、理查德·坎宁安（Richard Cunningham）、汤姆·布朗（Tom Brown）、理查德·M·东（Richard M. Higashi）和安德鲁·N·莱恩（Andrew N. Lane）
美国肯塔基大学马基癌症中心环境与系统生物化学中心，列克星敦，KY 40536
**摘要**
EZH2增强子（enhancer of EZH2），一种组蛋白H3K27三甲基转移酶，是癌症中经常失调的关键表观遗传调控因子。要确定其对完整细胞中核苷酸生物合成和核酸甲基化的影响，需要高度敏感且能区分异构体的分析方法。我们开发了一种靶向离子色谱-超高分辨率傅里叶变换质谱（IC-UHR-FTMS）技术，其柱上定量限低至9飞摩尔，用于检测A549细胞在EZH2敲低（KD）后DNA、总RNA和mRNA的甲基化变化。通过使用双重稳定同位素示踪剂L-甲硫氨酸-(methyl-13C)和L-谷氨酰胺-(15N2)，并在多重稳定同位素代谢组学（SIRM）设计中，我们定量分析了甲基化核苷酸及其前体的13C/15N标记位置。EZH2敲低减少了脱氧核苷酸中的15N掺入，表明从谷氨酰胺开始的从头合成受到抑制。此外，它还减弱了总RNA和mRNA中核苷酸及甲基化核苷酸在多个原子位置的15N和/或13C标记，反映了生物合成和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖性甲基化的整体减少。值得注意的是，AMP在N6和2′-O位置的甲基化对EZH2敲低最为敏感，这表明 capped-RNA的翻译受到抑制。一些由EZH2敲低引起的RNA甲基化变化与其相应的“写入”或“擦除”酶的表达改变相一致。本研究证明了多重稳定同位素示踪剂结合IC-UHR-MS是追踪哺乳动物细胞中甲基化动态的强大工具，并揭示了EZH2通过调节由谷氨酰胺驱动的从头嘌呤生物合成和RNA甲基化来调控代谢-表观转录组的作用。
**引言**
在DNA、RNA和蛋白质水平上存在多种分子调控机制[1]，包括转录后和翻译后的修饰[2]。现已知甲基化是DNA、RNA和蛋白质的重要表观遗传调控过程，影响转录、RNA稳定性和剪接以及翻译[2][3]。大约1%的脱氧胞苷（dC）在DNA的5位点被甲基化[4]，但在CpG岛中这一比例更高，通常达到50-80%[5][6]。低水平的甲基化使得定量分析变得困难，尤其是在使用同位素示踪剂和质谱（MS）追踪转录后修饰时，因为多种标记的质量同位素会进一步降低MS的检测能力。RNA（包括mRNA和rRNA）的所有四个核苷酸位置都可能发生甲基化，例如腺嘌呤（A）的N6位、鸟嘌呤（G）的N7位以及所有四种核糖的2'-O位[7]。然而，不同类型RNA中甲基化的程度各不相同。例如，rRNA倾向于在2′-O位甲基化[3]，mRNA在N6A位有更高的甲基化率[8]，microRNA含有更多的MeC和MeA标记[9][10]，mRNA的5'UTR帽在末端G的N7位和相邻核苷酸的2'-O位也发生甲基化[11]。此外，组蛋白（如组蛋白3（H3）在K4、K9、K27等位置以及精氨酸残基（如H3R2、H3R8、H3R17、H3R26和H4R3）上也可以发生甲基化[12]。在所有情况下，甲基化都是由特定的甲基转移酶（“写入”酶）使用SAM作为通用甲基供体催化的[13][14][15]，而甲基基团可以通过氧化酶（如DNA的ten-eleven转位双加氧酶（TET）[6]、RNA的ALKBH5[17]以及组蛋白的KDM1A、JmjC结构域去甲基化酶[12][18][19][20]）去除。识别甲基基团存在的“读取”蛋白随后负责招募调节转录和/或翻译的功能蛋白[19]。
EZH2是PRC2的催化亚基，是一种关键的表观遗传调控因子，它将SAM的甲基转移到组蛋白H3的27位。这导致H3的三甲基化（H3K27me3），进而抑制目标基因的转录[21][22]，包括肿瘤抑制因子GSK3β和TP53[23]。这种组蛋白修饰促进染色质压缩和基因沉默，在胚胎发育、干细胞维持和谱系决定中起关键作用[24][25]。除了组蛋白甲基化外，EZH2还可以修饰非组蛋白（如GATA4），或通过与PRC2无关的转录调控因子相互作用来调节基因表达[26][27]。最近的研究表明，EZH2通过调节核糖体RNA的甲基化来促进癌细胞的蛋白质翻译起始[28]。通过这些机制，EZH2调控多种生物过程，包括细胞周期进展[29]、凋亡[30]和DNA损伤修复。因此，EZH2的失调与许多癌症（如前列腺[31]、乳腺[32]、胃[33]、食管[34]、肾[35]和肺癌[36][37]的肿瘤发生、转移、治疗抵抗性和不良预后密切相关。我们之前的工作进一步证明，EZH2调节肺腺癌细胞A549球体的多种中心代谢途径。利用稳定同位素代谢组学（SIRM）方法，我们发现EZH2敲低激活了关键的代谢途径，包括克雷布斯循环、戊糖磷酸途径和嘌呤回收途径[37]。这些新兴的非经典功能表明，EZH2可能不仅通过组蛋白H3K27的三甲基化，还通过更广泛的代谢和基于RNA的调控机制影响细胞过程，这些机制仍有待明确。
EZH2还被证明通过调节肺癌细胞中的EZH2–SLC7A5（一种甲硫氨酸转运蛋白）循环来间接影响SAM池，尽管SAM合成酶甲硫氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A）似乎不受EZH2调控[38]。SAM的甲基基团来自一碳代谢物N5-甲基四氢叶酸中的甲硫氨酸。该循环还产生SAM合成的抑制产物S-腺苷同型半胱氨酸（SAH），而SAM:SAH的比例是细胞甲基化潜力的关键决定因素[14][15]。此外，EZH2通过与纤维蛋白原（FBL，一种对核糖体生物生成至关重要的核仁蛋白）相互作用来调节核糖体RNA（rRNA）的2′-O位甲基化，从而增强帽独立翻译[28]。因此，EZH2可能作为表观遗传、表观转录组和代谢网络的协调者。阐明这一联系有助于全面了解EZH2的生物学功能，并揭示EZH2介导的人类疾病中的新脆弱性[38][39][40]。然而，EZH2如何调节对表观转录组控制至关重要的RNA甲基化仍不清楚。
在这里，我们描述了一个结合多重SIRM（mSIRM）与离子色谱-超高分辨率傅里叶变换质谱（IC-UHR-FTMS）的新平台，能够同时定量追踪EZH2引起的A549细胞中甲硫氨酸循环、核苷酸合成以及DNA、RNA和蛋白质甲基化途径动态的变化。在本研究中，使用稳定同位素示踪剂L-谷氨酰胺-(15N2)和L-甲硫氨酸-(methyl-13C)同时监测核碱基的从头合成和SAM介导的碱基及核糖的甲基化，以及蛋白质中的赖氨酸和精氨酸的甲基化。UHR-FTMS分析能够分辨同一核苷酸中的13C和15N原子，定量限（LLOQ）为0.3 ng/mL（约9 fmol/柱），从而可靠地检测低丰度的甲基化物种及其标记的同位素异构体。当在数据依赖的MS2（ddMS2）模式下运行时，该分析不仅定位了甲基化位置（如6-N、7-N、5-C和2′-O，由13C标记指示），还区分了新合成的（由15N标记指示）与现有核酸中的甲基化。我们的结果表明，EZH2敲低减少了SAM的合成，导致总RNA和mRNA中的甲基化以及从头合成的脱氧核苷酸/核苷酸及其在DNA和RNA中的掺入减少。然而，我们观察到AMP在N6、2′-O位置的甲基化（mN6,O2’AMP）和CMP在C-5位置的甲基化（m5CMP）增强，尽管其未甲基化的对应物合成减少。此外，双重示踪剂SIRM显示蛋白质衍生的二甲基精氨酸（CH3)2-Arg和三甲基赖氨酸（((CH3)3-Lys）中的13C甲基化减少，表明SAM供给的蛋白质甲基化和/或周转在EZH2敲低后减少。由于mN6,O2’AMP（与帽依赖性蛋白质翻译相关的表观转录组标志物[41]）和m5CMP[42]被认为是mRNA稳定性和/或翻译效率的敏感标志物，这些发现揭示了EZH2的调控范围超出了染色质沉默，为进一步研究EZH2协调一碳/核苷酸代谢和非组蛋白靶标的SAM依赖性甲基化的分子机制打开了大门。
总之，我们的多重SIRM结合IC-UHR-MS/MS平台提供了一种强大且前所未有的工具，用于定量和结构上探索代谢-表观遗传-表观转录组相互作用。尽管本研究以A549细胞作为概念验证模型，但IC-UHR-FTMS/SIRM方法广泛适用于其他疾病系统，观察到的EZH2依赖性甲基化重塑在不同组织类型中的保守程度仍有待确定。
**化学品和试剂**
UHPLC-MS级甲醇（≥99.9%）购自VWR International LLC（美国宾夕法尼亚州Radnor）。超纯去离子水（电阻率为18.2 MΩ·cm，电导率为0.055 μS/cm）使用Milli-Q® Advantage-A10水纯化系统（美国马萨诸塞州Bedford）制备。用于定量的单个标准品购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）、Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州Waltham）和ATDBio Ltd.（英国牛津市Littlemore）。
**L-谷氨酰胺-(15N2, 98%) 和 IC-UHR-FTMS**
IC-UHR-FTMS1/MS2提供了对甲基化核苷酸及其13C、15N标记位置的全面分析，这对于确定生物系统中的核苷酸甲基化动态至关重要。在本研究中，我们利用IC-UHR-FTMS1有效分离并鉴定了核酸酶消化的A549核酸提取物中的三十四种甲基化核苷单磷酸（NMPs）的结构异构体。我们还应用了靶向数据依赖的MS/MS（ddMS2）方法来获取这些NMPs的质量片段，以进行全面的结构分析。
**结论**
通过将双重稳定同位素追踪与IC-UHR-FTMS/MS2相结合，我们建立了一种定量、原子位置分辨的分析方法，可以同时追踪核苷酸的从头合成和进入甲基化代谢物的碳流，包括不同核酸中的甲基化核苷酸残基。这种方法还区分了现有核酸和新合成核酸中的甲基化，分别反映了非增殖状态和...
**作者贡献声明**
理查德·坎宁安（Richard Cunningham）：研究；
汤姆·布朗（Tom Brown）：写作-审阅与编辑、监督、方法学；
林鹏辉（Penghui Lin）：写作-审阅与编辑、方法学；
特蕾莎·A·卡塞尔（Teresa A. Cassel）：写作-审阅与编辑、研究；
安德鲁·N·莱恩（Andrew N. Lane）：写作-审阅与编辑、原始草稿撰写、监督、项目管理、方法学、研究、资金获取、正式分析、概念化；
理查德·东（Richard Higashi）：写作-审阅与编辑、项目管理、方法学；
**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
**数据可用性**
本文报告的数据可在正文及其在线补充数据中找到。根据合理请求，相关作者还可以提供额外生成和分析的数据集。
**致谢**
本研究得到了P30CA177558代谢共享资源（资助B.M. Evers）、NIGMS COBRE 5P20GM121327（资助B.P. Zhou）和Edith D. Gardner捐赠教席基金（资助T.W.-M. Fan）的支持。A549 EZH2敲低细胞系由Christine Brainson博士慷慨提供。
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