在寻找适用于十足目甲壳类动物的有效且安全的麻醉剂方面：来自Procambarus clarkii的启示

I. Ruiz-Jarabo|L. Herrera-Castillo|D. Madera|N. Saiz|E. Isorna|M.J. Delgado|N. de Pedro
安达卢西亚海洋科学研究所-西班牙国家研究委员会（ICMAN-CSIC）海洋生物学与水产养殖系，西班牙加的斯省Puerto Real 11519

**摘要**
本研究评估了不同麻醉化合物对红沼虾（Procambarus clarkii）的有效性，该物种具有重要的商业价值。研究旨在应对提高甲壳类水产养殖动物福利标准的需求，通过评估麻醉剂如何减轻处理过程中引起的生理和行为应激反应。首先，我们研究了虾在暴露于空气中5分钟后的急性应激反应，观察到血淋巴pH值、乳酸、氯化物和血蓝蛋白发生了显著变化。接下来，我们测试了几种麻醉/镇静剂的效果，包括2-苯氧乙醇、乙醇、三卡因甲磺酸盐（MS-222）、丁香油、氯胺酮和赛拉嗪。结果表明，2-苯氧乙醇、乙醇和MS-222无法诱导深度麻醉；而丁香油（0.5 mL L⁻¹）、氯胺酮（50 μg g⁻¹）和赛拉嗪（15 μg g⁻¹）有效，且每种药物具有不同的诱导和恢复时间。麻醉后一小时的生理分析显示，赛拉嗪处理显著增加了血淋巴中的乳酸水平，这与急性应激后的情况相似。在开放场地测试中，接受赛拉嗪处理的虾靠近墙壁的时间减少，这表明其具有潜在的抗焦虑作用。氯胺酮似乎会延缓完全恢复，在麻醉后一小时仍表现出镇静迹象。总之，我们的发现表明丁香油是适用于P. clarkii的有效麻醉剂，因为它能诱导深度麻醉并有效缓解与应激相关的生理反应。本研究为通过使用麻醉剂改善甲壳类动物的福利提供了基础方案。

**1. 引言**
动物福利已成为社会和科学界关注的重点，尤其是在食品生产系统中。在为陆地牲畜和多种硬骨鱼类建立福利标准方面已经取得了显著进展（Arechavala López等人，2025；Webster，2005）。相比之下，关于甲壳类的研究相对较少（Diggles，2019），对此存在不同的观点（Diggles等人，2024；Crump等人，2022，2026；Elwood，2022，2025）。鉴于全球甲壳类水产养殖的迅速扩张，这一知识空白变得越来越重要。根据最新统计数据（FAO，2024），2022年甲壳类水产养殖产量达到1275万吨，比上一年增长了24.6%，而捕捞渔业仅贡献了568万吨。这一增长主要由对虾（占总产量的62.2%）和红沼虾（Procambarus clarkii，占总产量的23.3%）推动。

随着产量的增加，许多国家开始为十足类甲壳动物提供法律保护，承认它们是具有感知能力的动物，因此应受到福利保护（Albalat等人，2022）：澳大利亚（API，2020）、奥地利（Tierschutzgesetz，2004）、瑞士（TSchV，2008）、新西兰（NZ-Legislation，2008）、挪威（Government.no，2009）和英国（Gov.UK，2022）。然而，关于这一问题的争论仍在继续（Diggles等人，2024；Elwood，2025）。尽管英国的一份报告促使了立法变革（Birch等人，2021），但目前证据尚不充分，因为无法直接了解动物的思维状态，而神经生理和行为指标也不能提供绝对证明（Conneely和Coates，2024；Diggles，2019；Elwood，2025）。尽管存在不确定性，但在甲壳类生产中应用福利原则仍可带来可衡量的好处，无论感知能力争论的结果如何。改善福利与提高产品质量、降低疾病发生率以及增强生长性能直接相关，这对水产养殖的可持续性和盈利能力至关重要（Poli等人，2005）。在这种情况下，建议开发特定物种的福利指标（Albalat等人，2022），例如已经为虹鳟鱼所做的那样（Noble等人，2024）。在可用的方法中，生理标志物对于建立基线条件和检测与应激相关的偏差特别有价值（Jerez-Cepa和Ruiz-Jarabo，2021）。

应激被广泛定义为由内部或外部挑战引起的稳态紊乱。初级应激反应是激素的释放，随后是由此产生的次级反应。在甲壳类动物中，应激激活信号通路，动员能量储备并增强氧气供应，从而实现适应性反应和恢复（Jerez-Cepa和Ruiz-Jarabo，2021；Noble等人，2024）。在P. clarkii和其他甲壳类动物中，应激会改变能量代谢、酸碱平衡、渗透调节和免疫功能（Barragán-Méndez等人，2020；Tripp等人，2022），但相关知识仍然有限。因此，确定可靠的生物标志物至关重要（Albalat等人，2022；Conneely和Coates，2024）。葡萄糖和乳酸是甲壳类动物代谢应激的关键标志物（Barragán-Méndez等人，2020；Bonvillain等人，2012），而氧气消耗反映了能量消耗和恢复能力（Tripp等人，2022）。除了应激外，行为指标也被广泛用作福利指标，基于动物对安全区域和不适区域的偏好进行测试，假设在安全区域停留时间越长，焦虑程度越低（Elwood，2025；Maximino等人，2010）。主流科学观点建议在评估福利时至少包含一个反映动物情绪状态的指标（如恐惧或焦虑）（Reimert等人，2023）。此外，对P. clarkii和其他甲壳类动物的行为反应的研究（Campbell和Lee，2025；Jutfelt等人，2017；Robertson等人，2018）提供了被认为是评估福利的金标准方法。

在鱼类和甲壳类水产养殖中使用麻醉剂是一种公认的策略，可以减少网捕、运输、标记、称重、手术和疫苗接种等过程中的应激（Jiang等人，2020；Ross和Ross，2008），但针对甲壳类的标准协议仍不完善。麻醉剂的效果因物种、生命阶段和环境条件而异，某些化合物的效果不一致或具有不良影响（Rotllant等人，2023；Valente，2022）。三卡因甲磺酸盐（MS-222）是水生动物中最常用的麻醉剂，在虾类中有效（Perrot-Minnot等人，2021），但在十足类动物中效果不佳，包括P. clarkii（Ghanawi等人，2019；Palillo等人，2022），尽管它减少了它们的感觉神经元活动（Stanley等人，2020）。替代品如2-苯氧乙醇在鱼类中广泛使用（Mitjana等人，2014），但与刺龙虾的应激反应有关（Jensen等人，2013）。丁香油及其活性成分丁香酚在P. clarkii、Penaeus monodon和Cherax quadricarinatus中显示出良好的麻醉潜力（Elmas和Karadal，2022；Ghanawi等人，2019；Jiang等人，2020）。需要注意的是，添加到水中的麻醉剂通常比需要注射的麻醉剂对动物的压力更小。然而，可注射的麻醉剂如氯胺酮和赛拉嗪可以在螃蟹中诱导短期麻醉，但存在死亡风险或安全范围较窄（Premarathna等人，2016；Quesada等人，2011）。乙醇在一些无脊椎动物中使用（Fiorito等人，2015），并用作其他麻醉剂的溶剂，但在甲壳类动物中证明不适合作为麻醉剂（Valente，2022）。

本研究旨在评估不同麻醉化合物在十足类甲壳动物中的有效性，选择P. clarkii作为模型物种，因为它具有全球商业重要性并在生理研究中得到广泛应用（Bonvillain等人，2012；Mykles和Hui，2015）。我们的重点是分析次级应激反应，包括代谢和焦虑标志物，以确定哪些麻醉剂可以减轻急性处理应激。建立有效的麻醉方案不仅将改善动物福利，还能通过降低死亡率和提高产品质量来增强水产养殖的可持续性。

**2. 材料与方法**
**2.1. 动物和饲养环境**
本研究使用的物种已经入侵了欧洲的淡水河流和湖泊。根据西班牙现行法律（RD 630/2013），所有捕获的P. clarkii都必须被杀死。这些动物是通过与地方政府（马德里自治区）和休闲渔民的合作获得的。根据欧盟指南（2010/63/UE）和西班牙法律（RD 53/2013）关于实验室动物的使用规定，进行甲壳类动物实验不需要特殊许可。野生成年个体（体重15.47 ± 0.86克，甲壳长度40.3 ± 0.7毫米，平均值±标准误差SEM）由当地渔民捕获，并在实验前至少三周内适应马德里大学生物科学学院（UCM）动物生理学实验室的饲养环境。该系统采用循环水系统，配备过滤装置，温度控制在21.5 ± 0.5°C（平均值±标准偏差）。每个水族箱都有一个单独的庇护所。光照周期为12小时光照：12小时黑暗，光照时间为每天07:00。每天10:00提供食物（Novo Crabs，JBL，Neuhofe，德国）。每只动物仅用于一个实验，以确保数据的独立性。本研究的所有实验组在性别上保持平衡，雌雄个体数量相等，以便描述麻醉剂在物种层面的效果。

**2.2. 运动活动和代谢率**
记录了24只虾在7天内的运动活动（每个水箱8只个体，水箱尺寸为30 × 80厘米，水深6厘米），以确认动物对光照周期和喂食时间的适应情况（Herrera-Castillo等人，2024）。运动活动通过贴在水族箱壁上的5个红外光电传感器（E3S-AD12，OMRON Corporation，京都，日本）进行记录。水箱覆盖有不透明纸张。所有光电传感器连接到数据采集软件（Adq16，由Micronec公司专门为该目的开发）控制的计数器。每10分钟自动记录一次光束中断次数，所有数据使用EL TEMPS®进行分析（Chiesa等人，2006），以获得平均日节律、活动图和周期图。分析后，虾被禁食24小时，手工捕获，放入空水箱中暴露于空气中5分钟（以诱导急性应激反应），然后转移到呼吸测量室（13:30），并测量48小时的代谢率（详见第2.6节“代谢率”）。

**2.3. 急性应激后的时间过程**
该实验旨在确定该物种对急性应激的生理反应时间。禁食24小时的动物在10:00暴露于空气中5分钟，然后放入恢复水箱。在0小时（时间0）以及30分钟、60分钟和120分钟后（每个时间点5只虾）对动物进行采样。采样时，用湿布固定动物，不使用麻醉剂，并从左侧第二对步足中提取血淋巴。血淋巴立即按照以下方法进行分析（详见第2.7节“生理应激和恢复反应”）。

**2.4. 麻醉诱导和恢复时间**
麻醉阶段基于先前的描述（Valente，2022），并根据我们的观察结果进行了调整，同时结合了鱼类研究（Jerez-Cepa等人，2019）和其他水生动物的研究（Ross和Ross，2008）中的恢复阶段。实验方案还基于虾类的方法（Lorenzo等人，2025）。因此，提出的麻醉阶段包括：I）镇静和部分丧失直立反射及平衡能力，防御/逃跑反射减弱；II）触角运动反射丧失和眼柄缩回能力丧失；III）完全失去平衡能力（如果将动物推倒，它无法自行恢复，头胸部的腹侧接触地面）；IV）完全静止，包括步足和腹肢，但颚须仍在泵动，颚肢仍在移动。提出的恢复阶段包括：1）步行腿（步足）首次移动；2）将动物置于背部位置，即动物恢复正常位置，腿接触地面；3）触角在刺激下恢复活动能力以及眼柄缩回；4）协调探索环境，触角和眼睛以及爪子和步行腿主动移动，尽管仍存在轻微的平衡丧失和对刺激的反应；5）恢复防御和逃跑能力。观察过程中使用玻璃棒刺激动物，但尽量减少对麻醉或恢复过程的潜在影响。建议用于诱导鱼类深度麻醉的最大时间为3分钟，而恢复时间不应超过10分钟（Ross和Ross，2008年），因此最好能尽快完成这些过程。因此，在有证据表明甲壳类动物的情况可能有所不同之前，本研究将采用这些前提来选择每种麻醉剂的适当浓度。基于之前关于甲壳类动物和鱼类的研究（Brown等人，1996年；Priborsky和Velisek，2018年；Rotllant等人，2023年；Valente，2022年），我们进行了预试验，使用不同的麻醉剂来找到每种麻醉剂的适当范围，以便在当前研究中进行更深入的分析。因此，我们在禁食24小时的动物身上从10:00到16:00进行了试验，使用的化学物质及其浓度范围如下：2-苯氧乙醇（77,699，Sigma-Aldrich；0.5–16 mL L−1）、乙醇（5–40 mL L−1）、丁香油（C-8392，Sigma-Aldrich；0.25–4 mL L−1；根据Hempstead等人，2018年的研究，估计丁香酚浓度为83–85%）、MS-222（E-10521，Sigma-Aldrich；50–1000 mg L−1）、氯胺酮（Imalgene 1000，Merial Laboratories，西班牙塔拉戈纳；25–150 μg g−1）和赛拉嗪（Rompun 2%，Bayer；5–25 μg g−1）。2-苯氧乙醇（2-Phe）、乙醇（etOH）、丁香油（CO）和MS-222是通过水浴给予的（CO在4 mL etOH L−1水中预先稀释），而氯胺酮（Ket）和赛拉嗪（Xyl）则是通过肌肉注射（IM）给予的（通过关节膜进入血腔，位于胸部后面的第三个隔膜后面），注射剂量为每克体重1.5 μL（根据该物种血淋巴中观察到的Na+和Cl−浓度进行稀释，以达到每种情况下的适当浓度）。需要注意的是，与通过水浴给予麻醉剂的组相比，注射过程可能会引起生理应激反应。每种浓度下测试了一到六只动物（当未达到麻醉的第四阶段或恢复未完成时，每种浓度只使用一只动物）。根据这些分析，我们使用以下麻醉剂及其括号中指示的浓度/剂量进行了详细研究（每种浓度使用8只小龙虾）：丁香油（0.25、0.5、1.5和4 mL L−1）、氯胺酮（25、50、75和100 μg g−1）和赛拉嗪（5、10、15和20 μg g−1）。

2.5. 麻醉的实验条件
根据之前的试验结果，选择用于进一步研究的浓度和剂量为：0.5 mL CO L−1、50 μg Ket g−1和15 μg Xyl g−1。小龙虾（禁食24小时）分别用CO、Ket和Xyl进行麻醉（每个实验组10–12只个体），并添加了一个假对照组（IM注射0.74% NaCl盐水，剂量为每克体重1.5 μL；该组未接受麻醉，用于确定由于动物处理和注射引起的反应）。达到深度麻醉后，将动物放回装有清洁水的个体水箱中恢复，或者将它们放入呼吸室中评估5小时的氧气消耗率，这段时间足以让它们适应环境，正如在分析这种物种的日氧气消耗节律时观察到的那样（Herrera-Castillo等人，2024年）。

2.6. 代谢率
通过间歇流式呼吸测量法（Loligo Systems，丹麦维堡）测量了单个小龙虾的氧气消耗率（MO2）（Herrera-Castillo等人，2024年）。呼吸室的体积为362.29 mL，内部水流速为300 L h−1，由两个交替的水泵通过继电器控制。氧气传感器和温度探头连接到Witrox-4模块上，并使用AutoResp™软件进行数据采集（Loligo Systems）。MO2的数据分析周期为3分钟，其中包含80秒的测量时间和100秒的水清洗时间。从动物达到深度麻醉状态（第四阶段）到开始收集MO2数据所需的时间为8分钟，因此理论上所有动物都达到了恢复的第五阶段，除了氯胺酮组。动物禁食24小时，呼吸分析从10:00开始。还包括了一个未受干扰的对照组。考虑的最大代谢率是在将动物引入代谢室后处理过程中达到的最大值，而常规代谢率（RMR）则是在暗期或适应代谢室期间的平均MO2。

2.7. 生理应激和恢复反应
为了分析对不同麻醉剂的生理恢复过程，每组12只动物被麻醉（时间在12:30到14:30之间），并允许它们恢复一小时，具体方法如下文的行为反应部分所述。除了假对照组（IM注射氯胺酮或赛拉嗪的盐水载体）外，还增加了两个额外的对照组：一个在采样前没有暴露于任何应激条件的对照组，以及一个暴露在空气中5分钟后再放回水中一小时以诱导急性应激反应的对照组。采样是通过手工捕捉动物并将它们包裹在湿布中完成的。从第二对左螯肢中提取血淋巴并放入试管中（未使用任何抗凝剂或其他物质处理），然后通过斩首杀死动物。整个过程每只动物不超过六秒。取出胸肌并放入预先称重的试管中。离心后（5000 g，3分钟，21.5°C）立即使用迷你电极（HI1083B，Hanna Instruments，美国罗德岛州Woonsocket）测量血浆pH值，并收集15 μL样本，使用红外气体分析仪（IRGA，S151，Qubit systems，加拿大安大略省金斯顿）立即分析总二氧化碳（TCO2）（Barragán-Méndez等人，2019年；Ruiz-Jarabo等人，2020年）。血淋巴在干冰中冷冻并保存在-80°C直到分析。使用商业试剂盒测量血浆中的Na+、Cl−、K+、Ca2+、Mg2+、磷酸盐、乳酸、葡萄糖和蛋白质（钠参考编号1,001,387；氯化物参考编号1,001,360；钾参考编号1,001,397；钙参考编号1,001,061；镁参考编号1,001,285；磷酸盐参考编号1,001,155；乳酸参考编号1,001,330；葡萄糖-HK参考编号1,001,201；总蛋白质参考编号1,001,291，Spinreact SA，西班牙Sant Esteve de Bas）。使用15 μL样本重复测量血淋巴中的溶菌酶和过氧化物酶活性（Barragán-Méndez等人，2020年）。在无脊椎动物中，血蓝蛋白作为氧气转运蛋白，并参与先天防御机制（Barragán-Méndez等人，2020年；Barragán-Méndez等人，2019年），测量波长为344 nm，使用10 μL血淋巴稀释在200 μL MQ水中，并假设摩尔消光系数为17.26（mM，cm）和74 kDa的质量（Chen和Cheng，1993年）。所有测定都在96孔微孔板中进行，并使用SPECTROstar Nano分光光度计（BMG Labtech）和MARS数据分析软件（适用于Microsoft Windows）进行测量。肌肉水分含量是通过在75°C下干燥预先称重的肌肉直到重量恒定来分析的（Barragán-Méndez等人，2018年）。

2.8. 开放场行为测试
在开放场测试中评估了n = 12只小龙虾的类似焦虑的行为，基于触觉趋性（即对开放区域与水箱边缘的厌恶）的特性（Herrera-Castillo等人，2025年）。小龙虾在直径50厘米的圆形竞技场中单独测试，竞技场有不透明的黑色墙壁和白色底部，里面装有4.5厘米深的水。照明由竞技场上方的LED灯提供（与适应期间相同的白色和强度 - 550 lx）。设置了两个区域：墙壁区域（占总面积的25%，靠近墙壁）和开放的中央区域（占总面积的75%，位于水族箱的内部）。温度保持在21.5°C。实验方案如下：将单个不透明的水箱（每个水箱中有一只动物）转移到另一个房间，其中有一个开放场竞技场，并允许它们适应5分钟。随后，用0.5 mL CO L−1、50 μg Ket g−1或15 μg Xyl g−1对小龙虾进行麻醉，并包括一个假对照组（IM注射0.74% NaCl盐水，剂量为每克体重1.5 μL；该组未接受麻醉，用于确定由于动物处理和注射引起的反应）。达到深度麻醉后，将动物放回装有清洁水的个体水箱中恢复，或者将它们放入呼吸室中评估5小时的氧气消耗率，这段时间足以让它们适应环境，正如在分析这种物种的日氧气消耗节律时观察到的那样（Herrera-Castillo等人，2024年）。

2.6. 代谢率
通过间歇流式呼吸测量法（Loligo Systems，丹麦维堡）测量了单个小龙虾的氧气消耗率（MO2）（Herrera-Castillo等人，2024年）。呼吸室的体积为362.29 mL，内部水流速为300 L h−1，由两个交替的水泵通过继电器控制。氧气传感器和温度探头连接到Witrox-4模块上，并使用AutoResp™软件进行数据采集（Loligo Systems）。MO2的分析周期为3分钟，包括80秒的测量时间和100秒的水清洗时间。从动物达到深度麻醉状态（第四阶段）到开始收集MO2数据所需的时间为8分钟，因此理论上所有动物都达到了恢复的第五阶段，除了氯胺酮组的动物。动物禁食24小时，呼吸分析从10:00开始。还包括了一个未受干扰的对照组。考虑的最大代谢率是在将动物引入代谢室后处理过程中达到的最大值，而常规代谢率（RMR）则描述为在暗期或适应代谢室期间的平均MO2。

2.7. 生理应激和恢复反应
为了分析对不同麻醉剂的生理恢复过程，每组12只动物被麻醉（时间在12:30到14:30之间），并允许它们恢复一小时，具体方法如下文的行为反应部分所述。除了假对照组（IM注射氯胺酮或赛拉嗪的盐水载体）外，还增加了Ket、Xyl和CO组，以及两个额外的对照组：一个在采样前没有暴露于任何应激条件的对照组，以及一个暴露在空气中5分钟后再放回水中一小时以诱导急性应激反应的对照组。采样是通过手工捕捉动物并将它们包裹在湿布中完成的。从第二对左螯肢中提取血淋巴并放入试管中（未使用任何抗凝剂或其他物质处理），然后通过斩首杀死动物。整个过程每只动物不超过六秒。取出胸肌并放入预先称重的试管中。离心后（5000 g，3分钟，21.5°C）立即使用迷你电极（HI1083B，Hanna Instruments，美国罗德岛州Woonsocket）测量血浆pH值，并收集15 μL样本，使用红外气体分析仪（IRGA，S151，Qubit systems，加拿大安大略省金斯顿）立即分析总二氧化碳（TCO2）（Barragán-Méndez等人，2019年；Ruiz-Jarabo等人，2020年）。血淋巴在干冰中冷冻并保存在-80°C直到分析。使用商业试剂盒测量血浆中的Na+、Cl−、K+、Ca2+、Mg2+、磷酸盐、乳酸、葡萄糖和蛋白质（钠参考编号1,001,387；氯化物参考编号1,001,360；钾参考编号1,001,397；钙参考编号1,001,061；镁参考编号1,001,285；磷酸盐参考编号1,001,155；乳酸参考编号1,001,330；葡萄糖-HK参考编号1,001,201；总蛋白质参考编号1,001,291，Spinreact SA，西班牙Sant Esteve de Bas）。使用15 μL样本重复测量血淋巴中的溶菌酶和过氧化物酶活性（Barragán-Méndez等人，2020年）。血蓝蛋白在无脊椎动物中作为氧气转运蛋白，并参与先天防御机制（Barragán-Méndez等人，2020年；Barragán-Méndez等人，2019年），在344 nm波长下测量，使用10 μL血淋巴稀释在200 μL MQ水中，并假设摩尔消光系数为17.26（mM，cm）和74 kDa的质量（Chen和Cheng，1993年）。所有测定都在96孔微孔板中进行，并使用SPECTROstar Nano分光光度计（BMG Labtech）和MARS数据分析软件（适用于Microsoft Windows）进行测量。肌肉水分含量是通过在75°C下干燥预先称重的肌肉直到重量恒定来分析的（Barragán-Méndez等人，2018年）。

2.8. 开放场行为测试
在开放场测试中评估了n = 12只小龙虾的类似焦虑的行为，基于触觉趋性（即对开放区域与水箱边缘的厌恶）的特性（Herrera-Castillo等人，2025年）。小龙虾在直径50厘米的圆形竞技场中单独测试，竞技场有不透明的黑色墙壁和白色底部，里面装有4.5厘米深的水。照明由竞技场上方的LED灯提供（与适应期间相同的白色和强度 - 550 lx）。设置了两个区域：墙壁区域（占总面积的25%，靠近墙壁）和开放的中央区域（占总面积的75%，位于水族箱的内部）。温度保持在21.5°C。实验方案如下：将单个不透明的水箱（每个水箱中有一只动物）转移到另一个房间，其中有一个开放场竞技场，并允许它们适应5分钟。随后，用0.5 mL CO L−1、50 μg Ket g−1或15 μg Xyl g−1对小龙虾进行麻醉，并包括两个对照组，一个未受干扰的对照组和一个假对照组（IM注射0.74% NaCl盐水），并允许它们在同一个体水箱中恢复一小时。选择1小时的恢复期是因为在这一时间段内观察到这种物种的血淋巴受到最大的生理影响（来自本研究中进行的空气暴露测试的结果）。恢复1小时后，将小龙虾放入靠近墙壁的同一位置的水箱中。使用位于水箱上方的摄像机记录小龙虾的运动情况，持续20分钟。视频使用Noldus（荷兰瓦赫宁根）的EthoVision XT17软件进行分析。评估的参数包括总距离、平均速度、在墙壁附近的时间（触觉趋性）和在中央区域的时间、进入中央区域的延迟次数。

2.9. 统计学
使用Shapiro–Wilk检验和Levene检验分别分析数据的正态性和方差齐性，必要时对数据进行对数转换以满足ANOVA的要求。使用单因素ANOVA测试组间差异（用于评估麻醉诱导和恢复时间），组别（对照组、应激组、假对照组、丁香油组、氯胺酮组或赛拉嗪组）或时间（0、30、60或120分钟，用于急性应激试验）作为方差因素（取决于实验）。根据之前的研究（Herrera-Castillo等人，2024年），评估了将动物引入呼吸室后急性应激对代谢率随时间的影响。在这种情况下，使用双向重复测量ANOVA测试组间MO2的差异，以小时（81次记录，间隔3分钟）和天（在室内的第一天与第二天）作为within-subject因素。使用Tukey的事后检验来识别显著不同的组。统计显著性接受标准为p < 0.05。所有结果以平均值±标准误差（SEM）表示。使用Cosinor Online（Molcan，2019）来确定代谢率是否存在日周期性。数据调整为正弦函数：Y = M + A x cos (t x π/12 - ɸ)，其中M是节律的平均值（mesor），A是振幅（mesor与最大值之间的差异），t是时间，ɸ是达到最大值的时间。Cosinor分析的显著性由振幅零检验定义（Molcan，2019）。使用Student's t检验评估白天和夜晚之间的运动活动差异。

3. 结果
3.1. 日常运动活动和代谢率的节律
P. clarkii的7天运动活动在补充文件1的actogram中显示。在12 L:12D光周期下饲养并在10:00进食的小龙虾在暗期（19:00–07:00）的活动是光期（07:00–19:00）的三倍（补充文件1 A，B）。这种明暗变化与显著的日活动节律相关（T = 24.08 h；补充文件1C），其顶峰大约在02:00。代谢率（以氧气消耗量衡量）显示出日变化，在暗期开始时较高，随后在光期开始时达到第二个峰值（图1）。第二天的MO2的cosinor分析显示了显著的昼夜节律（p < 0.0001），其参数如下：mesor（84.74 mg O2 kg−1 h−1），振幅（13.00 mg O2 kg−1 h−1），周期（23.62 h），以及顶峰（在黄昏时，18:36 h）。运动活动和代谢率的日节律共同证实了P. clarkii主要表现出黄昏-夜间行为。

下载：下载高分辨率图像（158KB）
下载：下载全尺寸图像
图1. 在5分钟空气暴露后，P. clarkii前48小时的代谢率（MO2）作为O2消耗量测量。结果显示为前24小时（第1天，黑点）和后24小时（第2天，白点）。图中的深色区域对应于暗期。正弦灰色线代表第二天的cosinor波。数据以平均值（n = 24）表示。
双向重复测量ANOVA显示了日对MO2的显著主效应（F (1,23) = 143.45，p < 0.001），第一天的MO2与第二天的MO2有明显差异。同样，也发现了时间的主效应（F (80, 1840) = 8.72，p < 0.001），表明MO2有明显的时间节律。此外，还观察到了高度显著的日×时间交互作用（F (80, 1840) = 12.12，p < 0.001）。在第一天开始时，观察到明显的应激诱导的代谢升高，显著超过了第二天同一时间点记录的基础代谢率。第一天的恢复阶段在最初的90-120分钟内呈指数衰减，之后稳定在与第二天相同的水平。自动照明系统的开关非常突然，似乎对代谢率（MO2）有影响。为此，我们测量了每次照明变化前后每只动物平均30分钟的数据，并计算了两天的平均值。随后，从变化后的值中减去了变化前的值。在这方面，关灯的行为导致MO2显著增加13.8 ± 3.4 mg O2 kg−1 h−1（比变化前增加了24 ± 5%），而早晨开灯则导致MO2显著增加约36.6 ± 3.4 mg O2 kg−1 h−1（是开灯前的两倍）。

3.2 急性应激后的时间进程
在经历如暴露于空气5分钟这样的急性应激后，P. clarkii的血淋巴中出现了次级应激反应（见图2）。pH值从7.78 ± 0.04下降到1小时时的最低值（达到7.40 ± 0.03），并在2小时后保持这种酸性状态（F (3, 16) = 23.51, p < 0.001, partial η2p = 0.815）。乳酸在暴露后0.5小时和1小时显著增加（F (3, 16) = 4.74, p < 0.015, partial η2p = 0.471）。氯化物（F (3, 16) = 2.01, p = 0.153, partial η2p = 0.274）和血蓝蛋白（F (3, 16) = 5.34, p = 0.010, partial η2p = 0.500）的反应相似，在30分钟时有所下降（与0小时相比没有显著差异），并在暴露于空气1小时后达到最低水平（分别达到112 mM Cl−和23 mg mL−1的血蓝蛋白）。此后，在2小时后观察到乳酸、氯化物和血蓝蛋白的浓度恢复到初始水平。血淋巴中的葡萄糖浓度在整个测试期间没有变化，平均值为2.47 ± 0.14 mM（数据未显示；F (3, 16) = 0.69, p = 0.574, partial η2p = 0.114）。

下载：下载高分辨率图片（294KB）
下载：下载全尺寸图片

图2. P. clarkii暴露于空气后血淋巴中pH（A）、乳酸（B）、氯化物（C）和血蓝蛋白（D）的时间进程。每个条形代表平均值±标准误差（n = 5）。不同的字母表示组间有显著差异（单因素方差分析后进行事后Tukey检验，p < 0.05）。

3.3 麻醉剂的特性
暴露于5–40 mL etOH L−1、0.5–16 mL 2-phe L−1或50–1000 mg MS-222 L−1长达60分钟并未在P. clarkii中引起深度麻醉。CO、Ket和Xyl的使用根据其浓度/剂量达到IV期麻醉和V期恢复的时间模式不同（见图3）。达到所有麻醉和恢复阶段的时间以及统计数据见补充文件2和3。较高的CO浓度缩短了深度麻醉（IV期）的时间，而恢复时间（V期）则延长。较高剂量的氯胺酮导致完全麻醉和恢复的时间延长，而150 μg Ket g−1的剂量使动物在IV期麻醉后无法恢复（因为它们在测试后5小时内没有恢复正常行为，必须被安乐死）。只有10–20 μg Xyl g−1的剂量引起了IV期麻醉，且恢复时间最短。1.0和0.5 mL CO L−1的剂量在麻醉或恢复时间上没有显著差异，分别达到IV期麻醉的时间为2:55分钟和4:30分钟，恢复时间分别为17:30分钟和9:33分钟。因此，选择0.5 mL CO L−1作为进一步分析的浓度，因为它允许快速恢复，同时所需的CO量最小。选定的氯胺酮剂量为50 μg g−1，因为它达到IV期麻醉所需的时间最短（0:44 ± 0:13分钟），尽管其恢复时间也比25 μg Ket g−1（7:45 ± 2:28分钟）长。最佳剂量的赛拉嗪为15 μg Xyl g−1，因为P. clarkii在所有测试剂量中达到IV期麻醉的时间最短（1:05 ± 0:05分钟），同时恢复时间也最短。

下载：下载高分辨率图片（144KB）
下载：下载全尺寸图片

图3. P. clarkii暴露于丁香油、氯胺酮和赛拉嗪后达到IV期麻醉（黑色条形）和达到V期恢复（灰色条形）的时间。每个条形代表平均值±标准误差（n = 8）。不同的大写或小写字母分别表示麻醉或恢复期间组间有显著差异（单因素方差分析后进行事后Tukey检验，p < 0.05）。

3.4 恢复期间的氧气消耗率
所有动物在麻醉后15分钟，氧气消耗（MO2）显著高于基础水平（所有组的值约为101.3 ± 4.3 mg O2 kg−1 h−1，平均值达到219.5 ± 5.6 mg O2 kg−1 h−1；F (4, 49) = 4.721, p = 0.0026）。然而，这种增加在暴露于氯胺酮的龙虾中不那么明显（156.7 ± 7.5 mg O2 kg−1 h−1）。所有组在麻醉后60–150分钟内恢复到基础代谢率（RMR），达到101.3 ± 4.3 mg O2 kg−1 h−1（F (4, 41) = 0.0820, p = 0.9875）。

下载：下载高分辨率图片（336KB）
下载：下载全尺寸图片

图4. （A）暴露于0.5 mL丁香油 L−1、50 μg氯胺酮 g−1和15 μg赛拉嗪 g−1后5小时内的代谢率（MO2）与对照组（肌肉注射1.5 μL 0.74% NaCl盐水 g−1）和对照组（未受干扰的组）进行比较。每条彩色线代表每组的平均值。（B）此期间达到的最大MO2。每个条形代表平均值±标准误差（n = 10）。不同的字母表示组间有显著差异（单因素方差分析后进行事后Tukey检验，p < 0.05）。

3.5 血淋巴中的生理应激反应
图5和补充文件4及5显示了P. clarkii暴露于不同麻醉剂1小时后的血淋巴变化，与两个对照组（一个未受干扰的组和一个注射了药物载体的对照组，随后恢复1小时）以及一个暴露于急性应激的龙虾组（暴露于空气中5分钟，随后恢复1小时）进行了比较。暴露于空气的组在酸碱平衡方面表现出显著变化，pH值、总二氧化碳（TCO2）和磷酸盐的值显著低于对照组和实验组。因此，对照组的pH值为7.78 ± 0.03，而暴露于空气1小时后的pH值为7.39 ± 0.03。暴露于空气1小时后的TCO2浓度也较低（3.7 ± 0.4 mM），而对照组为6.1 ± 0.5 mM。磷酸盐水平在暴露于空气的组中达到0.41 ± 0.02 mM，显著低于对照组（0.49 ± 0.02 mM）。在能量管理方面，各组之间的葡萄糖浓度（平均值为2.59 ± 0.15 mm）或总蛋白质水平（平均值为3.14 ± 0.19 g dL−1）没有差异。然而，暴露于空气（应激）并用赛拉嗪处理的组在挑战后1小时的乳酸水平显著增加（分别为2.9 ± 0.6 mM和2.4 ± 0.6 mM），而其他组的范围为0.6 ± 0.1至1.1 ± 0.2 mM。实验组还显示出渗透压失衡。因此，氯胺酮处理的龙虾肌肉中的水分含量在麻醉后1小时为83.5 ± 0.3%，显著高于其他组（平均值为81.9 ± 0.4%），除了暴露于空气的组，其肌肉水分含量为中等（82.6 ± 0.4%）。血淋巴中的钠含量在氯胺酮组中也显示出显著差异，从对照组的121.5 ± 13.4 mM显著降低到86.1 ± 12.5 mM，但与丁香油组（114.4 ± 10.5 mM）没有差异。氯化物的浓度在暴露于空气（应激）的龙虾中显著低于其他组，但与氯胺酮处理组相当。血淋巴中的钙（5.19 ± 0.02 mM）、镁（1.95 ± 0.12 mM）和钾（3.77 ± 0.14 mM）浓度在各组之间没有显著差异。就先天免疫系统反应而言，溶菌酶活性在氯胺酮处理的龙虾中最高，赛拉嗪处理的动物略低，而在所有其他组中最低。空气暴露诱导了最高的过氧化物酶活性（达到约33.6 U mL−1），而所有其他组约为17.4至24.0 U mL−1，但丁香油组显示中等值。血蓝蛋白作为该物种中的prophenoloxidase，在暴露于空气和赛拉嗪处理的龙虾中浓度降低，而在暴露于氯胺酮的组中浓度中等。

下载：下载高分辨率图片（414KB）
下载：下载全尺寸图片

图5. P. clarkii暴露于不同麻醉剂（0.5 mL L−1丁香油-CO、50 μg g−1氯胺酮-Ket或15 μg g−1赛拉嗪-Xyl）1小时后的血淋巴参数，以及暴露于空气5分钟（Air）或肌肉注射载体（Sham）的对照组-未暴露组（Ctrl）的结果。A）pH值；B）乳酸；C）血蓝蛋白；D）溶菌酶活性；E）钠；F）肌肉水分含量。每个条形代表平均值±标准误差（n = 12）。不同的字母表示组间有显著差异（单因素方差分析后进行事后Tukey检验，p < 0.05）。

3.6 开放场地测试
开放场地测试中的行为反应表明氯胺酮和赛拉嗪处理导致了变化（见图6）。在麻醉后1小时，氯胺酮在测试剂量下导致行进距离（比对照组减少73%）和平均速度（比对照组减少68%，数据未显示）显著下降。赛拉嗪显著减少了在墙壁附近探索区域的时间（触角趋性）（F (3, 53) = 3.10, p < 0.05, η2p = 0.149）。此外，15 μg g−1赛拉嗪导致进入开放区域的次数显著增加（比其他处理多8 ± 2倍）。所有组到达中心的潜伏时间相似（平均为53 ± 9秒）。统计分析见补充文件6。

下载：下载高分辨率图片（175KB）
下载：下载全尺寸图片

图6. P. clarkii暴露于不同麻醉剂（0.5 mL L−1丁香油-CO、50 μg g−1氯胺酮-Ket或15 μg g−1赛拉嗪-Xyl）1小时后的开放场地结果，以及对照组-未受干扰组和注射了药物载体的对照组（Sham）。A）行进距离；B）触角趋性率（在边缘区域花费的时间百分比）。每个条形代表平均值±标准误差（n = 9–12）。不同的字母表示组间有显著差异（单因素方差分析后进行事后Tukey检验，p < 0.05）。

4. 讨论
本研究的发现表明，丁香油、氯胺酮和赛拉嗪在P. clarkii中具有麻醉潜力。从生理学角度来看，氯胺酮和赛拉嗪都会引起有害影响并改变恢复期间的行为模式。相比之下，丁香油被认为是最有效和最安全的选择。这一结论得到了能量代谢、酸碱平衡、渗透调节、免疫功能和类似焦虑行为的评估的支持，提供了对麻醉生理和行为反应的全面评估。

4.1 对压力的短期反应
这项研究的基础部分涉及表征P. clarkii对急性压力源（如短暂暴露于空气或突然的光线变化）的生理反应。光线变化不是研究的重点，因此应谨慎解释结果，因为有许多变量可能影响动物的反应，而这些变量在这里没有进行评估（例如光线的强度、质量或持续时间）。尽管有这些担忧，但上述压力源已被证明会诱导代谢活动的增加，这在水生动物中是典型的。我们的发现与之前关于甲壳类动物和鱼类的研究结果一致（Herrera-Castillo等人，2024年；Jensen等人，2013年；Raicevich等人，2014年），表明在压力后的前30分钟内氧气消耗达到峰值，伴随葡萄糖的动员和乳酸的积累。在P. clarkii中，暴露于空气改变了四个关键的稳态系统：能量管理、酸碱平衡、渗透调节和免疫功能。具体来说，能量管理的变化包括氧气需求的增加和乳酸水平的升高，表明发生了无氧代谢。酸碱失衡表现为血淋巴酸化，而渗透调节紊乱则表现为氯化物水平的降低，反映了离子失衡。一些免疫反应参数也有所下降，如血蓝蛋白浓度降低。最显著的变化发生在压力后约1小时，两小时后出现恢复迹象。这些反应与其他甲壳类动物（如Nephrops norvegicus和Squilla mantis（Barragán-Méndez等人，2020年）相似。鉴于这些动态，研究选择了压力后1小时的时间点来评估麻醉剂的效果，以捕捉最大的生理偏离稳态的情况。

4.2**麻醉剂的选择**

理想的麻醉剂量需要在快速诱导和恢复与最小的生理干扰之间取得平衡（Wilson等人，2021年）。与硬骨鱼类不同，硬骨鱼类已经建立了特定的应激反应潜伏阈值（Ross和Ross，2008年），而甲壳类动物直到最近才有了这样的标准化标准，当时为Penaeus vannamei开发了一种方法（Lorenzo等人，2025年）。因此，剂量选择基于实际标准，如第2.4节（麻醉诱导和恢复时间）所描述的那样。0.5 mL L^-1的丁香油浓度可以在5分钟内实现诱导，并且显示出所有测试浓度中最短的恢复时间（大约9分钟）。这一丁香油浓度与之前关于小龙虾和螃蟹的研究结果一致（Valente，2022年），被认为可以最小化应激持续时间。选定的赛拉嗪剂量为15 μg g^-1，因为它能快速诱导麻醉（<1分钟）并且恢复期最短（<10分钟）。对于螃蟹来说，剂量取决于物种，其快速反应表明它适用于需要快速恢复的手术（Valente，2022年）。还需要进一步研究其对小龙虾神经系统和外周组织生理反应的影响。关于氯胺酮，尽管25 μg g^-1的剂量具有较短的诱导和恢复时间（分别为1分钟和8分钟），与其他两种测试的麻醉剂（0.5 mL L^-1丁香油和15 μg g^-1赛拉嗪）相似，但我们选择了50 μg g^-1。原因是它在所有剂量中达到深度麻醉所需的时间最短（44秒），并且在10分钟后才显示出初步恢复的迹象（远远超过其他麻醉剂和剂量），完全恢复则需要30分钟。这些较长的恢复时间可能对长时间手术有用，正如在大鼠中的研究所示（Linsenmeier等人，2020年）。由于关于小龙虾的先前研究有限，这些发现为未来研究氯胺酮的中长期效应提供了基础（Valente，2022年）。

**4.3 恢复阶段的能量管理和氧气需求**

监测恢复期间的MO2（代谢率）发现，三种麻醉剂导致的恢复情况相似，但氯胺酮引起的最大MO2显著较低，表明有残留的镇静作用。由于很少有研究探讨这类麻醉化合物如何影响甲壳类动物的能量管理，大多数比较不得不依赖于其他水生生物类的研究结果，例如鱼类。尽管如此，人们对甲壳类动物麻醉反应的兴趣日益增加，这开始填补了这一知识空白，并为我们的理解提供了宝贵的基础。因此，在麻醉结束时观察到的氧气消耗可能反映了恢复期间的迷失方向或过度活跃，正如在大西洋鲟鱼暴露于MS-222时所报告的（Matsche，2011年），或者由于麻醉期间的呼吸减慢而导致的氧气需求增加，如斑点隆头鱼所描述的（Hill和Forster，2004年）。在金鱼中也观察到了类似的反应，丁香油、MS-222和2-苯氧乙醇并未阻止MO2的初始上升（Herrera-Castillo等人，2024年）。在甲壳类动物中，使用2-苯氧乙醇和丁香油恢复时，与刺龙虾相关的迷失方向和运动活动增加，延长了恢复时间并增加了MO2消耗（Jensen等人，2013年）。同样，在Gammarus pulex中，MS-222在长时间暴露和恢复后使MO2升高（Perrot-Minnot等人，2021年）。综合这些发现表明，恢复期间的氧气消耗变化与运动活动的改变密切相关，并可能影响对有害刺激的反应恢复时间。值得注意的是，血淋巴中的葡萄糖水平在各处理组之间没有显著波动，表明动员和利用是平衡的，这与N. norvegicus的研究结果一致（Barragán-Méndez等人，2020年）。有趣的是，赛拉嗪显著提高了乳酸浓度，表明有应激反应，从而质疑其作为小龙虾麻醉剂的适用性。乳酸水平升高表明由应激引起的无氧代谢（Conneely和Coates，2024年），类似的代谢紊乱也在其他甲壳类动物中有所记录（Barragán-Méndez等人，2020年）。尽管这项研究只检查了一部分代谢指标，但更全面的方法（如循环代谢组学分析）将是可取的，结果强调了选择最小化动物应激的麻醉剂的重要性。

**4.4 渗透调节紊乱**

暴露于空气中会导致P. clarkii的酸碱平衡显著紊乱，包括血淋巴酸化。有趣的是，除了氯胺酮外，其他测试的麻醉剂并未引起进一步的酸碱紊乱，这表明它们不会加剧这种应激反应。在这方面，接受氯胺酮处理的小龙虾表现出明显的渗透调节问题：肌肉水分含量增加和血淋巴中的钠含量降低（低钠血症）。这种情况可能与应激引起的鳃通透性增加有关（Freire等人，2008年），导致水分和离子的被动进入。像淡水这样的低渗环境中，甲壳类动物在急性应激后特别容易发生渗透失衡，因为鳃通透性的增加允许水分和离子的被动进入（Garcon等人，2021年）。十足类动物具有维持离子稳态的膜，但它们调节组织水分的能力各不相同（Foster等人，2010年）。P. clarkii能够适应盐度波动，这可能解释了为什么在采样时这些渗透紊乱并不明显。尽管如此，还需要进一步研究以确定这些中期失衡是否对小龙虾的福利有显著影响，或者它们是否会随时间自行解决。

**4.5 免疫系统紊乱**

P. clarkii的免疫反应受到麻醉和应激的影响。甲壳类动物具有发达的免疫系统，使它们能够应对外部威胁（Calderon-Rosete等人，2018年）。值得注意的是，接受氯胺酮处理的小龙虾的溶菌酶活性增加，表明对潜在入侵者或凝血过程的免疫激活。这可以与S. mantis在急性应激情况下描述的溶菌酶变化相比较，以及应对氧化应激产生的自由基的需求（Barragán-Méndez等人，2020年）。另一方面，赛拉嗪和暴露于空气中降低了P. clarkii的血蓝蛋白水平（当前结果），血蓝蛋白在应激期间具有类似酚氧化酶的免疫功能（Adachi等人，2003年；Barragán-Méndez等人，2020年）。此外，本研究中暴露于空气时过氧化物酶活性增加，反映了氧化应激的增加和通过吞噬作用激活的免疫系统（Barragán-Méndez等人，2020年）。这些不同的免疫反应突显了甲壳类动物在应激和麻醉过程中涉及的复杂机制，并强调了理解其免疫反应对于改善动物福利的重要性。

**4.6 类似焦虑的行为**

通过开放场地测试评估的类似焦虑的行为显示，所有小龙虾组无论接受何种处理，都表现出触觉趋性，即在测试场地墙壁附近花费更多时间，这证实了逃避行为在动物系统发育中的高度保守性（Belzung和Philippot，2007年）。这种持续的外围探索可能反映了天生的避难策略，而靠近垂直表面可以提供对潜在威胁的感知保护，如在P. clarkii处于应激或环境新奇条件下观察到的（Antonelli等人，1999年；Su等人，2024年）。研究发现，氯胺酮在麻醉后长达一小时仍影响小龙虾的活动能力，可能是由于恢复缓慢和残留的镇静作用，使动物显得迷糊。之前对暴露于高碳酸血症或乙醇的P. clarkii的研究显示了运动和隐藏行为的改变（Gutierrez等人，2022年；Robertson等人，2018年），表明行为测量是有效的非侵入性应激和恢复指标。有趣的是，赛拉嗪减少了类似焦虑的行为，小龙虾在墙壁附近花费的时间减少，使自己暴露于潜在威胁中。这种反应在甲壳类动物中尚未报道过，可能表明神经系统受到严重影响或恢复延迟。这些发现表明，麻醉剂不仅影响焦虑，还影响行为反应，这对福利考虑至关重要。

**4.7 更广泛的影响**

这项研究通过结合生理和行为标志物，填补了十足类动物麻醉方面的一个关键空白，对福利和水产养殖具有重要意义。麻醉可以减少应激，限制痛苦，并在处理、运输和实验使用期间提高存活率。即使不能完全解决甲壳类动物的感知能力问题，最小化应激和异常行为也有助于健康、可持续性和福利。随着水产养殖的全球增长和公众关注的增加，这个问题变得尤为紧迫。然而，十足类动物的麻醉并不是一种适用于所有情况的解决方案，因为生理和行为反应需要特定物种的方案和剂量优化。进一步的研究应评估其对痛觉、长期生理和可测量福利结果的影响。最终，改进麻醉方法是科学和伦理上的优先事项，有利于水产养殖、研究和更广泛的无脊椎动物福利讨论。

**4.8 结论**

由于丁香油具有快速诱导、快速恢复以及在恢复阶段最小的生理干扰，建议将其作为P. clarkii的首选麻醉剂。其有效性表明它适用于常规程序和短期麻醉。对于较长的手术，使用氯胺酮需要进一步研究，特别是其中期和长期效应。相反，考虑到观察到的渗透调节和免疫紊乱，不建议使用赛拉嗪、MS-222、2-苯氧乙醇和乙醇。这项研究还为定义麻醉阶段（包括诱导和恢复）提供了一个框架，可以适应其他甲壳类动物物种。这些发现对于未来旨在改进麻醉方案和确保十足类动物在科学、商业和管理背景下的福利的研究具有重要意义。

**作者贡献**

IRJ、LHC、EI、MJD和NdP设计了实验项目。IRJ、LHC、DM、NS负责动物维护和分析。IRJ、LHC和NdP撰写了手稿。所有作者都对手稿进行了修订。

**关于生成式AI使用的声明**

AI已被用于审查基本语法和提高手稿的可读性（DeepL和ChatGPT）。所有文本都经过了作者的仔细审查。

**作者贡献声明**

I. Ruiz-Jarabo：写作——审阅与编辑，写作——初稿，方法学，调查，资金获取，形式分析，数据管理，概念化。L. Herrera-Castillo：写作——审阅与编辑，写作——初稿，方法学，调查，形式分析，数据管理，概念化。D. Madera：写作——审阅与编辑，方法学，调查，形式分析，数据管理。N. Saiz：写作——审阅与编辑，方法学，调查，形式分析，数据管理。E. Isorna：写作——审阅与编辑，方法学，调查，资金获取，概念化。M.J. Delgado：写作——审阅与编辑，可视化，监督，项目管理，资金获取，概念化。N. de Pedro：写作——审阅与编辑，写作——初稿，可视化，监督，项目管理，方法学，调查，资金获取，概念化。

**资助**

这项工作部分得到了“Ramón y Cajal”奖学金（RYC2021-032451-I）和项目PID2022-142638OA-100（MCIN/AEI/10.13039/50110011033/FEDER，UE）的支持，由西班牙科学与创新部资助；部分得到了欧盟的恢复、转型和韧性计划对IRJ的支持，以及西班牙科学与创新部通过项目PID2022-136288OB-C32（MCIN/AEI//10.13039/501100011033）对N.d.P.和E.I.的支持。L.H.C.是马德里康普顿斯大学（CT63/19-CT64/19）的博士前奖学金获得者。