土耳其一头初产荷斯坦奶牛因Candidatus Mycoplasma Haemobos感染而出现血红蛋白尿：病例报告

摘要
牛血孢子虫，包括Mycoplasma wenyonii（M. wenyonii）和Candidatus Mycoplasma haemobos（C. M. haemobos），是通过媒介传播的病原体，可导致牛出现严重的临床疾病。这篇来自土耳其的病例报告描述了一头因C. M. haemobos感染而出现血红蛋白尿的牛的临床表现、血液学分析和血清生化检测结果。从感染动物身上采集的血液样本通过血液学、生化、显微镜和分子方法进行了分析。多重聚合酶链反应（PCR）检测确认了感染，显微镜检查显示寄生虫感染率为6.99%。临床症状包括血红蛋白尿、黄疸和贫血。治疗措施包括补液疗法、抗生素（氧四环素）和抗贫血药物。该牛在治疗后一个月死亡，据报道死于下呼吸道感染。本文介绍了诊断方法、临床表现和实验室检测结果，建议对土耳其牛群中的C. M. haemobos进行大规模分子调查，以研究其致病性和发病机制。

引言
血孢子虫（嗜血支原体）是一类小型、多形性且无法培养的细菌，可寄生在家养和野生动物以及人类的红细胞中（Neimark等人，2001年；Kmetiuk等人，2025年）。这些病原体最初被归类为Eperythrozoon和Haemobartonella，但后来根据16S核糖体DNA（rDNA）序列的分子和系统发育分析被重新归类到Mycoplasma属（Su等人，2010年；Mucan和İkiz，2023年；Altay等人，2025年）。在牛血孢子虫中，Mycoplasma wenyonii（M. wenyonii）和Candidatus Mycoplasma haemobos（C. M. haemobos）是最常被报道的物种（Díaz-Sánchez等人，2019年；Nouvel等人，2019年）。这些病原体已在日本、菲律宾、莫桑比克、古巴、英国、巴西、法国和吉尔吉斯斯坦等地区的牛和水牛中被检测到，主要使用聚合酶链反应（PCR）和DNA测序技术（Tagawa等人，2008年；Ayling等人，2012年；Gonçalves等人，2018年；Díaz-Sánchez等人，2019年；Nouvel等人，2019年；Ybañez等人，2019年；Altay等人，2023年）。在土耳其，Erol等人（2023年）首次报道了牛群中M. wenyonii和C. M. haemobos的分子检测结果。迄今为止，这是该国唯一一项研究牛血孢子虫感染的分子流行病学的研究。该研究表明，31.64%（94/297）的牛感染了Mycoplasma spp.，表明其感染率相对较高。血孢子虫被认为通过吸血节肢动物（如蜱虫、跳蚤、苍蝇和蚊子）以及医源性途径或直接接触感染血液传播（Kim等人，2024年）。也有报道指出存在胎盘传播（Hornok等人，2011年）。血孢子虫感染通常表现为亚临床状态，但根据宿主和感染因素的不同，也可能引起显著的临床疾病。牛的临床症状包括溶血性贫血、发热、血红蛋白尿、淋巴结肿大、产奶量下降以及生殖障碍（如不孕症）（Kim等人，2024年）。此外，感染动物还表现出血液学变化，尤其是红细胞指标的变化。

尽管有越来越多的分子证据，但整合临床、血液学和生化结果的关于C. M. haemobos感染的全面报告仍然有限。由于这些病原体无法在无细胞培养基中培养，因此血孢子虫感染的诊断具有挑战性（Neimark等人，2001年）。虽然可以使用Giemsa或Romanowsky染色法区分血孢子虫和红细胞内含物（如Pappenheimer小体、Heinz小体和Howell–Jolly小体），但在慢性或低寄生虫感染情况下，这种区分往往较为困难（Kahn，2005年；Ritzmann等人，2009年）。因此，由于更高的敏感性和特异性，常规PCR、嵌套PCR、多重PCR和实时PCR等分子诊断方法被广泛采用（Khaki等人，2012年；Ybañez等人，2019年）。

病例描述
一头3岁的初产荷斯坦奶牛从土耳其锡瓦斯省扎拉地区被送往锡瓦斯共和国大学兽医学院内科诊所（图1）。该牛有一周的厌食、进食量减少和嗜睡症状，并在过去的2天内出现血红蛋白尿。

样本采集与分析
体检后，使用18号无菌针头从颈静脉无菌采集了5毫升血液样本。样本分为含有乙二胺四乙酸（EDTA）的试管和凝胶试管。血液学分析在30分钟内使用自动兽医血液分析仪（Mindray BC-5000，中国）完成。凝胶试管中的血液样本在室温（25°C）下静置30分钟凝固后，以3000转/分钟的速度离心10分钟以分离血清。血清储存在-80°C（Haier，中国）直至生化分析。生化参数使用自动分析仪（Roche Cobas 8000，日本）进行检测。初步分析后，剩余样本储存在-20°C以备基因组DNA提取。

显微镜检查
血液采集后立即进行显微镜检查。将一滴EDTA抗凝血液滴在干净的玻璃载玻片上并在室温下风干，制备薄血涂片。风干后的涂片用绝对甲醇固定5分钟，然后用Giemsa溶液（BESLAB，参考编号：BS-191）染色45分钟。染色后，用流水轻轻冲洗载玻片并风干。在1000倍放大倍数下使用油浸显微镜观察涂片。

基因组DNA提取
根据制造商的方案，使用商业试剂盒（PureLink Genomic DNA Kit，产品编号：K1820-02，Invitrogen，美国）从采集的抗凝血液样本中提取基因组DNA（gDNA）。提取过程中加入阳性对照（C. M. haemobos，GenBank登录号：OM468184）和阴性对照（无DNase和RNase的无菌水），以防止假阳性或假阴性结果。提取的样本储存在-20°C直至多重PCR分析。

媒介传播病原体的分子检测
提取的DNA样本通过PCR检测牛血孢子虫、Anaplasma spp.、Babesia spp.和Theileria spp.。所用引物列于表1。PCR反应按照Altay等人（2023年）的方案进行。针对16S rRNA基因的多重PCR检测用于同时识别和区分牛血孢子虫物种（M. wenyonii和C. M. haemobos）。而Anaplasma spp.、Babesia spp.和Theileria spp.则使用单独的常规（单重）PCR检测，采用特定病原体的引物和优化的退火温度。PCR扩增在含有无DNase和RNase的水（Qiagen®，德国）、10倍PCR缓冲液（Thermo Scientific™，立陶宛）、25 mM MgCl₂（Thermo Scientific™，立陶宛）、200 µM脱氧核苷三磷酸（dNTP；Thermo Scientific™，立陶宛）、1.25 U Taq DNA聚合酶（Thermo Scientific™，立陶宛）和3 µL模板DNA的25 µL反应体系中进行。热循环过程包括94°C初始变性5分钟，随后是35个循环：Mycoplasma和Anaplasma在94°C变性1分钟，Babesia和Theileria分别在59°C和56°C变性1分钟，最后在72°C延伸1分钟。每次PCR反应都加入阳性对照（M. wenyonii GenBank登录号OM468183；C. M. haemobos OM468184；Anaplasma capra ON763216；Babesia vogeli OR116199）和阴性对照，以防止假阳性或假阴性结果。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳60分钟，然后用溴化乙锭染色并在紫外透射仪下观察（Altay等人，2023年）。

结果
临床检查
体检（表2）显示嗜睡、厌食、抑郁和反射减弱。还存在血红蛋白尿。结膜、口腔和外阴的黏膜呈现苍白和黄疸（图2）。此外，还观察到呼吸困难和腹部呼吸异常（表2）。

血液学分析
血液学检测结果见表3（表3）。

生化分析
生化参数见表4（表4）。

显微镜检查
在1000倍放大倍数下用Giemsa染色观察血涂片时，发现红细胞表面有单个或成链的球形血孢子虫（图3）。未检测到其他媒介传播的血液病原体，如Babesia spp.、Theileria spp.或Anaplasma spp.。通过检查50个显微镜视野并计数总红细胞和感染红细胞来确定寄生虫感染率，结果为6.99%（图3）。

分子分析
从血液样本中提取gDNA，并使用PCR检测牛血孢子虫、Anaplasma spp.、Babesia spp.和Theileria spp.。根据多重PCR结果，该牛被诊断为C. M. haemobos感染（图4）。未检测到其他病原体。

治疗
治疗开始时给予静脉补液疗法（Polifleks Izolen平衡电解质溶液，Polifarma；5%葡萄糖，Polifarma；等渗盐水，Polifarma）以缓解脱水。为治疗Mycoplasma感染，肌肉注射长效氧四环素（Oxtra LA，Fatro）20 mg/kg。初次治疗3天后再次注射相同剂量的药物。同时给予抗贫血治疗，包括铁和维生素B12组合（Fercobsang和Vetoquinol）以治疗贫血。根据体检结果，该牛在20天内恢复到正常临床状态。然而，由于主人因临床症状改善（食欲恢复、反刍和体重增加）而拒绝重复血液学和生化检测，因此未能通过后续实验室检测确认完全康复。此外，该牛在治疗后一个月死亡，据主人称死于下呼吸道感染。

讨论
M. wenyonii和C. M. haemobos引起的血孢子虫感染已在世界各地的多种宿主中报道，包括牛、水牛和鹿（Ade等人，2018年；Díaz-Sánchez等人，2019年；Galon等人，2020年；Boularias等人，2020年）。然而，关于土耳其牛血孢子虫感染的数据仍然有限。先前的研究通过显微镜检查（Şaki和Özer，2009年）和基于PCR的检测（Aktaş和Özübek，2017年）报道了M. wenyonii的存在。最近的研究确认了M. wenyonii和C. M. haemobos在土耳其牛和水牛中的存在和流行情况（Erol等人，2023年）。因此，鉴定病原体并评估其临床意义非常重要。虽然血孢子虫感染通常为亚临床状态，但明显的临床疾病受宿主相关因素的强烈影响。年轻年龄、生理压力、并发疾病、脱水、免疫抑制和高寄生虫感染率是导致疾病表现的关键因素（Hoelzle等人，2011年；Merck Veterinary Manual，2024年）。在这种情况下，明显的溶血性贫血、严重脱水、代谢紊乱以及相对较高的寄生虫感染率（6.99%）可能促使疾病从典型的亚临床状态发展为临床明显的病症。这些发现表明，疾病的严重程度不仅取决于病原体的存在，还取决于宿主的生理状态。以往关于C. M. haemobos的研究在设计和临床背景上存在很大差异。在看似健康的牛群中进行的分子调查主要集中在寄生虫感染率上，提供的关于临床症状或寄生虫感染水平的数据非常有限（Niethammer等人2018年；Díaz-Sánchez等人2019年；Kim等人2024年）。相比之下，临床受影响动物的病例报告描述了贫血和血红蛋白尿的症状，但往往没有提供定量的寄生虫感染数据（Hofmann-Lehmann等人2004年；Hoelzle等人2011年；Tagawa等人2012年；McFadden等人2016年）。本案例通过结合临床发现与详细的血液学、生化学及定量寄生虫感染数据，为相关研究提供了新的见解，表明寄生虫负担可能影响疾病的严重程度。血孢子虫感染与贫血之间的关系仍存在争议：一些研究未发现显著关联（Niethammer等人2018年；Díaz-Sánchez等人2019年；Kim等人2024年），而另一些研究则观察到受感染动物的血液学变化。在本例中，红细胞（RBC）和血细胞比容的值明显低于以往报道的水平（分别为1.56×10⁶/µL和9.3%），这可能与较高的寄生虫感染率有关。此外，还观察到平均红细胞体积（MCV）和平均红细胞血红蛋白含量（MCH）的轻微变化，表明血孢子虫感染可能影响红细胞指标。研究之间的差异可能反映了贫血类型（再生性与非再生性）、宿主反应及感染严重程度的不同。生化学检查结果最符合肾前性氮质血症的特征，表现为血清尿素和肌酐水平升高，这提示肾功能下降，尤其是由于脱水和低血容量所致（Levey等人1988年；Rose 2011年）。严重的脱水、毛细血管充盈时间延长以及眼球凹陷强烈支持肾前性病因。此外，血管内溶血可能增加了氮代谢产物的生成，并干扰了生化指标的解读，进一步增加了评估的复杂性（De Scally等人2004年；Defauw等人2018年）。同时出现的低氯血症可能反映了摄入减少和体液分布改变，而非肾脏本身的功能障碍。严重的血管内溶血会导致游离血红蛋白释放到循环系统中；当肾脏的重吸收能力被超过时，就会出现血红蛋白尿（Rother等人2005年）。在本例中，血红蛋白尿、高胆红素血症和黄疸表明溶血仍在持续，而乳酸脱氢酶（LDH）水平的升高可能表明红细胞遭到破坏，因为该酶在红细胞中的浓度较高（Turgut 2000年）。尽管肌酸激酶（CK）是肌肉损伤的标志物，但溶血也可能导致检测结果异常升高。在没有肌病的情况下，本例中LDH和CK水平的升高更可能是由溶血引起的，而非原发性肌肉损伤。这些发现强调了在临床背景下解读生化结果的重要性。

本案例存在一些局限性：作为单一病例报告，其结果可能不具有普遍性。缺乏长期随访限制了对疾病进展和预后的评估；同时，由于缺乏健康个体或其他受感染个体的对比数据，也限制了对观察到的变化的解释。未进行尿液分析，从而无法全面评估肾功能。最后，由于缺乏群体层面的调查，无法评估潜在的环境或流行病学因素。

总之，本案例报告首次在土耳其展示了与C. M. haemobos感染相关的临床、血液学和生化学特征。虽然血孢子虫感染通常表现为亚临床状态，但高寄生虫感染率可能与严重的临床疾病相关，包括溶血性贫血、黄疸和血红蛋白尿。因此，在出现这些临床症状的牛只中，应将C. M. haemobos纳入鉴别诊断范围。