摘要
适应性特征的纬度梯度变化已有充分记录，但这种模式如何在不同的气候变异性较小的经度梯度上体现，目前仍知之甚少。我们研究了美国中西部九个城市中白三叶草（Trifolium repens）中氢氰酸（HCN）的空间变异——这是一种由两个独立分离的基因位点（Ac和Li）控制的、特征明确的抗食草动物防御多态性。共采集了269个种群（4,035个个体）的数据，并量化了氰化型（氰化作用表型）的频率，同时考虑了区域和站点级别的环境变量，包括植被覆盖度（NDVI）、地表温度（LST）、积雪覆盖、不透水表面强度、干旱程度和潜在蒸散量。尽管不同城市之间的氰化频率存在显著差异（6.2–19.0%），但最低冬季温度仅相差7.9°C，远低于大陆纬度梯度（21–35°C）。因此，氰化频率与环境预测因子之间没有一致的关系：模型选择支持零模型，且城市内部的关联方向也各不相同，表明区域效应无法在经度梯度上可预测地扩展。相比之下，对个别氰化型的分析揭示了特定基因位点的环境关联。站点级别的NDVI和LST与仅含linamarase的氰化型（acLi）相关，表明在温暖、植被较少的城市生境中该表型的频率较高。模型选择确定了个别氰化型的环境预测因子，但未能解释总HCN频率的变化。这些结果表明，该区域范围内的氰化作用与大规模气候驱动因素脱钩。相反，特定基因位点对异质环境的响应在氰化型之间产生了补偿性动态，掩盖了表型层面的模式。我们的发现强调了遗传结构在适应性多态性中的重要性，并支持细尺度的选择镶嵌体是进化动态的关键驱动因素。
引言
城市化是全球环境变化中最普遍且扩张最快的驱动因素之一。通过改变温度、水文、土壤化学和物种相互作用，城市对当地生物施加了新的、异质的选择压力（Winchell等人2016；Rivkin等人2019；Alberti等人2020）。由城市化驱动的生态变化有可能显著改变栖息在城市中的种群的进化动态（Caizergues等人2022；Cosenzino和Gibbs 2022；Diamond等人2022；Diamant等人2025）。越来越多的研究表明，城市化影响了多种生物的适应机制（如自然选择和性选择）和非适应过程（包括遗传漂变和基因流）（Johnson和Munshi-South 2017；Santangelo等人2022）。然而，目前尚不清楚对城市化的进化响应是否具有普遍性和一致性，或者是否取决于当地的气候和生态条件。
最近的大规模研究项目，如全球城市进化（GLUE）项目（globalurbanevolution.com），已经证明了协调的多城市方法在解决这一问题上的价值（Santangelo等人2022；Caizergues等人2024；Leandro等人2025）。GLUE框架为检测城市化进化响应的全球模式和局部差异提供了强大的比较基础，强调了生态学、基因组学和环境数据的整合。重要的是，GLUE项目指出，理解城市环境中的适应性进化直接有助于生物多样性保护，揭示了物种如何在人类主导的生态系统中存活、适应或衰退（Leandro等人2025）。基于这一视角，控制关键气候变量（如冬季温度）的区域尺度研究可以阐明非热因素（如水文压力或人为干扰）如何独立地塑造城市内的适应变异。尽管经度或海拔梯度的研究更为常见，但经度梯度也能捕捉到影响进化动态的有意义的环境和历史变化（Conord等人2012；Procheş等人2023）。Cowling等人（2017）指出，物种多样性的经度模式在生态上具有相关性，反映了干旱程度、生产力和干扰的变化，而非温度限制。这些研究强调了经度方法在分离非热适应驱动因素方面的价值，特别是在最低冬季温度（MWT）相对恒定的情况下。
先前关于多年生草本植物白三叶草（Trifolium repens L.）的研究表明，氰化多态性可以受到相互作用的选择压力的影响，包括干旱、霜冻和食草作用（Hughes 1991；Kooyers和Olsen 2014）。然而，这种多态性的选择基础并非普遍适用：一些研究发现选择作用有限或依赖于具体环境（Wright等人2018, 2022；Kuo等人2024），这表明氰化变异的维持可能反映了选择、遗传漂变和基因流之间的复杂相互作用，其相对重要性因地理环境而异。同时，GLUE项目的全球范围分析揭示了城市与农村之间氰化作用的地理广泛但依赖于环境的梯度变化（Santangelo等人2022）。在全球范围内，Santangelo等人（2022）在六大洲的160个城市中测试了白三叶草中氢氰酸（HCN）频率的平行城市-农村梯度，并报告了广泛但依赖于环境的平行性，将城市化视为城市级别的背景。在区域层面上，Santangelo等人（2020）在15个北美城市沿纬度梯度（MWT范围约为35°C）量化了城市-农村氰化作用梯度。本研究与该区域设计最为相似，但采样了九个城市沿经度轴，其中MWT仅相差7.9°C，且大部分位于零度以下的温度范围内，此时T. repens的HCN产生量较小（Fadoul等人2023）。我们在两个方面扩展了Santangelo等人（2020）的研究：在六个城市中将非氰化个体分为Acli、acLi和acli，并使用线性混合模型和模型选择将氰化作用和氰化型频率与269个站点的遥感预测因子相关联。这些设计选择使我们能够探讨在采样走廊中，当寒冷介导的选择作用减弱时，非热预测因子是否可以解释变异。
白三叶草中的氰化多态性为研究环境梯度上的适应性进化提供了最佳模型之一。氰化作用是一种由两个基因位点控制的二基因位点多态性：（1）Ac位点，编码合成氰化糖苷的能力（储存在液泡中）；（2）Li位点，编码水解酶linamarase（储存在细胞壁中）。当两个基因产物都存在时（Ac⁺Li⁺），植物在组织受损时释放氢氰酸（HCN），从而提供对抗食草动物的化学防御（Hughes 1991）。其他基因型表现出部分或完全的功能丧失：Ac⁺Li⁻（Acli）或Ac⁻Li⁺（acLi），以及Ac⁻Li⁻（acli）个体是非氰化表型（Daday 1965；Kooyers等人2018）。仅产生氰化途径一个组分的植物可能在生态上处于劣势，因为它们承担了氰化作用的代谢成本而没有获得其防御效益。然而，携带一个组分的适应后果在不同表型之间并不相同。Acli植物（存在糖苷，缺乏酶）避免了由霜冻或机械损伤引起的HCN介导的组织损伤，同时仍保留了氰化糖苷作为氮储存化合物，在营养压力下可以重新利用（Gleadow和Møller 2014）。在食草动物压力较低的环境中，缺乏linamarase进一步消除了没有净防御回报的水解系统的成本。相比之下，acLi植物（存在酶，缺乏糖苷）避免了糖苷生物合成的碳和氮成本，同时保留了linamarase，这是一种具有广泛特异性的β-葡萄糖苷酶，其作用不仅限于HCN释放，还包括非氰化糖苷的水解，涉及细胞壁代谢和次级化合物的转化（Oxtoby等人1991；Barrett等人1995）。我们假设，在城市化程度较高的环境中，由于节肢动物食草压力降低（Fenoglio等人2020），糖苷投资的防御回报减少，acLi植物可能通过消除糖苷的生物合成成本而获得净适应优势，同时保留了linamarase的更广泛的代谢效用。这些表型的分布反映了防御成本、耐霜性和干旱适应之间的权衡，产生了文献中记录的纬度和海拔梯度上的氰化作用变化（Kooyers等人2018；Santangelo等人2022）。
尽管有这些广泛的基础，但在具有相似温度气候的城市中，氰化变异的经度模式仍研究不足。在本研究中，经度MWT梯度为7.9°C，从SD州的Sioux Falls的−15.6°C到IN州的Indianapolis的−7.70°C，远小于更广泛地理研究中记录的纬度梯度（Kooyers和Olsen 2012中的35.36°C；Santangelo等人2020中的35.0°C）。重要的是，实验证据表明，在较低温度下，氰化T. repens中HCN释放的温度依赖性减弱，在大约15°C以下趋于平稳（Fadoul等人2023），这表明低温范围内的温度变化对HCN产量的影响不如高温范围强烈。因此，我们的经度走廊将城市间的MWT变化压缩到仅7.9°C，处于温度对氰化频率结构作用相对较弱的范围，这促使我们更加关注非热环境预测因子，相对于跨越大陆的纬度研究。在大多数北美种群中，冬季寒冷已被确定为HCN频率的关键驱动因素，北部城市由于霜冻暴露更多，其氰化频率较低（Kooyers和Olsen 2012；Santangelo等人2020；Kuo等人2024），尽管它经常与其他环境因素（包括降水和干旱）共变（Kooyers等人2014）。美国中西部的经度梯度提供了一个独特的设置，可以区分这些关系：虽然该地区的城市具有相似的MWT，但它们在降水、干旱程度和潜在蒸散量以及人类足迹强度方面存在显著差异。这种区域环境梯度使我们能够测试城市和水文压力是否独立于温度驱动的选择作用来塑造氰化作用。
为了研究非热环境因素如何独立于温度驱动的选择作用来塑造氰化作用变异，我们量化了美国中西部九个城市中269个T. repens种群的氰化型和非氰化型频率，这些城市沿经度梯度排列，其中MWT变化相对于大陆纬度梯度显著减小（范围为7.90°C，而更广泛地理研究中的范围为21–35°C；Kooyers和Olsen 2012；Santangelo等人2020）。这种设计使我们能够在保持主要选择因素（冬季寒冷）相对不变的情况下，分离城市化强度、干旱和蒸散量对氰化作用变异的贡献。我们结合了Santangelo等人（2020）的城市-农村样带采样方法和五个环境预测因子的区域主成分分析（PCA）：人类足迹指数、干旱指数、年降水量、潜在蒸散量和最低冬季温度，以了解城市间的广泛环境变异。我们进一步提取了八个站点级别的遥感变量：夏季和冬季的归一化植被指数差异（NDVI_summer，NDVI_winter）、夏季和冬季的地表温度（LST_summer，LST_winter）、归一化雪指数差异（NDSI）、全球人造不透水表面覆盖（GMIS）、年潜在蒸散量（PET）和干旱指数，以回答三个问题：首先，HCN频率是否可以独立于冬季温度变化沿城市-农村梯度可预测地变化？其次，站点级别的人为和水文变量是否可以解释总氰化作用和个别酶位点频率的空间变异？第三，Ac和Li位点在不同城市中对环境梯度的响应是否相似，或者它们是否表现出特定基因位点和环境依赖的关联？我们测试了三组针对蓝藻型（cyanotype）的特定预测：(i) 具有完全氰化能力的AcLi个体随着城市化进程的推进，由于食草动物压力的减轻而减少（Johnson和Munshi-South 2017；Santangelo等人2022），但会因葡萄糖苷产生的耐旱优势而在干旱条件下增加（Kooyers等人2014）；(ii) 在非氰化型的蓝藻型中，Acli个体在水分受限的城市环境中会因保留了与葡萄糖苷相关的耐旱缓冲机制而增加，而无需付出酶的代价；同时，随着完全氰化能力的选择性优势减弱，acli个体也会普遍增加；(iii) 如果linamarase保留了与葡萄糖苷可用性无关的β-葡萄糖苷酶的多效功能，AcLi个体可能能够在高度城市化的环境中存活（Oxtoby等人1991；Barrett等人1995），从而将Li基因座的保留与食草动物的选择压力分离。这些预测共同反映了城市化对两种蓝藻型频率的影响是不同的，而不是均匀地侵蚀氰化能力。我们使用了一个多步骤的分析框架来评估这些预测，该框架包括零模型方差分解、以城市为随机截距的单变量和多变量线性混合效应模型、基于AICc的模型选择、随机斜率异质性测试以及城市级别的稳健回归分析，使我们能够区分全球一致的环境效应和城市特定的效应。这些分析共同检验了白三叶草（white clover）氰化能力的平行城市进化是否反映了对于共同选择梯度的可预测响应，或是独立于城市而存在的局部环境镶嵌体。
**材料与方法**
**采样设计**
为了评估白三叶草的氰化能力变化是否与区域气候和人类足迹在纵向梯度上的变化脱钩，我们选择了九个代表不同城市规模、地理位置和气候条件的中西部城市（图1）。这些城市从美国中西部的东部（哥伦布，俄亥俄州）到西部（苏福尔斯，南达科他州）大约相距1100公里，经历了从温暖的东南部到寒冷的西北部的温度梯度（温差=7.9°C；图1）。被采样的城市包括哥伦布（俄亥俄州）、印第安纳波利斯（印第安纳州）、厄巴纳-香槟（伊利诺伊州）、纳珀维尔（伊利诺伊州）、皮奥里亚（伊利诺伊州）、达文波特（爱荷华州）、锡达拉皮兹（爱荷华州）、奥马哈（内布拉斯加州）和苏福尔斯（南达科他州）。
**全美背景及中西部研究地图**
该地图展示了沿城乡剖面采样的九个美国中西部城市的白三叶草（Trifolium repens）种群分布情况。A面板显示了整个美国大陆，并突出显示了中西部研究区域以提供地理背景。B面板展示了这九个研究城市；饼图按城市陆地面积（平方公里）缩放，表示每个城市内所有采样种群的平均蓝藻型频率。对于进行了补充测定的六个城市（锡达拉皮兹、哥伦布、达文波特、纳珀维尔、皮奥里亚和厄巴纳-香槟），饼图分为四个部分：具有氰化能力的AcLi（蓝色）、仅含葡萄糖苷的Acli（金色）、仅含linamarase的acLi（绿色）以及完全非氰化的acli（红色）。对于仅进行了二元氰化能力测定的三个城市（奥马哈、印第安纳波利斯和苏福尔斯），饼图仅显示HCN+（氰化型，蓝色）和HCN−（非氰化型，红色）。地图背景显示了最低冬季温度（MWT，°C；WorldClim v2.1，BIO6：最冷月份的最低温度），分辨率为30弧秒（九个城市的温差范围为-15.60至-7.70°C）。
采样工作在两个夏季分三次进行：第一次采样（2018年5/6月）包括奥马哈和苏福尔斯；第二次采样（2019年5月）包括哥伦布和印第安纳波利斯；第三次采样（2019年6月）包括厄巴纳-香槟、纳珀维尔、皮奥里亚、达文波特和锡达拉皮兹。我们的采样协议遵循了Santangelo等人（2020）的方法，每个城市的采样剖面从城市中心延伸到郊区，再进入农村边缘，覆盖了不同的城市化程度（图S1a - i）。在每个城市中，我们从26到31个地点各采集了15株T. repens植物（总共269个种群），这些地点之间的间距约为1公里，共获得4,035份植物样本（表S1）。大多数采样地点位于公共公园、学校、运动场以及路边草坪上。在每个采样点，样本个体之间至少相隔1.5米，以减少采集到相同克隆基因型的可能性。在每个地点，我们记录了纬度和经度坐标（表S1），并收集了带有三到四片完整叶子的匍匐茎。匍匐茎被放入塑料袋中，并用冰块保存在冷却器中，直到带回印第安纳州格林卡斯尔的德保大学实验室，在那里它们被单独放入2毫升的微量离心管中，并储存在-80°C下直到进行HCN表型分析。
**氰化能力测定**
我们使用Feigl-Anger测定法来确定植物是否具有氰化能力（Feigl和Anger 1966；Gleadow等人2011）。该测定法通过颜色反应来识别植物表型。具体来说，含有叶片样本的微量离心管从冷冻室取出并解冻；之前的冷冻过程已经裂解了细胞，促进了HCN的释放。每株植物的一个成熟叶片被放入一个96孔板的孔中，孔中加入80微升无菌去离子水。叶片样本被交替放入孔中，使得每个孔包含45株植物的样本。然后用移液器尖端将植物组织捣碎。板子被Feigl-Anger测试纸覆盖，并在37°C下孵育3小时。如果测试纸的颜色从白色变为蓝色，则记录该植物为具有氰化能力（HCN存在；即Ac⁺Li⁺）；如果颜色不变，则记录为非氰化能力（HCN不存在；即Ac⁺Li⁻（Acli）或Ac⁻Li⁺（acLi）或Ac⁻Li⁻（acli）。为了确定氰化基因型的动态（产生HCN的个别基因座），我们对六个城市（锡达拉皮兹、哥伦布、皮奥里亚、纳珀维尔、达文波特和厄巴纳-香槟）中的所有非氰化植物进一步使用两种互补测定法检测Ac或Li基因座的存在。对于最初检测结果为阴性的植物，我们分别加入（1）40微升10 mM的外源性氰化葡萄糖苷（linamarin；Sigma-Aldrich 68264）加上50微升去离子水，或（2）80微升0.2 EU/mL的linamarase（LGC Standards CDX-00012238-100）加上20微升去离子水。样本在37°C下与测试纸孵育3小时。处理（1）中的阳性HCN反应表明存在linamarase（acac Li–），而处理（2）中的阳性反应表明存在氰化葡萄糖苷（Ac– lili）。对于在两种处理中均无颜色变化的植物，被归类为同时缺乏氰化葡萄糖苷和linamarase（acac lili）。这些测定法之前已经通过PCR验证，并能可靠地确定T. repens的蓝藻型（Olsen等人2008；Thompson和Johnson 2016）。
**区域环境数据与统计分析**
区域环境数据来自开放数据库，用于研究区域非生物因素与氰化能力频率之间的关系。最低冬季温度（MWT）数据从WorldClim版本2.1（BIO6：最冷月份的最低温度）中提取，分辨率为30弧秒，数据来自float32栅格。使用双线性插值方法为每个GPS采样位置提取了数值。AP值的提取过程还利用了WorldClim BioClim版本2.1数据库中的高分辨率栅格数据集（Fick和Hijmans 2017），特别是BIO12变量（年降水量），提供了分辨率为30弧秒（约1公里）的空间明确气候数据（https://www.worldclim.org/data/bioclim.html）。我们还从全球气候数据集中获取了PET和AI值。提取过程使用了CGIAR-Consortium for Spatial Information Global Aridity and PET Database版本3中的高分辨率栅格数据集，提供了分辨率为30弧秒（约1公里）的空间明确气候数据（Trabucco和Zomer 2019；CGIAR-CSI - https://cgiarcsi.community/data/global-aridity-and-pet-database/）。
HFI/城市影响强度整合了多种人为压力，包括人口密度、农作物和牧场用地、道路和铁路以及建成环境（Venter等人2016a）。使用Python（版本3.9）和2009年人类足迹指数GeoTIFF数据集（Venter等人2016b）以1平方公里的分辨率量化了HFI。HFI值是使用rasterio.sample()函数实现的基于点的最近邻采样方法提取的。这种方法在不进行插值的情况下获取每个点的确切像素值。HFI值根据（Venter等人2016a）修改的标准类别进行分类：荒野：HFI < 1（最小人类影响）；低影响：1 ≤ HFI < 4（低人类改造）；中等影响：4 ≤ HFI < 10（中等人类改造）；高影响：HFI ≥ 10（高人类改造）。城市指标的数据来自2020年美国人口普查局的数据（https://www.census.gov/data.html）。城市陆地面积是根据官方市政记录编制的，代表合并后的城市边界。这里呈现的环境数据代表城市级别的非生物条件，而不是每个站点单独提取的条件。
为了研究细尺度环境变化是否对城市特定的氰化模式有贡献，我们使用Google Earth Engine（GEE；Gorelick等人2017）为每个采样点提取了八个额外的地理空间预测因子，计算方法是以每个站点GPS坐标为中心的500米圆形缓冲区内的平均值。夏季和冬季的NDVI（NDVI_summer，NDVI_winter）来自MODIS/Aqua 16天合成图像（MYD13Q1，500米；Didan 2021），分别代表2018–2019年6月至8月和12月至2月的所有图像的平均值。NDSI（NDSI；MOD10A2，500米；Hall和Riggs 2021）是2017–2019年12月至3月的平均值，作为霜冻暴露的代理指标。夏季和冬季的地表温度（LST_summer，LST_winter）来自MODIS/Aqua 8天产品（MYD11B1，1公里；Wan等人2021），分别代表2018–2019年6月至8月和12月至2017–2019年12月的平均值。不透水面覆盖（GMIS）来自Global Human Settlement Layer建成表面产品（JRC/GHSL/P2023A/GHS_BUILT_S_10m；Pesaresi和Politis 2023），时代为2018年，并作为城市化强度指数。年度潜在蒸散量（PET）和干旱指数也被提取作为水分平衡的预测因子。在建模之前，所有八个预测因子都进行了全球z分数标准化，以便直接比较具有不同单位的变量之间的效应大小。我们分别为每个预测因子拟合了单变量线性混合效应模型（LMMs）（以HCN频率为响应变量，城市为随机截距），模型形式为HCN_frequency ~ Predictor_z + (1 | City）。我们还拟合了包括所有非共线性预测因子的多变量LMM，并使用基于AICc的模型选择（MuMIn::dredge）来确定最佳支持的驱动因素组合，从ΔAICc < 2的模型中提取模型平均系数（全平均方法）。同样的建模框架也被应用于六个城市中具有互补蓝藻型测定数据的非氰化型频率（acli，acLi，Acli）（n = 180个站点）。站点级别的模型在R（版本4.x）中使用lme4（Bates等人2015）、lmerTest（Kuznetsova等人2017）和MuMIn（Bartoń 2025）包进行。边际和条件R²值使用MuMIn::r.squaredGLMM根据Nakagawa和Schielzeth（2013）的方法计算。
地图可视化是在Python（版本3.9）中使用Matplotlib、Cartopy和SciPy生成的。城市级别的平均MWT值使用三次样条插值在区域内插值，并以平滑的温度梯度显示，颜色梯度使用RdYlBu_r表示。每个城市上方叠加了一个按城市陆地面积缩放的饼图，显示了具有氰化能力（HCN+，蓝色）和非氰化能力（HCN−，红色）的个体比例，饼图大小通过平方根变换调整以确保视觉清晰度并最小化重叠。鉴于本研究中的城市在剖面长度上存在显著差异，距离被标准化到0到1的范围内。该方法采用两步过程：（1）使用Haversine公式计算从城市中心到各点的原始地理距离；（2）将每个城市内的距离标准化到0–1的范围内，其中0代表城市中心，1代表最远的（农村）采样点。这样标准化距离后，所有剖面都处于相同的尺度上，无论城市大小如何。为了研究氰化能力与城乡距离以及氰化能力与人类足迹指数（HFI）之间的关系，我们分别为每个城市拟合了稳健的线性回归（迭代加权最小二乘法，IRLS；Huber权重，调整常数k = 1.345），并计算了每个城市和整个数据集的Spearman等级相关性。评估了三个效应：距离（或HFI）效应：当数据跨城市汇总时，响应变量是否与标准化距离（或HFI）相关；城市效应：响应变量在不同城市之间是否存在差异，无论距离或HFI如何；以及交互作用：距离（或HFI）与响应变量之间的关系在不同城市之间是否存在差异（City × Distance或City × HFI交互作用）。City × Distance交互作用通过似然比检验（LRT）进行正式测试，比较了随机斜率线性混合模型（HCN ~ Distance + (Distance | City)）与随机截距模型（HCN ~ Distance + (1 | City），在lme4中拟合（χ²(2) = 9.53，p = 0.005）。为了评估标准化距离或HFI与蓝藻生成（或蓝藻类型）相对频率之间的关系强度和方向，我们为每个城市以及整个数据集计算了Spearman等级相关性。为了研究沿纵向梯度不同城市之间环境预测因子与HCN频率之间的关系，我们对五个标准化环境变量（HFI、MWT、AI、AP和PET）进行了主成分分析（PCA），这些变量被汇总到城市层面。环境变量通过z分数标准化处理以确保权重相等，PCA是通过协方差矩阵的特征值分解来执行的。前两个主成分分别解释了环境预测因子方差的69.5%和23.5%（累计93%），并在一个双坐标图中进行了可视化，其中城市用点表示，颜色根据HCN频率而定，环境变量则作为从原点出发的向量表示。为了在考虑城市级差异的同时测试环境效应，我们拟合了一个线性混合效应模型（LMM），其形式为HCN Frequency ~ PC1 + PC2 + (1 | City)，其中PC1和PC2作为固定效应代表正交的环境梯度，而City作为随机截距以解释城市内部观测值的非独立性。此外，对于每种蓝藻类型的频率，我们还拟合了所有环境预测因子的LMM，随机城市效应的形式为：Cyanotype Frequency ~ HFI + MWT + AI + AP + PET + (1 | City)。模型使用Python中的statsmodels包通过受限最大似然法（REML）进行拟合，使用主成分作为预测因子避免了原始环境变量之间的多重共线性问题。
**城市特定的氢氰酸（HCN）频率沿纵向梯度的模式**
对美国中西部九个城市的HCN频率进行分析后发现，地理和城市化梯度之间存在显著的空间异质性（图1和图2）。在城市尺度上，HCN的平均频率几乎相差三倍，从印第安纳波利斯的6.2%到内珀维尔的19.0%（图1，表S1），九个城市的平均HCN频率为12.7%（标准差=4.5%），这种变化在所有模型中都高度显著（p < 0.001）。重要的是，HCN频率并没有遵循简单的纵向或最低冬季温度（MWT）梯度。处于相似温度制度下的城市显示出不同的频率[例如，印第安纳波利斯（6.2%）与哥伦布（14.9%）]，而较冷地区的城市则显示出中等到高的频率[例如，苏福尔斯（14.4%）和奥马哈（12.0%）]。此外，HCN频率与标准化距离之间没有总体关系（ρpool = -0.032，p = 0.597；图2a）。然而，个别城市表现出多样且通常强烈的梯度模式，有些城市显示出正相关（向农村地区HCN频率增加），例如印第安纳波利斯（ρ = 0.409，p < 0.05），其他城市显示出负相关（向农村地区HCN频率减少），例如奥马哈（ρ = -0.356，p < 0.05）、皮奥里亚（ρ = -0.386，p < 0.01）和苏福尔斯（-0.564，p < 0.01），还有一些城市显示出相对平坦的梯度（图2a，表S1）。这种异质性得到了城市×距离交互作用的显著支持（LMM LRT：χ² = 9.53，p = 0.005），这意味着蓝藻生成的城市-农村梯度高度依赖于具体情境，并受到当地环境或生态因素的影响。
**美国中西部九个城市中蓝藻生成频率与城市化指标之间的非平行关系**
城市特定的IRLS稳健回归线（虚线；Huber权重，k = 1.345）显示了AcLi（HCN）频率与（a）标准化距离（0 = 城市，1 = 农村）和（b）人类足迹指数（HFI）之间的关系，这些关系在不同城市之间是异质的且常常相反，没有一致的总体趋势（粗实线）。每个城市的Spearman ρ值显示在括号中（* p < 0.05，** p < 0.01）。插图报告了汇总的距离/HFI效应、城市级方差（LMM）和城市×预测因子交互作用测试。
同样，HCN频率与HFI之间也没有总体关系（ρpool = -0.027，p = 0.671；图2b）。城市特定的回归线显示了梯度模式的显著异质性。几个城市显示出负相关，表明HCN频率随着HFI的增加而减少：锡达拉皮兹（ρ = -0.325）、达文波特（ρ = -0.361）、印第安纳波利斯（ρ = -0.333，p = 0.024）、厄巴纳-香槟（ρ = -0.235）和内珀维尔（ρ = -0.090）。相比之下，其他城市显示出正相关，表明HCN频率随着HFI的增加而增加：苏福尔斯（ρ = 0.319）、哥伦布（ρ = 0.188）和皮奥里亚（ρ = 0.152）。奥马哈显示出几乎平坦的关系（ρ = -0.025），表明HCN频率在HFI梯度上的变化很小（图2b）。尽管各个城市的平均HCN频率存在显著差异[F(8,242) = 5.65，p = 0.006]，但城市×HFI交互作用并不显著（LMM LRT：χ²(2) = 5.07，p = 0.079），表明城市特定的HFI斜率并没有超出单一汇总斜率所预测的范围。
**沿纵向梯度的HCN频率的区域环境预测因子**
九个城市的环境预测因子存在显著差异（表S2）。MWT的范围从-15.60°C（苏福尔斯，SD）到-7.70°C（印第安纳波利斯，OH），相差7.90°C，远小于Kooyers和Olsen（2012年）以及Santangelo等人（2020年）在纬度研究中报告的21.36°C和35.0°C的范围。相比之下，非温度预测因子的梯度比例更大：年降水量（AP）的范围从605毫米到1,056毫米（范围=451毫米），干旱指数（AI）从0.48到0.92（范围=0.44），年潜在蒸发量（PET）从1,146毫米到1,376毫米（范围=230毫米）。HFI的范围从最偏远的采样点的15.55到最城市化的地区的55.00，相差39.45个单位。这些值共同证实，尽管沿纵向梯度的温度变化相对于大陆纬度研究有所减小，但仍捕捉到了显著的水文和人为梯度，提供了必要的环境对比，以测试非温度驱动因素是否独立地结构化了城市间的蓝藻生成变化。
对五个环境变量（HFI、MWT、AI、AP和PET）进行PCA分析后发现，前两个主成分解释了93%的环境方差（PC1：69.5%，PC2：23.5%）。PC1捕捉了水分-能量平衡梯度，AI（+0.528）、AP（+0.511）和MWT（+0.459）有强烈的正载荷，而PET（-0.419）有中等的正载荷（图3，表S3），代表了从水分过剩到水分不足的环境梯度。PC2主要代表了人为干扰的变化，HFI（+0.731）有强烈的正载荷，捕捉了独立于气候梯度的人类影响变化。城市根据其环境特征在PCA空间中定位，并根据平均HCN频率进行着色。HCN频率高的城市（黄色/浅绿色，0.15–0.19；内珀维尔、皮奥里亚、哥伦布）在环境空间中占据不同的位置，涵盖了PC1和PC2的高值和低值；HCN频率低的城市（紫色/深蓝色，0.06–0.09；印第安纳波利斯、锡达拉皮兹）也占据了不同的环境位置。例如，内珀维尔和皮奥里亚的HCN频率都很高（分别约为0.19和0.18），但在环境空间中占据不同的位置：内珀维尔与高HFI和中等气候值相关，而皮奥里亚则显示中等HFI和气候值。同样，印第安纳波利斯和锡达拉皮兹的HCN频率都很低（分别约为0.06和0.08），也占据不同的环境位置：印第安纳波利斯与高降水量和温度相关，但HFI中等，而锡达拉皮兹显示中等气候值和中等HFI（图3）。此外，线性混合效应模型显示，多个环境压力因素（PC1和PC2作为代表环境梯度的固定效应）在我们的模型中都不是平均HCN频率的强预测因子（表S4）。这种非平行模式表明，相同的环境条件可能导致不同城市的HCN频率不同。关键的是，分析没有发现HCN频率与环境预测因子向量之间有明确的对齐，表明无论是水分-能量平衡梯度（PC1）还是人类影响梯度（PC2）都不能一致地预测城市间的HCN频率（图3，图S2）。
**沿纵向梯度的非蓝藻生成蓝藻类型频率的变化**
为了将我们的分析扩展到HCN/AcLi频率之外，我们使用相同的IRLS稳健回归框架测试了三种双基因位点蓝藻类型（Acli、acLi和acli）的相对频率是否随城市化而变化，将城市内的标准化城乡距离和站点级别的HFI作为预测因子。图S3a–f展示了每种蓝藻类型-预测因子组合的相应散点图，其中城市特定数据以颜色显示，并叠加了汇总的稳健拟合。与汇总的HCN频率一样，这些图表显示了每个城市的显著散布和局部异质性轨迹，而不是任何统一的方向趋势。
**表4以表格形式总结了这些模式，报告了每种蓝藻类型×预测因子组合在全球z分数预测因子上的标准化稳健斜率（β）、Wald 95%置信区间、双侧Wald p值以及在共享β轴上的迷你森林图（虚线参考线在β = 0；须状线跨越每个CI）。效应大小在所有六个测试中都一致较小（|β| ≤ ~0.03）。五种组合不显著：汇总的城乡距离与Acli、acLi或acli频率无关（所有p > 0.06），Acli和acli与HFI也没有显著关联（p > 0.30和p > 0.07）。唯一显著的汇总关联是acLi频率与HFI之间的适度正相关（β ≈ +0.01，p ≈ 0.041），主要由哥伦布和厄巴纳-香槟的城市特定关系驱动（图S3e）。acLi与距离和acli与HFI的边际趋势（p < 0.10）不如汇总的HCN-城市化信号精确，鉴于多次测试和城市内的显著方差，需要谨慎解释。总体而言，图S3a–f和图4表明沿城市化轴的蓝藻类型组成没有一致的多城市变化。**
**蓝藻类型频率与城市化的关系**
蓝藻类型频率与城市化的关系。IRLS稳健回归的标准化β值（Huber权重，k = 1.345）显示了Acli、acLi和acli与标准化距离（0 = 城市，1 = 农村）和人类足迹指数（HFI）之间的关系，这些关系在不同城市之间是异质的且常常相反，没有一致的总体趋势。表S3a–f和图4表明，沿城市化轴的蓝藻类型组成没有一致的多城市变化。
**主成分分析（PCA）总结了九个中西部城市中AcLi频率的环境预测因子。PC1（69.5%）捕捉了水分-能量平衡梯度（降水量、干旱度、蒸发量），而PC2（23.5%）代表了人类影响的变化（HFI）。城市位置根据平均AcLi频率进行着色。AcLi频率与环境向量之间缺乏对齐，表明气候或人类足迹都不能预测蓝藻生成频率，支持城市特定的、非平行的城市演化模式。**
**沿纵向梯度的非蓝藻生成蓝藻类型频率的变化**
为了将我们的分析扩展到HCN/AcLi频率之外，我们使用相同的IRLS稳健回归框架测试了三种双基因位点蓝藻类型（Acli、acLi和acli）的相对频率是否随城市化而变化，将城市内的标准化城乡距离和站点级别的HFI作为预测因子。图S3a–f展示了每种蓝藻类型-预测因子组合的相应散点图，其中城市特定数据以颜色显示，并叠加了汇总的稳健拟合。与汇总的HCN频率一样，这些图表显示了每个城市的显著散布和局部异质性轨迹，而不是任何统一的方向趋势。
**图4以表格形式总结了这些模式，报告了每种蓝藻类型×预测因子组合在全球z分数预测因子上的标准化稳健斜率（β）、Wald 95%置信区间、双侧Wald p值以及在共享β轴上的迷你森林图（虚线参考线在β = 0；须状线跨越每个CI）。效应大小在所有六个测试中都一致较小（|β| ≤ ~0.03）。五种组合不显著：汇总的城乡距离与Acli、acLi或acli频率无关（所有p > 0.06），Acli和acli与HFI也没有显著关联（p > 0.30和p > 0.07）。唯一显著的汇总关联是acLi频率与HFI之间的适度正相关（β ≈ +0.01，p ≈ 0.041），主要由哥伦布和厄巴纳-香槟的城市特定关系驱动（图S3e）。acLi与距离和acli与HFI的边际趋势（p < 0.10）不如汇总的HCN-城市化信号精确，鉴于多次测试和城市内的显著方差，需要谨慎解释。总体而言，图S3a–f和图4表明沿城市化轴的蓝藻类型组成没有一致的多城市变化。**
**蓝藻类型频率与城市化的关系**
蓝藻类型频率与城市化的关系。IRLS稳健回归的标准化β值（Huber权重，k = 1.345）显示了Acli、acLi和acli与标准化距离和人类足迹指数（n = 181个站点，六个城市）之间的关系。Wald 95%置信区间和p值在表中列出；每行包括在共同β轴上绘制的迷你森林图（虚线灰色线标记β = 0；须状线跨越95% Wald CI）。只有acLi × HFI的p < 0.05（粗体行）。图S3列出了所有估计值。
**PCA分析了六个城市中的环境预测因子，确定了两个主导的环境变化轴。PC1解释了总方差的64.5%，代表了水分-能量平衡梯度，AI和AP有强烈的正载荷，PET有负载荷。PC2解释了20.9%的方差，主要捕捉了人类影响和温度的变化，HFI和MWT有正载荷（图S4）。在所有三种蓝藻类型中，城市与PC1或PC2都没有一致的对齐（例如，内珀维尔的平均Acli频率最高（约0.40），而锡达拉皮兹最低（约0.22），在水分-能量梯度上没有一致的排序（图S4），表明水分-能量梯度或综合的人类影响-温度梯度都不能强烈预测城市规模的蓝藻类型频率。此外，为了测试区域梯度是否解释了城市间的变化，我们拟合了LMM，将城市作为随机截距，并同时将所有五个区域预测因子作为z分数的固定效应输入（表S5）。对于Acli和acli蓝藻类型，没有固定效应显著（所有p > 0.05）。相比之下，acLi与多个气候变量有显著关联：频率随着AI的增加而减少（β = -0.674，SE = 0.275，z = -2.450，p = 0.014）和PET β = -0.370，SE = 0.158，z = -2.339，p = 0.019），而随着AP的增加而增加（β = 0.467，SE = 0.177，z = 2.644，p = 0.008），而HFI和MWT不是显著预测因子。因此，在城市尺度上，只有acLi蓝藻类型的多元水分-能量信号是可检测的，而Acli和acli蓝藻类型与相同的区域预测因子集没有关联。**
从Google Earth Engine中提取了八个地理空间预测因子，并使用单变量LMM作为蓝藻类型频率的站点级预测因子进行了测试。在可视化之前，迭代VIF修剪确定了干旱指数（AI；VIF = 17.96）和雪盖指数（NDSI；VIF = 8.63）与保留的预测因子集共线（图S5）；因此，这两个变量从系数图中排除（图5）。六个预测因子中没有一个与HCN频率显著相关（n = 269个站点，九个城市；所有p > 0.19），其中冬季NDVI的绝对t统计量最大（β = 0.013，SE = 0.010，t = 1.32，p = 0.19）。对于完全非蓝藻生成的蓝藻类型（acli；n = 180个站点，六个城市），在α = 0.05时没有预测因子达到显著性；冬季LST显示出轻微的负相关（β = −0.077，SE = 0.040，t = −0.19，p = 0.063），表明在较冷的站点acli频率略高。对于acLi蓝藻型（含有linamarase，不含葡萄糖苷），有四个预测因子在统计上显著：夏季NDVI（β = −0.016，SE = 0.006，t = −2.69，p = 0.0079）和冬季NDVI（β = −0.019，SE = 0.009，t = −2.08，p = 0.039）都与acLi频率呈负相关，而夏季LST（β = +0.019，SE = 0.007，t = 2.84，p = 0.0051）和冬季LST（β = +0.033，SE = 0.013，t = 2.57，p = 0.031）则呈正相关；建成区面积百分比（GMIS）和年PET没有显著相关性（p = 0.131和0.767）。此外，LRT支持随机斜率结构（χ² = 6.59，df = 2，p = 0.037），表明acLi与夏季LST之间的关系在不同城市之间存在显著差异。对于Acli蓝藻型（含有葡萄糖苷，不含酶），与NDVI的相关性为正向但幅度较小（夏季NDVI：β = +0.022，SE = 0.013，p = 0.083；冬季NDVI：β = +0.036，SE = 0.019，p = 0.056），其他预测因子均未达到显著性。系数图显示了一个一致的模式，即局部热强度和植被绿色度（通过LST和NDVI捕捉）与acLi频率最为吻合，而其他蓝藻型和HCN频率对相同站点级别的预测因子的响应有限且不显著。
图5
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**系数图：环境预测因子对中西部城市acLi/HCN频率和非蓝藻型频率标准化效应大小的影响。**点代表每个预测因子单独拟合的单变量线性混合模型的标准化回归系数（β）及其95%置信区间（模型：Response ~ Predictor_z + (1 | City）；REML = TRUE；Satterthwaite自由度；lme4/lmerTest）。所有预测因子在模型拟合前均使用全局均值和标准差进行了z分数标准化（HCN频率的n = 269个站点；蓝藻型频率的n = 180个站点，6个城市），从而能够直接比较不同预测因子和响应变量之间的效应大小。仅显示经过方差膨胀因子（VIF）修剪后保留的预测因子（VIF ≤ 5）；由于共线性，干旱指数（VIF = 17.96）和积雪覆盖指数（NDSI；VIF = 8.63）被排除。实心蓝色圆圈表示显著正效应（p < 0.05）；实心红色圆圈表示显著负效应（p < 0.05）；空心圆圈表示不显著（p ≥ 0.05）。星号表示显著性水平（*** p < 0.001，** p < 0.01，* p < 0.05）。垂直虚线标记β = 0（无效应）。行阴影按生态类别分组：绿色 = 植被密度（NDVI），红色 = 热环境（LST），紫色 = 城市化强度（GMIS），琥珀色 = 年PET）。
**讨论**
通过研究美国中西部城市白三叶草的蓝藻生成现象，我们测试了在冬季温度变化最小化时，城乡和人为梯度是否会产生可预测的适应模式。总体而言，我们发现在这个空间尺度上，蓝藻生成的多态性与区域气候和人为干扰基本脱钩。尽管HCN频率在不同城市间相差近三倍（6.2–19.0%），但我们没有发现其与城市中心的标准距离、HFI或通过PCA总结的主要环境梯度之间存在一致的相关性。这些结果与大陆尺度上记录的强烈且可预测的纬度梯度形成鲜明对比，在大陆尺度上，温度和干旱对蓝藻生成具有主导性的选择压力（Kooyers和Olsen 2012；Santangelo等人2020；Kuo等人2024）。我们的发现表明，区域和城市尺度上的蓝藻生成多态性受尺度依赖性和特定环境的选择压力所支配，而非气候驱动适应的信号减弱。
**城乡梯度的不平行性和环境依赖性**
本研究的一个核心结果是，不同城市间蓝藻生成的城乡梯度存在强烈的不平行性。虽然一些城市显示HCN频率与城市中心的距离呈正相关或负相关，但其他城市则没有明显的梯度，导致整体趋势不明显，并且存在显著的City × Distance交互作用。与之前的研究一致，Santangelo等人（2020）在沿纬度梯度的15个城市中检测到大约47%的城市存在HCN梯度，GLUE项目也记录了不同城市间适应程度的差异（Santangelo等人2022）。这种异质性表明，城市间的蓝藻生成梯度高度依赖于具体环境，而非平行。同样，HCN频率与HFI之间没有一致的关系，尽管PCA捕捉到了与水分-能量平衡和人类影响相关的显著环境变化，但这些梯度与HCN频率之间没有可预测的对齐。这些结果表明，广泛的环境指标在这个尺度上作为适应变异的预测因子效果较差。
**非平行响应**
这种非平行响应在城市进化研究中越来越受到重视，表明局部选择压力而非共享的区域梯度主导了城市的进化结果（Johnson和Munshi-South 2017；Rivkin等人2019）。我们的PCA结果进一步支持了这一观点，即HCN频率相似的城市在环境空间中往往占据不同的位置，而频率差异较大的城市有时会在主要环境轴上重叠。例如，Naperville和Peoria尽管在人类影响和气候特征上有显著差异，但HCN频率相似；而Indianapolis和Cedar Rapids的频率较低，但在环境位置上有所不同。HCN频率与水分-能量梯度或人类影响梯度之间缺乏一致的对齐，表明没有单一的环境轴能够可靠地预测城市间的蓝藻生成。这些发现强化了这样的观点：城市进化通常沿着多个局部依赖的轨迹进行，而不是趋向于共同的适应结果（Liker 2020；Kemppinen等人2024）。
**蓝藻生成遗传结构和局部驱动因素**
蓝藻型频率模式进一步支持了局部因素的主导作用。对于HCN频率，这与其低零模型ICC（6.9%）一致，表明大部分变异发生在城市内部而非城市之间，并且不受测量的区域或局部预测因子的影响。对于Acli和acli，尽管在某些情况下存在方向性趋势，但缺乏显著的站点级关联，这可能反映了本研究的压缩热梯度（7.9°C），限制了检测温度介导选择的统计能力，或者反映了对该环境轴的不敏感性，六个城市的样本量有限，或者未测量的微尺度生物因素的影响。
acLi蓝藻型显示出最一致的环境信号，四个预测因子（NDVI_winter、NDVI_summer、LST_winter和LST_summer）在单变量模型中达到显著性。关键的是，NDVI和LST的方向性相反：地表温度较高的地点通常更加开阔、不透水或热暴露，因此与植被生产力降低相关；这正是较低NDVI所捕捉的条件。这种一致性表明了一个单一的生态轴（温暖、植被稀疏、热压力大的微环境）与acLi频率呈正相关。两种互补机制可以解释这一模式。首先，较低的NDVI是叶片生物量减少和相应食草动物压力降低的公认代理指标（Santangelo等人2022；Kooyers等人2014）。在经典的频率依赖性食草模型下，完全蓝藻生成的植物在食草动物群落更多样化和丰富的地方受到选择性青睐（Dirzo和Harper 1982；Fadoul等人2023）。在植被稀疏、生产力低的城市地点，食草动物压力减弱，从而放松了对完全蓝藻生成的选择。我们假设，在这些条件下，保留linamarase的acLi个体（一种广谱β-葡萄糖苷酶，其作用不仅限于HCN释放，还包括非蓝藻生成葡萄糖苷的水解，这些葡萄糖苷参与细胞壁代谢和次生化合物的转化（Oxtoby等人1991；Barrett等人1995）可能会持续存在并增加频率，因为它们消除了葡萄糖苷的生物合成成本，同时保留了酶的更广泛代谢效用，在高食草动物压力下这种优势会被掩盖（Gleadow和Møller 2014）。其次，较高的夏季和冬季LST反映了热压力条件，在这些条件下，产生蓝藻生成葡萄糖苷所需的能量和氮投资可能是不利的（Gleadow和Møller 2014）。因此，仅保留酶成分而不投资葡萄糖苷可能代表了一种在热需求高、资源有限的微生境中的适应性节省策略，这与个体蓝藻生成组分的适应价值依赖于条件的广泛假设一致（Kooyers等人2014）。随机斜率似然比测试进一步表明，acLi频率与夏季LST之间的正相关在不同城市间存在显著差异，表明热微环境效应在城市景观中并不均匀。城市特定的因素，包括当地食草动物群落的组成、城市热岛强度和不透水面覆盖范围，可能调节这种关系的强度和方向，这导致了随机截距模型无法捕捉到的城市间异质性。
正如Stuart等人（2017）所指出的，被归类为等同的环境在选择性因子上可能存在定量差异；在这里，城市特定的微气候、霜冻暴露、土壤湿度和食草动物群落等因素（Liker 2020；Diamond等人2022；Kemppinen等人2024）可能改变了作用于蓝藻生成与非蓝藻生成基因型的选择平衡。这些确定性的但空间异质的选择压力在城市景观中产生了非平行的遗传响应，与城市间分子和表型响应通常缺乏平行性的证据一致，例如城市大山雀（Parus major）的基因组和表观基因组差异（Caizergues等人2022）；城市地点间暗眼灯芯草（Junco hyemalis）的表型差异（Diamant等人2025），以及城市间灰松鼠（Cosentino和Gibbs 2022）的黑色素梯度差异。城市适应性的综述也强调，异质的城市选择压力（如微气候、污染、生物相互作用）可以产生不同的进化结果（Diamond等人2022；Kerr等人2025），这与理论工作一致，即复制环境之间的定量环境差异降低了进化预测的可靠性（Stuart等人2017）。
我们的结果不支持关于蓝藻型频率的两种竞争性预测：AcLi植物既没有随着城市化程度的增加而一致减少（如放松食草作用所预期的），也没有随着干旱程度的增加而增加（如从葡萄糖苷产生基因型的耐旱优势所预测的）。同样，完全非蓝藻生成基因型（acli）在高度城市化的、水资源有限的环境中占主导地位的预测也没有得到支持。相反，所有分析中的主导信号是城市级别的变异，这无法用我们测试的区域环境梯度来解释，支持另一种假设，即城市白三叶草蓝藻生成的适应变异源于局部依赖的选择镶嵌体，而不是对城市化或干旱的可预测的共享响应。
**尺度依赖性和微气候的作用**
我们的发现与纬度研究的对比突显了空间尺度在理解适应进化中的重要性。在大陆梯度上，白三叶草的蓝藻生成受到温度介导的选择的强烈影响，在较冷的气候中，蓝藻生成植物的适应性降低（Daday 1965；Hughes 1991；Kooyers和Olsen 2012）。相比之下，本研究的MWT仅限于7.9°C的狭窄城市间带，相对于大陆纬度研究中21–35°C的热梯度来说大幅压缩，使得温度介导的选择不太可能是这里观察到的HCN频率差异的主要驱动因素。此外，与跨越生态上不同热区的广泛纬度梯度不同，本研究中的城市共享的冬季最低温度都低于T. repens产生HCN的温度变化阈值（Fadoul等人2023），有效地将这一系统与主导大陆尺度蓝藻生成梯度的霜冻介导的选择分离。因此，我们模型中MWT效应的缺失与本研究受限的热环境一致，表明在冬季温度变化有限的情况下，其他选择因素（包括城市干扰、降水和局部植被结构）可能在塑造蓝藻型频率方面发挥更大的相对作用。
城市生态系统通过改变的食草动物群落、破碎的栖息地和由不透水面、植被结构和城市热岛效应驱动的强烈微气候变异产生了细尺度的环境异质性（Liker 2020；Diamond等人2022；Kemppinen等人2024）。最近的研究强调微气候是生态学和生物地理学中一个关键但常被忽视的组成部分，能够独立于区域气候模式调节生物体的响应（Kemppinen等人2024；Kerr等人2025）。在我们的系统中，微气候异质性加上食草作用、土壤条件和土地利用历史的变化，可能创造了局部独特的选择机制，这些机制超越了区域气候信号（Winchell等人2016；Diamond等人2022；Caizergues等人2024）。
**对城市进化和生物地理学的意义**
我们的发现与GLUE框架一致，并扩展了该框架，该框架预测城市化驱动的进化响应是非平行的（Rivkin等人2019；Santangelo等人2022）。区域气候和人类足迹指标无法预测适应变异，这突显了粗尺度环境数据在理解城市景观中的细尺度进化过程方面的局限性。从保护与管理的角度来看，这表明通过针对特定城市的方法来理解和管理城市环境中的适应性变异可能更为有效，而不是基于广泛环境梯度的通用规则。更广泛地说，我们的研究有助于人们逐渐认识到，纵向采样设计为传统的纬度生物地理学提供了互补的视角（Procheş等人，2023年）。虽然纬度梯度在识别蓝藻生成（cyanogenesis）的广泛适应性变异方面起到了基础性作用，包括著名的Daday效应（Daday，1965年；Kooyers和Olsen，2012年），但它们本质上混淆了多个环境因素，如温度、光照周期和降水量（Conord等人，2012年；Procheş等人，2023年）。通过在相对狭窄的纬度范围内进行采样，我们的纵向设计减少了温度的干扰；与此一致的是，在269个研究地点中，地表温度并不是HCN频率的显著预测因子，从而能够更直接地研究非温度驱动因素（包括城市土地覆盖和植被结构）。然而，我们注意到这些优势是依赖于研究尺度的，并不意味着纵向设计普遍优于纬度方法。我们鼓励进行更广泛的地理复制和多系统比较，以评估纵向梯度是否始终能够揭示适应性进化的非温度驱动因素。
通过最小化温度变化，纵向梯度可以作为自然实验，帮助区分非温度驱动因素（如人类干扰、降水量、微气候和局部生态相互作用）的作用。尽管气候变化主要是由温度上升引起的，但它也与降水模式的变化、某些地区的干旱加剧以及水文极端事件的增加有关（AghaKouchak等人，2020年；Hansen等人，2025年）。了解物种如何应对这些非温度环境变化对于预测变暖世界中的进化轨迹将变得越来越重要。此外，我们的发现提供了一个区域案例研究，展示了纵向采样设计在进化生态学中的潜在价值和局限性。即使城市在非温度环境空间上有明显差异（图3），蓝藻生成频率仍然很大程度上无法通过测量的区域预测因子来预测，这表明纵向设计在揭示适应性模式方面的有效性强烈依赖于研究的空间尺度和可用环境数据的分辨率。
**局限性与结论**
应考虑几个局限性。尽管我们结合了GEE提供的站点级环境数据以及区域气候和人类足迹指标，但这些数据仍然是间接代理指标：它们不能替代对每个种群中植食作用、土壤湿度、霜冻伤害或原位微气候的直接测量，而这些因素可能在细尺度上主导着蓝藻生成的选择。因此，如果某个预测因子与研究结果无关，应谨慎解释——这可能是由于该代理指标的生物学相关性有限、数据与过程不匹配，或是未测量的局部驱动因素所致，而不仅仅是环境控制的缺失。如果能够纳入植食作用、微气候和土壤性质的直接测量数据，可能会揭示出与蓝藻生成更强的关联。此外，我们的研究仅涵盖了单一纵向梯度内的九个城市；需要更广泛的地理采样来评估非平行城市反应的普遍性。最后，当前的模式可能部分反映了不同地点之间的基因流变化，这可能会独立于局部选择压力而使蓝藻生成频率趋于同质化或分化。重要的是，我们将蓝藻生成与环境的关系视为统计关联，而非选择的证据，并遵循Gould和Lewontin（1979年）的观点，避免假设每种模式都反映了适应性功能。特别是，acLi信号与NDVI/LST的相关性既符合关于温暖开阔微生境的生态假设，也可能与基因流偏差、小种群的局部漂变、克隆结构或通过连锁和多效性的间接效应有关。虽然鉴于T. repens没有显示出范围广泛的种群收缩迹象（Battlay等人，2025年），且过去针对蓝藻生成的选择作用并不明显（Wright等人，2018年，2022年；Kuo等人，2024年），但空间变化的当前选择（例如由霜冻、干旱或植食作用引起）仍然是我们观察到的城市间差异的最简洁解释。要区分这些机制，需要直接量化选择因素和种群连通性，而这超出了本研究的范围。
总之，我们的研究表明，在美国中西部城市的纵向梯度上，白三叶草的蓝藻生成变异与区域气候和人类足迹无关，城市特定因素在塑造适应性变异中起着主导作用。我们观察到的非平行模式突显了城市进化的情境依赖性，并强调了局部生态条件相对于广泛环境梯度的重要性。这些发现为越来越多的证据提供了支持，表明仅凭区域环境模式往往无法预测城市进化，需要详细了解局部情况才能理解和预测适应性反应。随着城市化在全球范围内的持续扩展，理解这些局部情况对于保护生物多样性和有效管理城市生态系统至关重要。
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