模式识别受体（PRR）配体代表了一类有前景的免疫刺激剂。本文证明，PRR配体的共价偶联能够实现受体的协调性激活，并将免疫应答增强至非偶联混合物无法达到的水平。研究人员合成了一个由靶向特定胞外和胞内PRR的明确成对激动剂组合组成的聚焦嵌合PRR配体面板。通过在人类外周血单个核细胞（PBMC）中进行表型筛选，研究人员鉴定出能够诱导独特细胞因子特征并增强细胞毒性免疫活性的偶联物。其中，嵌合TLR4/TLR7和TLR7/RIG-I（RIG-I）配体在体外引发了广泛的先天免疫激活，并在小鼠疫苗接种模型中增强了抗原特异性免疫应答。值得注意的是，在B16F10同系黑色素瘤模型中，瘤内注射偶联的TLR4/TLR7配体产生了显著的抗肿瘤活性。总而言之，这些发现确立了共价PRR配体偶联作为一种强大的化学策略，可用于调控先天免疫信号，并支持将偶联的PRR配体开发为下一代疫苗佐剂和免疫治疗剂。
一、研究背景、问题与研究意义
先天免疫系统的激活对于有效的疫苗接种和免疫疗法至关重要，这通常通过佐剂或免疫治疗剂实现，这些物质模拟病原体相关分子模式（PAMP）并激活免疫细胞（特别是树突状细胞，DC）中的模式识别受体（PRR），如Toll样受体（TLR）、核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体（NLR）和视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLR）。PRR激活后触发两条先天免疫信号通路：核因子κB（NF-κB）和干扰素调节因子（IRF），提供了决定适应性免疫应答类型、强度和持久性所必需的初始信号。合成PRR配体，特别是靶向TLR4、TLR7和TLR9的配体，作为疫苗佐剂或免疫治疗剂被广泛研究，是有前景的候选者，但常常引发次优的应答。此外，过度激活可能引发全身性炎症，而重复刺激可能导致免疫耐受。在自然感染中，呈现多种PAMP的病原体同时激活多种先天免疫受体。例如，黄热病疫苗通过多种PRR（包括TLR2、TLR7、TLR8和TLR9）激活广泛的免疫应答。通过激动剂混合物共激活不同受体可通过串扰和交叉调节增强免疫信号。然而，目前仍缺乏系统性的研究来探究将不同PRR激动剂通过共价连接形成嵌合分子后，其对免疫应答的精确调控能力和潜在的治疗优势。理解免疫受体间的相互作用对于合理设计佐剂和免疫疗法至关重要，因为有效的应答依赖于精确的协调。
本研究旨在填补这一空白，探索通过共价连接不同PRR配体构建嵌合分子，以系统地研究其如何重塑先天免疫激活，并评估其作为疫苗佐剂和免疫治疗剂的潜力。该研究为理性设计下一代免疫调节剂提供了新的化学策略和概念基础，具有重要的理论和应用价值。论文发表在《Journal of Medicinal Chemistry》上。
二、主要关键技术方法
研究人员首先设计并化学合成了一个包含九种共价偶联PRR配体的聚焦面板，这些配体由五种化学上可及的激动剂（NOD2激动剂N2、TLR1/2激动剂T1/2、TLR4激动剂前体T4、TLR7激动剂T7和RIG-I激动剂活性形式RI）通过明确的酯键或酰胺键连接而成。研究采用了分步合成策略，使用基于6-氨基己酸或聚（2-氨基乙基）醚的连接子。随后，在HEK-Blue和HEK-Lucia报告细胞系中评估了单个激动剂及偶联物的受体特异性活性。免疫刺激潜力的核心评估在人类外周血单个核细胞（PBMC） 这一原代免疫细胞模型中进行，通过多重细胞因子检测分析了13种与Th1、Th2和Th17应答相关的细胞因子和趋化因子的分泌谱，并利用针对K562癌细胞的PBMC介导的细胞毒性实验评估了抗肿瘤免疫潜力。对筛选出的优选偶联物（T4/T7、T7/RI、T1/2/T7、T1/2/N2）进行了RNA测序 以分析PBMC中的差异基因表达和通路富集。通过LC-MS分析了偶联物在PBMC中的摄取和细胞内稳定性。利用药理抑制剂 （TAK242、M5049、MRT67307）和胞吞抑制剂 （Dynasore）进行了初步机制研究。在小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC） 与从OT-II和OT-I小鼠分离的卵清蛋白（OVA）特异性CD4+ 和CD8+ T细胞共培养的外源性佐剂活性 实验中评估了抗原特异性T细胞激活。最后，在小鼠疫苗接种模型 中评估了偶联物的体内佐剂活性（测量OVA特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体滴度），并在B16F10同系黑色素瘤模型 中通过瘤内给药评估了其抗肿瘤活性。
三、研究结果
1. 设计与构建偶联PRR配体
研究人员设计并合成了一组化学定义的嵌合PRR配体，其中两个不同的小分子激动剂共价连接到一个单一结构中。目标是通过一个共同的分子框架，系统性地探究成对PRR之间的相互作用。选定了五个具有已知佐剂特性的PRR激动剂作为构建模块：N2（NOD2）、T1/2（TLR1/2）、T4（TLR4）、T7（TLR7）和RI（RIG-I）。最终得到九种偶联物：T4/N2、N2/RI、T1/2/N2、T1/2/T4、T1/2/T7、T1/2/RI、T4/T7、T4/RI和T7/RI。这些偶联物通过酯键或酰胺键连接，旨在平衡化学稳定性和生物学功能。
2. 偶联PRR配体表现出受体特异性活性
在HEK-Blue报告细胞系中的评估表明，所有偶联物基本保留了与各自靶标受体结合的能力。含有N2或T1/2的偶联物在低纳摩尔范围内表现出强大的活性，而含有T7的偶联物相对于未偶联的T7显示出增强的活性。含有T4或RI的偶联物在报告系统中表现出的明显效价较低，但这并不排除其在生理相关系统中的功能性免疫活性。
3. 偶联PRR配体诱导PBMC释放细胞因子
在人类PBMC中的评估显示，某些嵌合分子（特别是T4/T7和T7/RI）在诱导细胞因子分泌方面表现出明显的协同效应，其水平显著高于其对应的非偶联混合物。这些偶联物引发了强烈的Th1型应答，表现为白细胞介素（IL）-12p70、干扰素（IFN）-γ和IFN-γ诱导蛋白10（IP-10）的显著增加。T1/2/T7也显示出协同效应，但程度较弱。主成分分析（PCA）进一步揭示了不同偶联物诱导的独特细胞因子特征谱。
4. 偶联PRR配体增强PBMC对癌细胞的细胞毒性
在PBMC介导的K562癌细胞杀伤实验中，T4/T7和T7/RI显著增强了细胞溶解活性，这与它们强大的细胞因子诱导能力一致。T1/2/T7也显示出温和但显著的效果。而单一的激动剂或其非偶联混合物则未增加细胞毒性，凸显了嵌合偶联物的优越效力。
5. RNA测序揭示偶联物刺激的PBMC中差异基因表达
对选定的偶联物刺激后的PBMC进行RNA测序分析发现，T4/T7和T7/RI强烈诱导了Th1相关基因（如IFNG、IL12A、IL12B、TBX21）以及细胞毒性相关基因（GZMB、PRF1）的转录。T1/2/N2则选择性地引发了Th17免疫反应特征（如IL17A、IL17F、IL22）。通路富集分析进一步支持了这些偶联物对先天免疫和细胞因子信号通路的调节作用。
6. 偶联物T4/T7和T7/RI被PBMC摄取并表现出受体驱动的活性
LC-MS分析证实，T4/T7和T7/RI能够被PBMCs摄取，且细胞内完整的偶联物是主要的功能实体。药理抑制剂实验表明，抑制TLR4或TLR7信号通路能显著降低T4/T7诱导的细胞因子产生，抑制TLR7或RIG-I信号通路能降低T7/RI的活性，证明了双受体参与的必要性。抑制胞吞作用也能降低T4/T7的活性，提示受体介导的内吞作用在其中起作用。
7. 偶联PRR配体展示出外源性佐剂活性
在BMDC与OVA特异性T细胞的共培养实验中，所有测试的偶联物都显著增强了BMDC诱导抗原特异性CD4+ 和CD8+ T细胞激活和增殖的能力。不同偶联物诱导的细胞因子谱存在差异，例如T1/2/T7导致Th2和Th17细胞因子水平升高。
8. 偶联PRR配体展现出体内佐剂活性
在小鼠疫苗接种模型中，T4/T7和T7/RI作为佐剂诱导了强大的、平衡的Th1/Th2体液免疫应答，其OVA特异性IgG滴度比单独使用OVA或铝佐剂（Alum）高出数个数量级。T1/2/N2和T1/2/T7也有效，但倾向于Th2偏向的应答。与已建立的佐剂（咪喹莫特、MDP）相比，T4/T7引发了更强、更平衡的应答。
9. 偶联物T4/T7在体内表现出抗肿瘤活性
在B16F10黑色素瘤模型中，瘤内注射T4/T7和阳性对照瑞喹莫特（Resiquimod）均能显著抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期。T4/T7在第18天达到了59%的肿瘤生长抑制率，与瑞喹莫特效果相当，而T7/RI的体内抗肿瘤效果较弱。初步安全性评估未显示明显的治疗相关不良反应。
四、讨论与结论
本研究系统地探讨了通过共价连接化学和生物学上不同的PRR配体来构建嵌合分子，如何相对于非偶联的激动剂混合物重塑先天免疫激活。研究利用人类PBMC这一原代免疫细胞模型进行两阶段表型筛选，成功鉴定出多个能够诱导独特细胞因子特征和功能性免疫活性的偶联PRR配体组合。这些发现凸显了共价连接在强制受体协调性激活和实现更高级别免疫应答方面的重要性，即使靶向的PRR位于不同的细胞区室。
在评估的构建体中，TLR1/2-NOD2偶联物显示出独特地促进Th17相关免疫应答的能力，而偶联的TLR4/TLR7和TLR7/RIG-I配体则在体外引发广泛的先天免疫激活，并在体内增强了抗原特异性体液免疫应答。值得注意的是，在侵袭性强且免疫原性差的B16F10黑色素瘤模型中，瘤内施用偶联的TLR4/TLR7配体产生了显著的肿瘤生长抑制和生存期延长，为共价连接的PRR激动剂的抗肿瘤潜力提供了功能性的概念验证。
总而言之，这些发现确立了共价PRR激动剂偶联作为一种多功能和模块化的化学方法，可通过明确的激动剂配对来理性地塑造先天免疫应答。通过在不同模型中直接比较共价连接构建体与其非偶联对应物，本研究提供了关于强制共递送和PRR配体的空间组织如何调节免疫信号特征的见解。未来的研究探索连接子结构和空间参数可能会进一步优化这些应答，并实现对免疫学活性的额外微调。尽管需要进一步的机制完善、安全性评估和转化研究来推动这些分子走向临床应用，但本文描述的偶联物既代表了功能性先导结构，也为开发具有潜在用途的下一代免疫调节剂（在疫苗佐剂设计和免疫治疗策略中）提供了概念基础。
（根据论文“Conclusions”部分翻译） 在本研究中，研究人员试图通过将不同的PRR配体整合到化学定义的嵌合偶联物中来利用协同的先天免疫串扰。通过在原代人PBMC中使用两步表型筛选策略，研究人员鉴定了几种偶联的PRR配体组合，这些组合引发了不同于非偶联激动剂混合物诱导的细胞因子谱和功能性免疫活性。这些发现强调了共价连接对于强制受体协调性参与和实现更高级别免疫应答的重要性，即使当靶向的PRR位于不同的细胞区室时。在所评估的构建体中，TLR1/2-NOD2偶联物显示出独特地促进Th17相关免疫应答的能力，而偶联的TLR4/TLR7和TLR7/RIG-I配体在体外诱导了广泛的先天免疫激活，并在体内增强了抗原特异性体液应答。值得注意的是，在侵袭性强且免疫原性差的B16F10黑色素瘤模型中，瘤内施用偶联的TLR4/TLR7配体导致了显著的肿瘤生长抑制和生存期延长，为共价连接的PRR激动剂的抗肿瘤潜力提供了功能性的概念验证。总而言之，这些发现确立了共价PRR激动剂偶联作为一种多功能和模块化的化学方法，可通过明确的激动剂配对理性地塑造先天免疫应答。通过直接比较共价连接构建体与其在互补模型中的非偶联对应物，本研究提供了关于强制共递送和PRR配体空间组织如何调节免疫信号特征的见解。未来探索连接子结构和空间参数的研究可能会进一步优化这些应答，并实现对免疫学活性的额外微调。尽管需要进一步的机制完善、安全性评估和转化研究来推动这些分子走向临床应用，但本文描述的偶联物既代表了功能性先导结构，也为开发在疫苗佐剂设计和免疫治疗策略中具有潜在用途的下一代免疫调节剂提供了概念基础。
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