3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸酯(PAPS)的生物合成途径是许多生物中普遍且必需的代谢过程，为合成各种硫酸化代谢物提供所需的活化硫酸盐供体。然而，该途径在不同物种间经历了显著的进化分化。在溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)中，PAPS的合成发生在线粒体相关细胞器——有丝分裂体中，代表了谱系特异性进化适应的一个独特例子。PAPS的合成通过一个保守的两步过程进行，该过程依次由ATP硫酸化酶(AS)和腺苷-5′-磷酸硫酸酯(APS)激酶(APSK)催化。本研究重点关注溶组织内阿米巴APSK (EhAPSK)。EhAPSK含有一个额外的AS样结构域(SLD)，但其功能作用仍不清楚。
本研究解析了分辨率分别为2.60 Å的全长EhAPSK晶体结构和2.10 Å的缺失APS激酶结构域(KD)的截短型EhAPSK (EhAPSKΔKD)的晶体结构。结构分析表明，SLD与KD之间存在动态相互作用。此外，结构域缺失和突变分析表明，SLD显著影响KD的催化活性。基于这些发现，研究人员提出了一种新的调控机制，即瞬时结构域间相互作用调控APS激酶活性，代表了溶组织内阿米巴独特的进化适应。
本研究解读如下：
研究背景、问题与研究目的
硫酸化是生物分子一种重要的生化修饰，在激素调节、信号分子分泌、骨骼发育、外源性物质解毒以及多种细胞增殖分化等生理过程中起着关键作用。然而，硫酸盐化学性质稳定且反应活性低，因此必须在硫酸化反应中被转化为活化形式。硫酸盐活化途径是一个高度保守的代谢途径，普遍存在于细菌、原生生物、真菌、植物和后生动物中。在此途径中，通用的硫酸盐供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸酯(PAPS)由ATP硫酸化酶(AS)和腺苷-5′-磷酸硫酸酯(APSK)依次催化的两个连续酶促反应合成。其中，APSK催化的APS磷酸化步骤被认为是PAPS生物合成中的限速步骤。硫酸盐活化途径在不同物种中发生了进化上的多样化，形成了多种结构排列，例如在高等真核生物中，AS和APSK基因融合形成双功能PAPS合成酶(PAPSS)。
致病性兼性厌氧原生动物溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)是阿米巴病的病原体，每年导致约10万人死亡。硫酸脂质在该寄生虫的感染性包囊阶段和增殖性滋养体阶段转换中起关键作用，而硫酸脂质的合成依赖于PAPS。与多数生物体在细胞质、细胞核或质体中完成此途径不同，溶组织内阿米巴的硫酸盐活化途径定位在一种线粒体相关细胞器——有丝分裂体中，这是一种在厌氧条件下通过还原性线粒体进化产生的细胞器。此外，溶组织内阿米巴的APSK (EhAPSK)具有独特的结构特征，其N端含有一个与AS结构域(SD)同源但缺乏催化活性的AS样结构域(SLD)，与C端的激酶结构域(KD)融合。在化能自养细菌脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)的APSK中，类似的SLD被预测有助于稳定六聚体组装，但EhAPSK中SLD的功能作用尚不明确。基于此背景，研究人员对EhAPSK进行了结构和功能分析，以期阐明其独特的催化与调控机制。
关键技术与方法
研究人员为开展此项研究，运用了以下关键技术方法：
- 1.
分子生物学与蛋白制备：通过无缝连接基于同源重组的克隆技术，构建了表达全长EhAPSK、截短突变体(包括缺失KD的EhAPSKΔKD和缺失SLD的EhAPSKΔSLD)以及点突变体(E90A和Y133A)的质粒。在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达蛋白，通过镍亲和层析(IMAC)和尺寸排阻色谱(SEC)纯化获得高纯度蛋白样品用于后续分析。
- 2.
X射线晶体学：通过悬滴蒸汽扩散法获得了全长EhAPSK和EhAPSKΔKD的晶体。利用金复合物的单波长异常散射(SAD)方法解析了全长EhAPSK的相位。在SPring-8同步辐射光源的BL44XU线站收集衍射数据，使用XDS处理，通过分子置换和迭代模型构建与精修，最终确定了全长EhAPSK (2.60 Å)和EhAPSKΔKD(2.10 Å)的晶体结构。结构模型已存入蛋白质数据库(PDB ID分别为 23VK 和 23VL)。
- 3.
冷冻电子显微镜：对与配体孵育的全长EhAPSK样品进行了冷冻电镜(cryo-EM)单颗粒分析。使用配备K3探测器的Titan Krios电镜收集数据，利用cryoSPARC软件进行图像处理，包括运动校正、CTF估计、粒子挑选、二维分类、三维重建和非均匀精修，最终获得了3.44 Å分辨率的密度图，并进行了三维变异性分析以研究结构柔性。
- 4.
酶活性与动力学分析：采用偶联酶法，通过监测340 nm处NADH吸光度的下降来测定野生型和突变体EhAPSK的APSK活性。通过改变ATP或APS的浓度，测量初始反应速度，将数据拟合到米氏方程，计算了动力学参数KM、kcat和kcat/KM。
研究结果
EhAPSK的整体结构
通过X射线晶体学和冷冻电镜分析，研究人员发现EhAPSK在溶液中以同源二聚体形式存在，晶体中因堆积形成四聚体。每个单体由N端SLD (M1–E293)和C端KD (L303–K477)组成，两者由短环(I294–G302)连接。二聚体主要通过KD界面的相互作用形成，涉及I334、Y335、N345、E349、R363、F366、L370和R373等残基。EhAPSK的KD二聚体呈紧密的“闭合”构象，APS结合位点彼此靠近，这与硫杆菌、甲烷嗜热球菌、产黄青霉菌AS的变构结构域以及嗜热栖热菌PAPSS的低活性KD构象类似。而人类PAPSS、拟南芥APSK和结核分枝杆菌APSK的KD二聚体则呈“开放”构象。序列比对发现，采用“开放”构象的物种在对应于EhAPSK N345的位置均为甘氨酸，这可能导致与R363周围残基相互作用的改变，从而影响二聚体构型。
EhAPSK的SLD丧失了底物结合能力
SLD的结构与来自其他生物的SD和SLD相比，整体结构（包括Rossmann折叠）是保守的。然而，与催化活性AS相比，EhAPSK的SLD存在两个导致其失活的结构特征：首先，在催化活性AS中构成催化位点一部分并有助于与ATP相互作用的底物结合环在EhAPSK中缺失，表明其对底物的固有亲和力较低。其次，连接SLD和KD的结构域间接头在EhAPSK中更短，该缩短的接头部分覆盖了结合口袋，可能限制了底物的接近。
KD的催化位点和帽区
KD的基本激酶结构（包括P-loop）在物种间高度保守。在催化位点中心观察到一个球形电子密度，根据结晶条件（使用了K2SO4）和先前研究，被建模为硫酸根离子。该硫酸根离子通过氢键与P-loop中G312到S316的骨架原子以及K315的侧链稳定。与拟南芥APSK的AMP-PNP结合结构比较表明，该硫酸根结合位点对应于ATP的β-磷酸基团。在催化过程中，此位点捕获β-磷酸基，从而将γ-磷酸基定向朝向APS以促进反应。位于KD催化位点上方的帽区(T410–D440)的电子密度未观察到，表明该区域在无配体结合时是柔性的，这与脱氮硫杆菌APSK和产黄青霉菌APSK的报道一致。尽管在APS和AMP-PNP存在下结晶，但结构中未观察到配体密度，可能原因是晶体堆积使相邻二聚体的SLD尖端靠近APS结合位点，产生了空间位阻，以及结晶条件中的硫酸根离子可能占据了活性位点。
SLD-KD结构域间相互作用的功能作用
结构分析发现，在同一单体内SLD与KD之间没有显著的相互作用，但在相邻单体间的SLD与KD界面，存在一个以E90和Y133为中心的强相互作用网络。特别是Y133的主链与另一个单体的E324和R325形成氢键，其侧链与另一个单体的V459发生疏水相互作用。E90与Y133形成氢键，同时与V317发生疏水接触。这些相互作用有助于约束两个结构域的相对位置。
为了阐明其功能作用，研究人员解析了缺失KD的突变体EhAPSKΔKD的晶体结构。尽管SLD整体结构几乎相同，但在EhAPSKΔKD中，E90和Y133的构象发生改变，两者间的氢键无法形成。这表明Y133在SLD中与KD的E324和R325相互作用并被向上协调，从而使得E90和Y133之间能够形成氢键，进而形成上述结构域间相互作用。此外，X射线晶体学分析表明，EhAPSKΔKD的B因子（分子柔性指标）显著降低至约55 Å2，而全长EhAPSK的B因子较高，这表明全长蛋白中结构域间环具有灵活性，反映了相对的结构域运动。
冷冻电镜的三维变异性分析也支持了结构域间的灵活性。分析发现SLD相对于KD发生相对运动，主要分为两个成分：一是SLD向KD靠近，二是SLD横向移动。SLD与KD的相对位置变化可达约5.4 Å的距离和14°的角度。
酶活性测定和动力学参数分析表明，与野生型相比，缺失SLD的突变体EhAPSKΔSLD以及点突变体E90A和Y133A的kcat值均显著降低（降低了约21至60倍，甚至两个数量级），KM值也大幅降低。但kcat/KM与野生型相比变化不大，表明KM的降低归因于kcat的下降，而非底物结合亲和力的改变。虽然EhAPSKΔSLD易聚集，其结果可能受蛋白质不稳定性影响，但不易聚集且对整体结构改变极小的单点突变体的结果明确显示，SLD通过E90和Y133与对侧单体KD的相互作用，显著增强了激酶活性。
在结构类似的嗜热栖热菌PAPSS中，对应于EhAPSK Y133的Y142有助于结构域间相互作用，但未报告与对应于E90的K80的相互作用。在脱氮硫杆菌APSK中，对应于E90的E106是保守的，但对应于Y133的残基被P142取代，未观察到等效的相互作用。因此，本研究发现的结构域间相互作用是EhAPSK独特的结构和功能特征。
讨论与结论
本研究对溶组织内阿米巴硫酸盐活化途径关键酶EhAPSK及其突变体进行了结构和活性分析，结果深入揭示了EhAPSK介导PAPS合成的机制。EhAPSK展现出的特性反映了其对该生物独特的细胞器环境（如有丝分裂体）的适应性。
在KD催化位点观察到的球形电子密度表明，ATP的磷酸基团在催化过程中被P-loop锚定，这暗示无机磷酸盐(Pi)可能产生竞争性抑制。在硫酸盐活化途径中，AS产生APS和焦磷酸(PPi)，随后PPi被无机焦磷酸酶(IPP)水解为Pi，导致每个PAPS合成会在有丝分裂体中积累两个Pi。积累的Pi可能抑制APSK，降低硫酸盐活化效率。因此，维持有丝分裂体内的Pi稳态可能是必需的，有丝分裂体磷酸盐载体EhPiC可能对维持高效的硫酸盐活化至关重要。但该竞争性抑制观点尚属推测，需进一步研究。
全长EhAPSK晶体结构中较高的B因子以及冷冻电镜三维变异性分析结果表明，在溶液中SLD相对于KD的位置具有显著的结构柔性。这与脱氮硫杆菌APSK形成鲜明对比，后者的SLD与相邻单体的KD紧密结合，并被认为可稳定六聚体组装。因此，二聚体EhAPSK中SLD与KD之间的灵活性表明其功能作用与脱氮硫杆菌APSK不同。突变分析证明，EhAPSK中的SLD通过与对侧单体KD的相互作用来增强激酶活性。
综合这些发现，研究人员提出存在一种瞬时结构域间相互作用，可正向调控酶活性。其机制模型可解释为：在无配体状态下，SLD相对于KD波动。当SLD靠近KD时，Y133通过与KD中E324和R325的相互作用被约束朝向E90。随后，Y133和E90之间形成氢键，这使得E90侧链的脂肪族部分朝向V317，形成有利的非极性接触，从而稳定SLD-KD界面。AlphaFold2预测SLD尖端与KD帽区之间存在潜在的相互作用。这种稳定作用可能促进催化位点附近残基间的相互作用，从而增强催化活性。这种调控机制在其他生物中尚未见报道，表明它是首次在溶组织内阿米巴中发现的一种新的酶调控机制。然而，SLD影响催化位点的精确相互作用尚不清楚，因此，对底物结合复合物的进一步结构研究和分子动力学模拟对于详细阐明催化机制至关重要。
研究结论：研究人员解析了溶组织内阿米巴APS激酶(EhAPSK)及其截短突变体的晶体结构，结合冷冻电镜和酶动力学分析，揭示了其N端AS样结构域(SLD)通过瞬时结构域间相互作用正向调控C端激酶结构域(KD)活性的新机制。该机制涉及SLD中关键残基E90和Y133与对侧单体KD的相互作用网络，是EhAPSK特有的结构和功能特征，代表了该病原体在独特细胞器环境（有丝分裂体）中的一种进化适应。
