女性生育力在很大程度上依赖于输卵管和子宫的健康。这些器官均由有上皮细胞衬里的肌性管道构成。本综述讨论了TMEM16A氯离子通道在这些器官的上皮细胞和平滑肌细胞中的表达，重点关注其功能与功能障碍。在输卵管中，感染和子宫内膜异位症是不孕的主要原因，而TMEM16A在其中发挥重要作用。输卵管上皮TMEM16A对于卵子和精子的健康以及发生在输卵管中的受精过程也至关重要。TMEM16A在子宫功能中的作用主要集中在平滑肌成分。TMEM16A在决定人子宫肌层动作电位（Action Potential, AP）的持续平台期成分中起主要作用。该平台期位于氯离子平衡电位-25至-30 mV，在此电位下，钙通道（Calcium Channels）活跃，允许钙内流和收缩。TMEM16A在人体分娩时表达量翻倍，这与平台期持续时间和收缩时间的大幅增加有关。钙内流的延长使得收缩幅度和持续时间增加，这对于成功的分娩似乎至关重要。
引言
哺乳动物子宫的功能是支持下一代早期发育（妊娠）并及时将新个体娩出（分娩）。输卵管和子宫壁由内衬上皮细胞的平滑肌管道构成。输卵管是受精部位，该器官的组织功能障碍和感染可导致不孕。输卵管损伤易导致异位妊娠，这可能导致胎儿丢失和输卵管切除，并对生育力产生严重后果。子宫是胚胎植入、胎儿生长和发育的部位，其平滑肌（子宫肌层）必须在整个妊娠期保持相对静息。当胎儿足够成熟，其对氧气和营养的需求超过母体供应能力时，子宫收缩力必须迅速增强，以响应尚不完善的激素和机械（牵张）信号，将胎儿娩出。分娩是一个相对短暂但复杂的过程。在分娩活跃期，宫缩强烈但必须有规律的间歇期（分钟级），以便含氧血液输送至胎盘，进而为胎儿供氧。频繁的强直性宫缩和胎儿先露部位的直接压力导致宫颈展平，并可能增加局部炎症介质。在宫颈完全扩张（第二产程）时，强烈的宫缩被更短暂的间歇所分隔，胎儿娩出。分娩后通常立即发生强直性子宫收缩，以排出胎盘并夹闭供应胎盘的子宫螺旋动脉和静脉，从而最大限度减少失血和产后出血。这些过程涉及胎儿和母亲启动的激素和炎症变化。然而，功能失调的子宫肌层收缩在产科实践中频繁发生。当分娩过早发生时，会产下脆弱的早产儿。另一方面，约36%的女性目前接受剖宫产。在因产力不足（难产）而需剖宫产的产妇中，有70%是由于宫缩不良所致。在活跃期产程中，对催产素加强无效的持续性无效宫缩（产程进展失败，FPL）需要在分娩过程中进行剖宫产。分娩时剖宫产增加了后续妊娠早产、子宫切除、产后出血和产后抑郁的风险。显然，我们需要进一步研究妊娠和分娩过程中子宫收缩的机制基础。
兴奋-收缩耦联
胞质钙离子升高是所有肌肉收缩所必需的。子宫肌层中胞质钙的增加主要发生在动作电位期间，这是长效（L型）电压门控钙通道（L-VGCCs）开放的结果。由于L-VGCCs是电压依赖性的，动作电位和收缩的启动取决于静息膜电位的水平。静息膜电位过负则无动作电位发生，而如果膜去极化达到阈值，则会出现动作电位和收缩。在啮齿动物、人类和绵羊的子宫肌层以及狒狒、豚鼠和小鼠的输卵管平滑肌中，观察到尖峰之后有一个更延长的去极化平台期（约-20至-35 mV）。这导致通过L-VGCCs的钙内流延长，从而增加收缩。在人类分娩时，平台期持续时间增加，导致更持久的收缩，有利于分娩的及时进展。平台期对于顺利分娩的重要性引出了支撑平台期的机制问题。研究表明，妊娠期大鼠子宫肌层细胞中的胞质氯离子浓度并非被动分布，而是升高了。这种升高的胞质氯离子是氯离子/碳酸氢盐交换体和钠/钾/2-氯离子交换体活性的结果。Casteels的静息膜电位测量确定了氯离子平衡电位为-20至-35 mV。因此，氯通道的开放将导致氯离子外流，使膜从静息膜电位去极化，激活L-VGCCs并引发收缩。该机制已在平滑肌细胞中使用相关交换体抑制剂得到证实。这种氯离子电导的增加可以解释大鼠和人类子宫肌层和输卵管中尖峰后的延长去极化。
上皮细胞衬于女性生殖道，对于维持输卵管中卵子、精子和受精卵的健康，以及在子宫中滋养早期胎儿直至胎盘建立都至关重要。平滑肌细胞和上皮细胞都表达一种钙激活氯通道蛋白。2008年，三个实验室鉴定出跨膜蛋白16基因的蛋白质产物，该产物满足先前在多种组织中描述的钙激活氯通道的广泛特征。这种被称为TMEM16A的钙激活氯通道蛋白引起了广泛关注。激活TMEM16A通道可导致氯离子外流和延长去极化，从而产生重要的功能后果，包括L-VGCCs的持续激活和平滑肌收缩。TMEM16A活性解释了先前发表的关于平滑肌（包括子宫肌层）中钙激活氯通道的观察结果。本综述将更新关于TMEM16A（也称为anoctamin-1, ANO1）和氯通道辅助CLCA蛋白在妊娠和分娩期间女性生殖道功能中的作用的认识。
输卵管
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纤毛上皮细胞
输卵管游离端的伞部收集排出的卵子，主要由纤毛输卵管上皮细胞完成。随后，这些细胞有力地支持卵子从伞部向子宫方向移动。受精发生在壶腹部，纤毛上皮细胞协助受精卵沿壶腹部和输卵管峡部向子宫移动。与衬于气道的上皮细胞类似，输卵管上皮细胞表达TMEM16A。
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分泌上皮细胞
在输卵管中，这些细胞释放肽、生长因子、葡萄糖、免疫因子、碳酸氢盐和氯离子，以支持卵子和精子的存活，并且对受精也至关重要。输卵管液中的氯离子是精子活力和获能所必需的。研究表明，在猕猴中，TMEM16A在输卵管的分泌上皮细胞中强烈表达，在排卵前几天达到最高水平，而在患有子宫内膜异位症的动物中，这种表达升高未能发生。氯离子通过TMEM16A外流与水分泌（通过水通道蛋白）相关，从而降低上皮分泌物的粘稠度，促进卵子/精子/受精卵的运动。在人气道上皮细胞中，炎症与TMEM16A的过度表达相关。TMEM16A与肌醇三磷酸受体相互作用，促进钙从内质网储存释放。胞质钙的增加导致上皮细胞粘蛋白释放增强，增加输卵管内容物粘稠度，降低纤毛活动，导致输卵管阻塞。虽然来自健康女性和输卵管妊娠女性的壶腹部上皮细胞中TMEM16A mRNA表达无差异，但输卵管妊娠组织上皮细胞中TMEM16A蛋白表达增加了一倍。这减慢了胚胎沿输卵管的运输，到达子宫的胚胎更少。因此，上皮细胞TMEM16A的过度表达或表达不足都可能对生育力/不孕产生重大影响。因此，调节TMEM16A活性的选择性激活剂和阻断剂有潜力改善生育力。此外，已综述了microRNAs在调节TMEM16A蛋白合成中的可能作用。miRNAs调节蛋白表达，TMEM16A表达受miRNA-9下调，而miRNA-9在炎症感染期间增强，因此可能对输卵管功能和生育力产生影响。
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精子
首次在人类精子中进行离子通道的直接膜片钳记录鉴定出一种钙激活氯通道电流，该电流可被T16Ainh-A01以及选择性较差的TMEM16A抑制剂（如尼氟酸和DIDS）阻断。TMEM16A阻断剂抑制精子活力、获能和顶体反应。尼氟酸、DIDS和T16Ainh-A01在体外阻止了受精。最近，阻断TMEM16A活性的药物（如尼氟酸和DIDS）或其他激活TMEM16A活性的药物已在治疗中得到少量应用。然而，新的努力已经启动，新开发的TMEM16A激活剂正在研究中。
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平滑肌
平滑肌构成输卵管的主要部分，包括大量内层的环行平滑肌纤维和薄层外层的纵行纤维。当输卵管接近子宫时，肌层变厚。首次记录的输卵管环行平滑肌活动显示了豚鼠、小鼠和狒狒输卵管膜电位的节律性振荡。后来在豚鼠峡部环行平滑肌中发现，每次收缩与约1.5分钟的膜电位振荡相关，从约-65 mV的静息膜电位振荡至-25至-30 mV的平台期。这些膜电位振荡的基础是钙敏感的氯离子电导增加，即钙激活氯通道。在L-VGCC阻断剂维拉帕米存在下，这种电活动持续存在。排卵后第4天，峡部区域的膜电位振荡和收缩的幅度和频率增加。所有这些实验都是在发现TMEM16A和B蛋白是先前在许多组织中已确定的钙激活氯通道的负责蛋白之前进行的。然而，这些细胞的电特性与肠道肌壁中表达TMEM16A的间质起搏细胞的电特性相似。先前的研究提供了令人信服的证据，虽然纤毛对于卵子捕获和沿壶腹部的转运很重要，但受精卵沿末端壶腹部和峡部向子宫的运输涉及平滑肌收缩，其中TMEM16A起主要作用。
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功能意义
子宫内膜异位症可影响高达10%的女性，并可能产生破坏性的长期影响，包括但不限于不孕。子宫内膜异位症是由子宫内膜样上皮细胞迁移到不适当位置引起的，最常见于腹膜和卵巢浆膜。此外，高达72%的盆腔子宫内膜异位症患者有输卵管内膜异位症的描述。它导致输卵管疤痕和/或阻塞。仅在人类和旧大陆猴中有描述，限制了对直接功能和可能减轻后果的药物的详细测试。在患有子宫内膜异位症的恒河猴中，壶腹部子宫内膜TMEM16A的排卵前升高未能发生。此外，来自子宫内膜异位症患者的腹膜液在对照组中诱发了该病。结论是腹膜液中的某种成分抑制了子宫内膜异位症中的TMEM16A蛋白表达。这些发现与子宫内膜异位症的低生育力一致。在人类中，1-2%的妊娠是异位的，主要是输卵管妊娠。在接受手术切除异位组织的女性的壶腹部组织样本中，TMEM16A表达显著升高，纤毛摆动和肌肉收缩减弱。这些样本中的纤毛摆动和肌肉收缩对TMEM16A激活剂Eact和阻断剂CaCCinh-A01有反应，支持TMEM16A在输卵管功能/功能障碍中的作用。为了研究其功能后果，该研究组使用小鼠测试了Eact和CaCCinh-A01对输卵管和子宫中胚胎运输的影响。这两种药物都独立地将留在输卵管中从未到达子宫的卵子数量减少了一半，只有12%和8%的早期胚胎成功植入子宫。因此，TMEM16A的功能似乎处于过度表达或表达不足的微妙平衡之中，因为任何一种极端都会对生育力产生显著的有害影响。
子宫
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上皮衬里
子宫的内膜由上皮细胞构成，为早期囊胚直至植入以及随后的胎盘完全形成提供必要的关键支持。在小鼠早期妊娠中，子宫内膜TMEM16A表达强烈。在妊娠第4-7天给母鼠皮下注射TMEM16A抑制剂T16Ainh-AO1，使蜕膜化率（在妊娠第8天测定）减半。在一项研究中，未在处女小鼠的子宫肌层中观察到TMEM16A表达，但氯通道辅助蛋白CLCA4在子宫内膜细胞中表达。CLCA4与调节TMEM16B功能有关，对TMEM16A无影响。在猪中，CLCA4表达增加与更大的窝产仔数相关，支持子宫内膜功能的改善。显然，需要进一步研究以增强对相关机制的理解，包括控制子宫内膜中TMEM16A、TMEM16B和CLCA4表达的因素。
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平滑肌
子宫壁为发育中的胎儿提供充足的容纳空间，肌肉成分（即子宫肌层）收缩活动的适当调节对于胎儿的健康发育和分娩过程都至关重要。在整个妊娠期间，子宫收缩必须保持适度。然后，当母体/胎盘系统无法再满足指数增长的胎儿的营养和氧气需求时，协调的收缩活动必须迅速发育，使母亲进入分娩状态。成功分娩所需的宫缩在活跃期必须足够大，将胎头向前推压以使宫颈展平和扩张。然而，由于通往胎盘的子宫螺旋动脉被厚实的收缩肌层包围，每次收缩都会压迫螺旋胎盘动脉闭合。这剥夺了胎儿的氧气，胎儿脑氧含量下降。因为宫颈扩张和胎儿下降需要数小时，宫缩之间规律、充足的间歇期对于恢复和维持胎儿脑氧合至关重要。然而，如果宫缩之间的间歇期不足，则需要在分娩时进行剖宫产。另一方面，如果驱动性宫缩微弱且母体静脉输注催产素未能增强宫缩，则需要在分娩时进行剖宫产。如引言所述，分娩时剖宫产与一系列对母亲和后代的长期不良后果相关。因此，如果我们要降低分娩时剖宫产率，就必须在分娩期间改进对子宫肌层收缩性的理解，同时关注收缩和舒张。螺旋动脉在将血液输送到胎盘血池时直径非常大，并且在人类妊娠10-12周后大部分平滑肌消失。这种结构对于最佳胎盘灌注至关重要，因为螺旋动脉平滑肌的持续存在会导致子痫前期，这是由于胎盘缺氧和功能障碍导致胎盘血管生成蛋白产生失衡，这是子痫前期的关键病因学介质。因此，健康的螺旋动脉收缩能力极弱，无法在胎盘娩出时防止大量失血，因此，在分娩期间和之后立即发生的强直性子宫肌层收缩至关重要。分娩后立即发生微弱子宫肌层收缩的后果是产后出血。尽管预防性使用目前可用的宫缩药物，产后出血仍是导致孕产妇死亡的主要原因，其发病率在全球范围内不断增加。产后立即治疗性增强子宫收缩可能是最大限度减少产后出血的一种可能机制。治疗性增加TMEM16A活性可能是当分娩宫缩微弱或产后出血威胁时增强子宫收缩的一种手段。TMEM16A作为药物靶点的潜力因其26个外显子产生的多种异构体而增强。在人类子宫肌层中，蛋白质印迹显示三条分子量分别为90、97和114 kDa的条带，均小于全长的120 kDa预期值。不同异构体的存在提高了选择性靶向特定组织（如子宫肌层）TMEM16A异构体的可能性。
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妊娠和分娩期间的子宫肌层收缩性
在所有研究的物种中，在妊娠所有阶段获得的离体子宫肌条中都会自发产生动作电位和收缩。我们在妊娠后半期直至分娩期间记录了正常功能清醒母羊子宫肌层的电活动。在整个妊娠期间，肌电图活动虽然相对较小，但以低频率发生。在分娩期间，肌电图频率和振幅显著增加。如图1C和D所示，由于TMEM16A通道活动导致的去极化平台期在分娩时增强，这与正常分娩期间TMEM16A蛋白表达翻倍相关。蛋白质印迹和免疫组化发现，在进展良好的分娩女性组织中，子宫肌层TMEM16A蛋白表达增加了两倍。这种增强的分娩表达在那些遭受产程进展失败的女性组织中未观察到。阻断这些女性子宫肌条中的TMEM16A不影响小的起搏电位或尖峰动作电位，但显著降低了动作电位的平台期成分，尤其是在分娩期间。先前报道，妊娠大鼠子宫肌层中的钙激活氯通道电流被催产素增强。我们发现催产素引起人类子宫肌层动作电位平台期成分的显著增强，而这完全被TMEM16A阻断所消除。此外，催产素诱导的平台期之间的超极化增强现在未能发生，因为它可能是由于延长的平台期启动的钙和/或电压激活钾通道活性显著增强的结果。然而，在TMEM16A阻断剂存在下，短暂尖峰动作电位和伴随的短暂小收缩持续存在。分娩宫缩与子宫平滑肌细胞中由于乳酸产生导致的细胞内酸度增加相关，这种乳酸源于分娩收缩引起的血流闭塞和由此导致的缺氧。pH值的降低可能导致这些细胞中TMEM16A活性的增加，因为这种机制发生在血管平滑肌中。这往往会增加去极化平台期的持续时间，从而增加分娩宫缩。低pH值也会影响其他离子通道，包括一些钾通道、L-VGCCs和选择性差的阳离子通道。低pH值还可以降低平滑肌中rho激酶的活性，这将降低收缩装置对钙的敏感性，从而倾向于减弱分娩宫缩。总体而言，低pH值对分娩宫缩的影响取决于多种离子通道和信号过程之间复杂的相互作用。
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平滑肌起搏
支撑子宫肌层动作电位和收缩活动自发性的缓慢去极化的机制是什么？首次报道子宫肌层动作电位和收缩之前有缓慢的自发去极化。在所有研究物种的妊娠人类和子宫肌层离体组织中，都清楚地观察到导致动作电位和收缩的自发去极化。这引发了关于支撑这些去极化的生物物理和生化机制以及细胞类型的问题。过去50年，对平滑肌组织中自发性收缩性的机制进行了深入研究。平滑肌细胞负责收缩并表达平滑肌肌动蛋白、重链肌球蛋白、钙调蛋白结合蛋白和SM22α。然而，在平滑肌组织中已鉴定出一系列成纤维细胞样干细胞。其中，那些表达受体酪氨酸激酶c-Kit和/或波形蛋白的细胞被称为Cajal间质细胞。还鉴定了表达血小板衍生生长因子受体α的细胞，表达c-Kit和CD34的细胞被称为端细胞。这些间充质干细胞都具备以下特征：具有适度的核区；具有长而分支的突起，位于平滑肌细胞之间；产生自发去极化；接收来自支配该组织的神经元的输入；并与平滑肌细胞形成间隙连接，允许Cajal间质细胞去极化“侵入”平滑肌细胞，从而使其膜电位达到L-VGCCs开放和收缩的阈值，即起搏。c-Kit突变导致动物模型器官功能障碍和/或死亡，并导致人类疾病。这证明了Cajal间质细胞在啮齿动物模型和人类结肠中的重要性。早期对从肠道平滑肌组织分离的单个Cajal间质细胞的电压钳研究证明，起搏去极化的基础是氯离子电导，钙依赖性，可被尼氟酸阻断，对硝苯地平耐药。当小鼠该基因的突变导致胃肠道起搏功能丧失和早期死亡时，证明了TMEM16A的作用。
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子宫肌层起搏
体内和离体研究清楚地证明了妊娠子宫中规律的自发性收缩。整个妊娠期间宫缩适度，分娩时强烈。那么，哪些细胞负责启动收缩，它们位于何处，以及TMEM16A是否参与起搏？具有平滑肌组织Cajal间质细胞起搏特征（如上述列表所述）的细胞已在人类、非人灵长类动物、啮齿动物和绵羊的子宫肌层中被鉴定。然而，关于神经元对起搏的贡献，胎盘形成期间的滋养层入侵导致支配子宫主体的自主神经消失。在啮齿动物中，已证明在处女小鼠的卵巢、输卵管和子宫中存在表达一种或多种上述Cajal间质细胞特性的细胞。这些Cajal间质细胞分布广泛且丰富，位于平滑肌束之间，散布在束内的平滑肌细胞之间，位于子宫内膜衬里和处女子宫的浆膜外缘。其功能后果尚不清楚。在处女小鼠中，一项研究通过免疫染色在外层和内层子宫肌层中鉴定出TMEM16A表达，但另一项研究在任一层中均未观察到表达。在具有平滑肌细胞特异性TMEM16A缺失的妊娠小鼠中，子宫肌层收缩性正常，提示是间质细胞而非平滑肌细胞介导的TMEM16A机制。对妊娠大鼠和豚鼠子宫肌层的研究确定了钙激活氯通道电流的存在。该电流仅存在于约30%的细胞中，但其来源（即子宫肌层细胞或Cajal间质细胞）未被研究。随后对人类和妊娠大鼠离体子宫肌层的研究考虑了分离细胞的形状：纺锤形平滑肌细胞或具有棘突和/或长分支突起的Cajal间质样细胞。Cajal间质样细胞不产生自发去极化，也不显示对去极化的内向电流，尽管它们具有外向钾电流。这不支持钙激活氯通道的存在。平滑肌细胞在去极化时产生动作电位并收缩。Cajal间质样细胞波形蛋白染色阳性，但c-Kit染色阴性。由于当时尚未开发出可靠的钙激活氯通道阻断剂，未测定TMEM16A表达或更选择性阻断剂的效果。在灵长类动物中，免疫组化在非妊娠食蟹猴的卵巢、输卵管和子宫中鉴定出c-Kit、波形蛋白和PDGFRα。Cajal间质样细胞，包括端细胞，存在于妊娠女性的子宫壁中。对人类子宫肌层培养后的电生理实验发现端细胞中存在钙激活氯通道电流，但缺乏L-VGCC电流。但分离自大鼠子宫的单个细胞波形蛋白染色阳性，cKit染色阴性。使用单细胞电生理学，他们未发现任何可支撑自发起搏活动的内向电流，并得出结论认为Cajal间质细胞不参与起搏过程。然而，波形蛋白也染色成纤维细胞。一项研究中分离的Cajal间质细胞cKit染色阳性。这些细胞具有自发去极化，但这是在长期培养后进行的，对培养平滑肌组织的观察需要谨慎解读。我们研究了人类子宫肌条和急性分离的细胞，在组织获取数小时内，在Cajal间质/端细胞样细胞中未观察到硝苯地平抵抗的去极化电流。
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功能意义
阐述TMEM16A对子宫功能的影响远非易事。首先，表达TMEM16A的细胞类型仍未解决：是平滑肌细胞还是间质细胞？优雅的研究提供了令人信服的证据，表明子宫的肌层收缩活动起始于大鼠胎盘部位附近的细胞。所涉及细胞的性质尚不清楚，需要进一步工作来解决这个问题。与此相关的是，观察到TMEM16A在小鼠肛门内括约肌的平滑肌细胞中表达，而非在Cajal间质细胞中表达。实验研究了平滑肌特异性TMEM16A敲除小鼠，发现子宫肌层收缩性、对催产素和前列腺素的敏感性以及窝产仔数在敲除和对照妊娠之间没有差异。此外，免疫组化TMEM16A表达在平滑肌细胞中完全缺失，但在子宫内膜中大量表达。认为子宫肌层起搏遵循经典观点的大多数其他平滑肌组织起搏活动“规则”的观点受到了质疑。在一篇详尽的、深思熟虑的综述中，认为起搏器广泛分布于整个子宫。我们在妊娠和分娩母羊中的观察结果支持这一观点。
结论
TMEM16A在女性生殖功能中起主要作用。这包括将卵子运输到输卵管中部进行受精。它对精子功能和受精过程至关重要。虽然TMEM16A在整个妊娠期间维持子宫相对静息状态的作用尚不清楚，但其在分娩时表达增强可能有助于分娩的强烈宫缩和强烈的产后收缩，防止出血。由于数十年来技术难度高的实验，多种平滑肌组织中平滑肌起搏的机制基础已得到解决。TMEM16A是主要参与者。现在需要对子宫肌层起搏机制进行类似的努力，因为它对成功分娩至关重要。积极的一面是，正在开发新的TMEM16A激活剂和阻断剂，可能提供额外的治疗机制，在早产威胁时延长妊娠，在产程进展失败时降低分娩时剖宫产率，并提供预防产后出血的新方法。明确的是，一旦动作电位尖峰启动导致钙内流，TMEM16A即参与其中。由TMEM16A导致的延长去极化平台期对于成功分娩和预防产后出血所需的子宫肌层强烈收缩至关重要。
