张玉玲|刘晓文|刘春华|陈宝贵|崔俊波
天津中医药大学附属北辰中医院，中国天津市
**摘要**
**引言**
阿尔茨海默病（AD）是一种常见的神经退行性疾病，目前仍缺乏有效的治疗干预措施。作为传统中药方剂的“回神颗粒”（HSG）在AD治疗中显示出一定的潜力，但其作用机制尚不明确。
**方法**
本研究在5×FAD小鼠模型中评估了HSG的神经保护作用。小鼠被随机分为三组：野生型对照组（WT）、AD模型组（AD）和HSG处理组。通过Morris水迷宫、开放场测试、新物体识别测试和升高加迷宫来评估认知和焦虑样行为。通过体内电生理记录评估海马区的突触可塑性。通过血液学检测和组织病理学评估毒性。全转录组测序结合基因本体论和京都基因与基因组百科全书分析确定了HSG的作用靶点和通路。
**结果**
HSG的给药改善了AD小鼠的认知表现、突触可塑性和组织学特征，且无毒性。海马组织转录组分析发现WT组和AD组之间存在178个差异表达的mRNA，其中13个mRNA在HSG处理后发生了显著变化。这些基因主要调控能量代谢、突触传递和炎症反应。
**讨论**
总体而言，这些发现表明HSG通过作用于多个生物学通路来缓解AD小鼠的认知缺陷和神经元病理变化，为其在AD治疗中的潜在临床应用提供了理论基础。
1. **引言**
阿尔茨海默病（AD）是老年人痴呆的主要原因，目前被认为是最普遍的神经退行性疾病，尚无有效的治疗方法。根据2024年中国统计年鉴，中国65岁及以上的人口约为2.1676亿，占总人口的15.4%，表明老龄化问题日益严重[1]。AD对老年人的健康和生活质量构成重大挑战。AD的发病率、患病率和死亡率正在上升，并将持续增加[2][3][4]。
AD的核心临床表现包括进行性记忆丧失和认知功能障碍，最终导致日常生活活动能力下降。病理学上，AD的特点是β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积、神经纤维缠结、突触功能障碍、神经炎症、神经递质失衡、氧化应激和自噬功能障碍[5,6]。多种生物学过程参与了其发病机制，其中神经炎症是一个关键因素[7,8]。大脑中淀粉样斑块的积累和神经纤维缠结的形成是阿尔茨海默病的标志性病理特征，可触发免疫反应，导致小胶质细胞和星形胶质细胞活化及炎症因子释放。这一连锁反应加剧了神经元损伤并加速了疾病进展[9][10][11]。先前的研究表明，与年龄匹配的非痴呆对照组相比，AD患者大脑中促炎细胞因子（如白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达显著升高[12][13][14]。AD患者大脑中的活化胶质细胞通过过度表达促炎细胞因子引发神经炎症，从而加剧兴奋毒性，导致神经退行性变化和认知障碍[15][16][17]。
目前针对AD的传统药物策略包括乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂、单克隆抗体和一些对症治疗药物[18,19]。然而，这些干预措施仅能缓解症状或有限地延缓疾病进展，无法逆转或治愈疾病。此外，它们存在副作用：例如，增强乙酰胆碱活性的多奈哌齐常引起胃肠道不适（如呕吐、恶心和腹泻）；美金刚可能引起中枢神经系统副作用（如头晕和头痛）；阿杜卡努单抗与淀粉样蛋白相关影像异常（ARIA）有关[20][21][22]。因此，寻找高效且副作用最小的新药物仍然是当前医学研究的重要挑战[23]。针对现有治疗方法的局限性，全球越来越多的研究人员关注传统中医（TCM），探索其在AD治疗中的潜在作用。同时，研究人员也越来越重视评估来自天然资源的中药化合物在AD管理中的潜在治疗价值，希望为这种复杂疾病的治疗提供新的思路和策略[24,25]。
中医治疗具有显著疗效和轻微副作用。一些研究者探索了黄芩（Scutellaria baicalensis）、银杏叶（Ginkgo biloba）和姜黄（Curcuma longa）等传统药材在AD治疗中的效果，发现它们具有神经保护作用[26]。经典中医著作《中西医学汇通录》指出，老年人精气不足，导致气血亏虚，进而引发阳能亢盛、痰瘀上扰，直接影响大脑，阻碍清窍功能，导致元神和记忆功能下降[27]。这一理论不仅阐明了痴呆的病理机制，也为现代中医治疗提供了重要理论框架。基于张锡纯教授的理论，其代表性传承人陈宝贵教授通过大量临床实践制定了“回神颗粒”（HSG）这一经验方剂。先前的研究[28][29][30]表明，HSG可通过调节气血、滋养脑髓、化痰祛瘀来改善痴呆患者的认知功能和生活质量，但其治疗机制仍不明确。
在本研究中（图1），我们在成熟的阿尔茨海默病小鼠模型（5×FAD）中评估了HSG的神经保护作用，并通过行为学、病理学、电生理学和转录组分析系统研究了其潜在机制。
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**图1. 回神颗粒（HSG）对阿尔茨海默病（AD）小鼠体重变化和焦虑样行为的影响。**
(A) 显示小鼠体重变化情况，*P < 0.05 和 **P < 0.01，正常野生型对照组（WT）与AD模型组（AD）；#P < 0.05，##P < 0.01 和 ###P < 0.001，AD组与HSG处理组（AD+HSG）。
(B) 开放场测试（OFT）的实验方案。
(C-F) 开放场测试的评估指标：场地距离（cm）、平均速度（cm/s）、中心停留时间（s）和进入中心次数。
(G-I) 升高加迷宫（EPM）测试的评估指标：平均速度（cm/s）、开放臂停留时间（%）和进入开放臂的次数。
**2. 材料与方法**
2.1. 实验动物和饲养条件
雄性C57BL/6J小鼠（6个月大，体重25–30克）购自北京维塔尔河实验动物技术有限公司（证书编号：SCXK-Jing-2022-0016）。所有小鼠在标准饲养条件下饲养，环境温度为23±1°C，相对湿度为40%-60%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。提供标准啮齿动物饲料（北京科奥饲料有限公司）和高压灭菌蒸馏水，笼子内铺有无菌玉米芯垫料，并定期更换以保持清洁干燥。从6个月大开始，使用校准电子天平（YP3002B，宁波金诺衡器有限公司）精确测量小鼠体重，精度为0.1克。连续4个月监测三组小鼠的体重，首次测量的体重作为基线体重。每隔10天测量一次，共测量12次用于统计分析。体重变化以基线体重的百分比表示，并绘制生长曲线。
2.2. 伦理声明
所有实验动物的使用均遵循天津师范大学的指导原则，并获得了相应的伦理批准（批准编号：2024082801）。实验动物的选择和处理符合伦理要求，确保实验过程中的动物福利。研究遵循ARRIVE指南，确保实验设计、实施和报告的完整性和可重复性。
2.3. 分组与模型建立
**分组：**
本研究使用了30只5×FAD转基因小鼠（C57BL/6J背景）和15只野生型（WT）C57BL/6J小鼠。实验小鼠分为三组，每组15只年龄相近的小鼠。第一组为野生型对照组（WT），未进行任何基因修饰或药物治疗。使用随机数表将30只5×FAD转基因小鼠随机分配到两组，每组样本量相同。一组未接受治疗，作为AD模型组（AD）；HSG处理组（AD+HSG）在实验期间接受腹腔给药。
**给药方式：**
从6个月大开始，AD+HSG组每天接受HSG液（中国武清区中医院制备；批准编号：Jin Yao Zhi Bei Zi Z20190001000）的腹腔给药。该治疗持续到实验结束并处死小鼠。治疗开始时（6个月大），所有小鼠的体重为26.61 ± 0.65克（平均值±标准误差）。HSG液的制备方法如下：将回神颗粒溶解在高压灭菌蒸馏水中，配制浓度为0.375 g/ml的溶液。根据小鼠体重，每30克体重给予0.2毫升溶液。剂量根据体表面积比例调整，以确保模拟人体用药条件的准确性。转换系数Rab来自剂量转换表，反映了人与小鼠之间的体表面积差异。通过以下公式计算小鼠剂量Db（mg/kg）：Db = Da × Rab [32,33]。初步数据及先前研究[29,30]共同表明，该剂量能有效改善5×FAD小鼠的认知功能并减轻AD病理表现，且无毒性作用。由于初步验证和伦理考虑，本研究未进行剂量-反应研究；由于实验设计和资金限制，未包括阳性对照（如多奈哌齐），将在后续研究中补充。
2.4. 行为测试
小鼠达到10个月大时开始行为实验。行为测试前至少一天，将小鼠转移到测试房间以适应环境。实验期间需保持安静的房间，光线明亮但柔和，并防止小鼠察觉实验者的存在。这些措施可最小化外部因素对实验结果的干扰，确保实验顺利进行和数据的准确可靠性。所有行为测试均通过摄像头捕捉小鼠的运动轨迹进行。数据使用SLY-ETS通用小型动物行为活动记录与分析系统（SLY-ETS，北京树林源技术有限公司）收集和分析。为确保实验结果的可靠性，三组小鼠按预定顺序进行行为测试。为保持小鼠在连续测试过程中的生理和心理状态，每次测试之间间隔48小时，以便充分休息和恢复。测试顺序为：Morris水迷宫（MWM）测试、开放场测试（OFT）、新物体识别（NOR）测试和升高加迷宫（EPM）测试。
2.4.1. Morris水迷宫（MWM）测试
Morris水迷宫是一个直径150厘米、高度50厘米的圆形水箱，水深保持在30厘米，温度控制在20 ± 2°C。分为四个象限：东北（NE）、东南（SE）、西南（SW）和西北（NW）。根据实验需求，在不同阶段放置直径10厘米、高度30厘米的平台。摄像机垂直安装在MWM中心上方约2米处，镜头焦距经过调整，使其视野能够覆盖整个实验区域。小鼠的游泳轨迹由摄像机捕捉，数据收集和分析由SLY-ETS系统完成。该实验包括四个阶段[34]：（1）初始空间获取训练（ISAT，5天）：水下平台固定在NE象限的中心。小鼠从四个不同的起始位置（NW、S、W、SE）进入水中进行训练，面向泳池墙壁。每天记录逃避潜伏时间和游泳速度。如果小鼠在60秒内成功到达平台并停留超过2秒，则认为它找到了平台。如果60秒内未到达平台，则潜伏时间记录为60秒，并引导小鼠在平台上停留10秒。（2）探针测试（PT，1天）：移除平台，小鼠从SW方向进入水中，面向泳池墙壁。记录1分钟内穿越平台的次数以及在目标象限内停留的时间百分比。（3）反向空间获取训练（2天）：将平台重新放置在SW象限的中心。小鼠在1分钟内找到新平台位置，遵循与初始训练阶段相同的程序和记录指标。（4）反向探针测试（1天）：再次移除平台，小鼠从NE方向进入水中。记录1分钟内穿越平台的次数以及在目标象限内停留的时间百分比。
2.4.2 开放场测试（OFT）：将小鼠面向墙壁放置在开放场识别盒的角落（尺寸：48厘米×48厘米×36厘米；盒子被划分为4×4的方格）。相关参数由SLY-ETS系统自动记录和量化，该系统跟踪小鼠身体的中心，测量总距离、平均速度、进入中心区域的次数以及在5分钟内停留的时间。在中心区域花费的时间和频率被用作探索行为和类似焦虑行为的指标（在中心区域花费更多时间或频率与较少的类似焦虑行为相关）。总行驶距离和平均速度用于评估运动功能，以及治疗或基因型对物体记忆结果的潜在基线影响[[35]，[36]，[37]]。每次测试后，用75%乙醇清洁和消毒设备，以去除任何气味线索。
2.4.3 新物体识别（NOR）测试：实验设置使用了开放场识别盒。NOR测试分为三个阶段，数据由SLY-ETS系统记录。具体步骤如下：第一天（适应阶段），小鼠被放置在盒子中面向墙壁，并允许自由探索5分钟；第二天（训练阶段），小鼠被放置在盒子中，里面有两个相同的物体，并允许自由探索5分钟；第三天（测试阶段），其中一个物体被随机替换为新的物体，小鼠被允许自由探索两个物体5分钟。一般来说，小鼠会对新物体表现出偏好。能够记住训练物体形状和位置的小鼠倾向于花费更多时间探索新物体[38]。为了评估小鼠在测试阶段的记忆表现，我们计算了以下指标：偏好指数（PI）= (Tnovel - Told) / (Tnovel + Told) * 100% [39]，时间百分比（TP）= Tnovel / (Tnovel + Told) * 100% [40,41]，识别指数（RI）= Nnovel / (Nnovel + Nold) * 100% [42]（其中Tnovel和Told分别代表探索新物体和熟悉物体的时间，Nnovel和Nold代表涉及新物体和熟悉物体的探索事件频率）。试验之间，用75%乙醇彻底清洁场地和物体。
2.4.4 高架十字迷宫（EPM）测试：为了进一步评估类似焦虑的行为，我们使用了高架十字迷宫（EPM）测试。使用的设备是专门为小鼠设计的十字迷宫，包括三个部分：两个开放臂（50厘米×10厘米×0.5厘米高），两个封闭臂（50厘米×10厘米×40厘米）和一个中央方形平台（10平方厘米）。小鼠被放置在中央平台上，面向开放臂。我们记录了小鼠的平均速度、在开放臂和封闭臂中花费的时间以及在300秒内的进入次数。每次测试后，用75%乙醇清洁迷宫[36,37,43]。
2.5 体内电生理记录：小鼠用30%乌拉坦（4毫升/千克，腹腔注射；上海Aladdin生化科技有限公司，中国）麻醉，然后固定在立体定位装置（Narishige SN-3，日本）上。根据小鼠大脑图谱，在小鼠头皮上切开一个切口，并在头骨右侧钻两个小孔以植入电极。一个双极刺激电极缓慢植入穿孔路径（PP：前囟门3.8毫米，中线外侧3毫米，硬膜下1.5毫米），另一个电极插入齿状回（DG：前囟门2.0毫米，中线外侧1.4毫米，硬膜下1.5毫米）。根据信号波形确定最佳位置。PP刺激可以在海马DG区域诱导场兴奋性突触后电位（fEPSPs）。这些电位的幅度用于评估突触效应。在每30秒一次的单脉冲刺激下（PowerLab，AD Instruments，澳大利亚），提供能够引起70%反应的最大幅度（0.3-0.5毫安）的最佳刺激强度，并记录10分钟的基线。然后，给予theta爆发刺激（TBS，频率200赫兹，每次爆发12个脉冲，爆发间隔200毫秒）以诱导长期增强（LTP），并每分钟记录一次，总共持续1小时。所有数据的原始分析使用Clampfit 10.2（Molecular Devices，Sunnyvale，CA，美国）进行[36,42,44]。
2.6 血液学分析：我们使用玻璃毛细管从眼球后面的静脉丛抽取血液。每30克小鼠抽取200微升血液。血液收集完成后，移除毛细管，并用干净的无菌棉球轻轻按压小鼠的闭合眼睛以止血[32,45,46]。样本立即转移到EDTA涂层的一次性血液收集管中以防止凝固，并使用Sysmex XN-1000V自动血液分析仪（Sysmex Corporation，Kobe，日本）分析以下血液学参数：红细胞计数（RBC）、血细胞比容（HCT）、血红蛋白浓度（HGB）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度（RDW）、有核红细胞（NRBC）、白细胞计数（WBC）、中性粒细胞（NEUT）、淋巴细胞（LYMPH）、单核细胞（MONO）、嗜酸性粒细胞（EO）、嗜碱性粒细胞（BASO）、血小板计数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血小板比容（PCT）。
2.7 苏木精-伊红染色（HE染色）：电生理实验后，确认小鼠处于深度麻醉状态。迅速打开胸腔以暴露心脏和升主动脉。心脏用1×磷酸盐缓冲盐水（1×PBS）灌注，然后注入4%甲醛（PFA，Fuchen（天津）化学试剂有限公司，天津，中国）。随后，迅速切除大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏。取出一半的大脑，并使用RNAwait（SR0020，北京Solarbio科技有限公司，中国）保存海马体，储存在-80°C。将大脑的另一个半球和其他组织用PFA固定24小时。然后将样本转移到10%、20%和30%蔗糖溶液中（溶解在1×PBS中）进行梯度脱水，直到样本沉到底部。使用手术刀修剪样本，并将其嵌入冷冻切片包埋介质（OCT；目录号C0171A-118ml，Beyotime，中国），并在-80°C下长期保存。使用冷冻切片机（Leica，德国，CM1860）制备20微米厚的冷冻切片，并将其安装在玻璃载玻片上，储存在-20°C。根据制造商的协议，使用苏木精和伊红（HE）染色试剂盒（G1120，北京Solarbio科技有限公司，中国）对切片进行染色。脱水、透明化和染色后，在显微镜下检查不同组小鼠的心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织的形态差异。此外，还评估了海马CA1区域的细胞形态、水肿的存在和核收缩[[47]，[48]，[49]，[50]]。
2.8 全转录组测序（RNA-Seq）：标准化后，样本被送往上海Personal Biotechnology有限公司（Personalbio，上海，中国）进行全转录组测序。每组的n=3个生物学重复样本是基于先验功效计算（使用G*Power 3.1）和参考类似发表的5×FAD小鼠的转录组研究[[51]，[52]，[53]]确定的。然而，小样本量（n=3）可能会限制检测到变化较小的基因并降低统计功效，这是本研究的局限性。原始数据和初步生物信息学分析由Personalbio提供，包括质量控制措施、与参考基因组（Mus_musculus.GRCm39.dna.primary_assembly.fa）的对齐、差异表达分析以及基因功能注释和通路富集分析，以阐明转录组数据的生物学意义。使用Nanodrop分光光度计（Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国）和Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies Inc.，加州，美国）评估提取的小鼠海马总RNA的完整性和纯度。按照既定协议进行文库构建和后续质量评估，并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。样本被测序以生成FASTQ格式的原始数据。这些原始数据包含适配器污染和低质量读段，使用fastp进行过滤。移除了具有3′端适配器和平均质量分数低于Q20的读段，以获得干净的数据，作为所有后续高质量分析的基础。参考基因组和基因模型注释文件直接从基因组网站下载。HTSeq（v2.1.0）用于构建参考基因组的索引，并将配对端干净读段与之对齐。HTSeq（v0.9.1）用于计算映射到每个信使RNA（mRNA）基因的读段数量作为原始表达水平。应用FPKM标准化使基因表达水平在基因和样本之间具有可比性[54]。DESeq（v1.38.3）根据|log2FoldChange| > 1和P值< 0.05的标准分析组间的差异表达。对于长非编码RNA（lncRNAs），使用Stringtie（v2.2.1）在转录水平上计数读段作为原始表达，然后进行FPKM标准化。再次使用DESeq（v1.38.3）进行lncRNA表达的差异表达分析，标准相同。根据预测的不同表达lncRNAs的顺式和反式靶基因结果，将选定的差异表达mRNAs与预测结果整合进行进一步筛选。这一步旨在识别在高表达水平上、在不同组间显示出显著差异的mRNAs，并与顺式或反式靶基因的预测结果匹配。所有RNA-seq分析都应用了FDR校正（Benjamini-Hochberg方法，FDR < 0.05），除了原始标准|log2FoldChange| > 1和原始P < 0.05。为了理解与mRNA差异表达基因（DEGs）相关的生物学功能和通路，进行了基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。topGO（v2.50.0）用于GO富集分析，通过超几何分布方法计算P值（P值< 0.05的显著富集）以识别显著富集的GO术语并确定DEGs的主要生物学功能。Cluster Profiler（v4.6.0）用于KEGG通路富集分析，重点关注P值< 0.05的通路。
2.9 逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）：根据制造商的说明，使用RNAiso Plus Reagent（代码号9108/9109，Takara Bio，北京，中国）从小鼠海马中分离总RNA。1微克总RNA用gDNA Eraser处理，并用PrimeScript™ FAST RT Reagent Kit（代码号RR092A，Takara Bio，北京，中国）进行逆转录。所得cDNA使用TB Green® Premix Ex Taq™（代码号）进行qRT-PCR。RR420A（Takara Bio，北京，中国）在QuantStudio TM 1 Plus实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，上海，中国）上进行40个循环的反应，遵循制造商的协议。所有引物均由GENEWIZ（苏州，中国）合成，序列设计使用NCBI Primer-BLAST，并验证了其有效性、特异性和可靠性（附录表1）。2.10 数据处理和统计分析在本研究中，所有数据均表示为平均值±标准误差（SEM）。数据的时间变化分析采用双因素重复测量方差分析（ANOVA）方法进行。对于非重复测量数据，统计方法的选择基于正态性和方差同质性的评估。正态性使用Shapiro-Wilk检验进行评估，方差同质性使用Bartlett检验进行评估。对于满足正态性和方差同质性假设的数据，使用单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较，然后使用Tukey检验进行多重比较。对于不遵循正态分布但违反方差同质性假设的数据，应用Welch的ANOVA，然后使用Dunnett T3检验进行多重比较。对于不遵循正态分布的数据，使用非参数Kruskal-Wallis H检验，然后使用Dunn检验进行多重比较。RNA-seq差异表达分析按照上述方法进行。对于所有其他实验数据，使用未调整的p值，统计显著性定义为p < 0.05。所有统计分析均使用SPSS 21（IBM Corp.，阿蒙克，NY，美国）和GraphPad Prism 10.1.2（GraphPad Software，圣地亚哥，CA，美国）进行。所有检验的显著性水平设定为p < 0.05。3. 结果3.1 不同处理方法对小鼠体重变化的影响我们首先监测了6个月大小鼠的体重，并在10天间隔内比较了野生型（WT）、阿尔茨海默病模型（AD）和HSG处理的AD（AD+HSG）组之间的变化（图1A）。结果表明，小鼠的体重随时间显著变化（F (1.81, 65.3) = 21, p < 0.001），但时间和组之间的交互作用不显著（F (3.63, 65.3) = 9.59, p < 0.001），表明各组的体重变化模式相似。在实验期间，WT组的小鼠体重稳步增加，平均增重23.2%，反映了在标准条件下的正常生长。相比之下，AD组的小鼠体重增加明显受到抑制，平均增重仅为2.3%，显著低于WT组（p < 0.01），证实了5×FAD转基因模型对生理状态的负面影响。AD+HSG组的小鼠体重增加为2.1%，与AD组没有显著差异（p > 0.05），但仍显著低于WT组（p < 0.001）。3.2 不同干预措施对小鼠类似焦虑行为的影响为了研究5×FAD转基因模型和HSG给药对焦虑或运动能力的影响，我们使用OFT和EPM来评估类似焦虑的行为和探索行为。在OFT实验中（图1B），我们通过测量总行驶距离和平均速度来评估小鼠的运动活动，以及类似焦虑的行为指标，特别是在中部区域停留的时间和进入该区域的频率。通常，中部区域停留时间减少和进入次数减少表明类似焦虑的行为增强。图1C-F显示，三组小鼠在总行驶距离（F(2, 37) = 0.99, p = 0.38）、平均速度（F(2, 37) = 0.99, p = 0.38）、在中部区域停留的时间（Kruskal-Wallis检验：H = 0.18, p = 0.92）和进入中部区域的次数（F(2, 37) = 0.90, p = 0.41）方面没有统计学上的显著差异。EPM实验作为评估类似焦虑行为的次要方法，我们测量了三组的平均速度（F(2, 36) = 0.34, p = 0.72）、在开放臂中停留的时间（F(2, 36) = 0.62, p = 0.55）和进入开放臂的次数（F(2, 36) = 1.36, p = 0.27），同样没有观察到显著差异（图1G-I）。这些结果表明，实验组之间的运动能力或焦虑水平没有显著变化，表明HSG的给药和基因型对这些参数没有显著影响。3.3 HSG对5×FAD小鼠记忆表现和海马突触可塑性的影响3.3.1 Morris水迷宫测试认知障碍是阿尔茨海默病最显著的特征之一。通过灌胃给小鼠施用HSG四个月后，进行了行为实验以评估HSG是否能改善这些小鼠的学习和记忆能力。MWM测试被用作评估HSG对空间记忆影响的主要方法，这与海马功能密切相关（图2A）。重复测量ANOVA的结果（图2D）显示，三组小鼠的逃避潜伏期随时间显著变化（F (4,124) = 28.933, P < 0.001），时间和组之间的交互作用不显著（F (8,124) = 0.935, P = 0.49），表明时间对不同组的影响没有显著差异。此外，组间逃避潜伏期存在显著统计学差异（F (2,31) = 12.494, P < 0.001）。在初始空间获取训练和反向空间获取训练期间，AD组的逃避潜伏期显著长于WT组（第2天：p < 0.05；第3天：p < 0.01；第4天：p < 0.01；第5天：p = 0.086；第8天：p < 0.0001）。HSG给药后，小鼠的逃避潜伏期缩短（第2天：p < 0.05；第4天：p < 0.05；第5天：p = 0.071；第8天：p < 0.0001）。在任何给定的一天中，组间的平均游泳速度没有显著差异，表明没有运动障碍或组间差异（图2D）。在探针测试（PT）和反向探针测试（RPT）中，移除平台后，AD组在目标象限停留的时间少于WT组（PT：p < 0.05，图2C；RPT：p < 0.05，图2F），并且跨越平台的次数也较少（PT：p < 0.05，图2B；RPT：p < 0.05，图2E）。与AD组相比，AD+HSG组在目标象限停留的时间更长（PT：p < 0.05，图2C；RPT：p < 0.05，图2F），并且跨越平台的次数更多（PT：p < 0.001，图2B；RPT：p < 0.01，图2E）。AD组的记忆学习能力明显低于WT组，HSG可以缓解AD小鼠的记忆功能衰退。此外，代表性游泳轨迹图也显示了相同的结果（图2G）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图2. HSG可以改善5×FAD小鼠的学习和记忆障碍。（A）Morris水迷宫（MWM）测试的实验方案。（B, C）MWM测试探针测试阶段在目标象限和平台跨越的时间百分比，*P < 0.05。（D）MWM测试初始空间获取训练阶段和反向空间获取训练阶段的逃避潜伏期和游泳速度，*P < 0.05，**P < 0.01和****P < 0.0001，WT组与AD组；#P < 0.05和####P < 0.001，AD组与AD+HSG组。（E, F）MWM测试反向探针测试阶段在目标象限和平台跨越的时间百分比，*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。（H）MWM测试的实验方案。（I-L）新物体识别（NOR）测试在不同测试阶段的性能：偏好指数（%），时间百分比（%）和识别指数（%），*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。3.3.2 新物体识别测试此外，还使用NOR测试来评估小鼠的记忆能力（图2H）。在测试阶段，WT组和AD+HSG组之间的识别指数（PI, RI, TP）没有显著差异（图2I-K），表明两组的新的物体识别能力大致相同。AD组的小鼠探索新物体的时间少于WT组（PI：p < 0.05，RI：p < 0.05，TP：p < 0.05）。与AD组相比，AD+HSG组的小鼠显示出显著更高的识别指数（PI：p < 0.001，RI：p < 0.01，TP：p < 0.001）。这些数据表明HSG可以缓解5×FAD模型引起的记忆缺陷。3.3.3 体内电生理记录突触可塑性被认为是记忆形成和认知的细胞基础，LTP是介导学习和记忆的主要机制。如图3A中的轨迹图所示，我们对海马体的PP区域施加单脉冲刺激以诱导DG区域的基线fEPSP，记录10分钟，然后给小鼠TBS刺激，成功诱导DG区域的LTP（记录60分钟），作为评估突触可塑性的指标。因此，TBS刺激后，fEPSP的幅度增加，斜率也增加（图3B）。图3B是LTP最后10分钟记录的fEPSP斜率的标准化统计图，结果显示AD组的fEPSP斜率显著低于WT组（p < 0.05），而AD+HSG组的斜率相对于AD组有所恢复（p < 0.05）。下载：下载高分辨率图像（905KB）下载：下载全尺寸图像图3. HSG对5×FAD小鼠海马神经元的影响。（A）theta爆发刺激（TBS）前后代表性场兴奋性突触后电位（fEPSP）轨迹。（B）TBS后最后10分钟的平均标准化fEPSP斜率，*p < 0.05。（C）从穿孔路径到齿状回的长期增强阶段fEPSP斜率的变化。（D）三组小鼠脑组织CA1区域的Hematoxylin-eosin（HE）染色图像。a）50倍放大下的小鼠海马整体图像，黑色框表示CA1区域的位置。刻度尺：250μm。b-d）200倍放大下的CA1区域HE染色图像，分别代表WT组、AD组和AD+HSG组。刻度尺：75μm。3.4 HSG的毒理学研究：在小鼠模型中未观察到明显的毒性在显微镜下观察了三组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏组织的组织形态。结果显示，这些器官的组织形态没有显著差异。可以看出，这种药物对小鼠的上述器官没有明显的毒性作用（图4A）。此外，我们还观察了小鼠海马CA1区域的细胞形态（图3D）。与WT组相比，AD组海马CA1区域的锥体神经元数量显著减少，染色不均匀，神经元丢失明显，排列紊乱。HSG处理后，小鼠海马CA1区域的锥体细胞数量增加，排列更加规则，细胞丢失减少。下载：下载高分辨率图像（3MB）下载：下载全尺寸图像图4. HSG对小鼠没有明显的毒性和副作用。（A）100×或200倍放大下的小鼠海马代表性HE染色图像，右上角有刻度尺。（B）显示小鼠的血液学分析比较。数据以平均值±SEM表示，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。在本研究中，详细比较了三组小鼠的血液学指标（图4B，附录表-2）。三组小鼠的中性粒细胞（NEUT）和淋巴细胞（LYMPH）水平存在显著差异。其他指标没有显著差异。AD组的NEUT显著高于WT组（计数P < 0.01，百分比P < 0.001），而AD组的Lymph低于WT组（百分比P < 0.01）。给药后，与AD组相比，AD + HSG组的NEUT降低（计数P < 0.05，百分比P < 0.001），Lymph增加（计数P < 0.001，百分比P < 0.0001）。3.5 HSG在AD中的治疗靶点和机制为了研究转录状态与5×FAD转基因基因型之间的关系，以及HSG治疗对AD小鼠的潜在治疗效果，我们对WT、AD和AD + HSG组的海马组织进行了全转录组分析（图5A）。通过比较WT组和AD组之间的测序数据，我们确定了AD模型中表达显著变化的mRNA基因。进一步比较AD组和AD + HSG组后，我们发现了HSG治疗后差异表达的mRNA基因，这有助于评估HSG对AD的治疗效果及其潜在机制（图5B）。通过两个比较组之间的DEGs交集，我们可以预测HSG可能逆转AD的病理和生理变化的分子途径。下载：下载高分辨率图像（888KB）下载：下载全尺寸图像图5. 各组间mRNA表达的差异分析。（A）全转录组测序的样本处理示意图，每组小鼠使用三个样本进行测序。（B）基因组圆图：根据基因组信息和mRNA差异表达分析结果标记差异表达的mRNA。最外层是染色体带，从外到内的结果是不同的差异分析结果。红色和绿色条形分别代表上调和下调基因的log2Foldchange值，而灰色条形代表无差异表达基因的log2Foldchange值的散点图。（C）不同组（WT、AD、AD+HSG）样本的聚类分析结果。每一行代表一个基因，每一列代表一个样本。绿色表示下调基因，红色表示上调基因（P < 0.05）。（D）维恩图显示了每个比较组之间识别的mRNA DEGs的数量，以及比较组之间的交集关系。（E、F）DEGs的火山图：x轴显示log2(Fold Change)，y轴显示−log10(P-value)。两条垂直虚线标记了两倍变化阈值，一条水平虚线表示P = 0.05的显著性阈值。红色点表示治疗组中上调的基因，蓝色点表示下调的基因，灰色点表示无显著差异表达的基因。根据|log2FoldChange| > 1和P-value < 0.05的筛选条件，我们分析了差异表达的mRNA基因。结果显示，与WT组相比，AD组检测到178个DEGs（图5E），其中123个基因上调，55个基因下调。此外，结果还显示，在AD组中，Small Muscle Protein X-linked (Smpx)和Lymphocyte antigen 6 family member D (Ly6d)基因的表达显著上调，但由于它们在WT组中未检测到表达，因此无法计算log2FoldChange值。short stature homeobox 2 (Shox2, log2FoldChange = 6.595)和abhydrolase domain containing 12B (Abhd12b, log2FoldChange = 5.698)基因也显示出显著上调。相反，FAT atypical cadherin 2 (Fat2, log2FoldChange = -4.979)、Peripheral Myelin Protein 22 Interacting Protein (Pirt, log2FoldChange = -4.728)和chromosome 5 open reading frame 47 (C5orf47, log2FoldChange = -4.003)基因的表达显著下调。这些基因可能作为AD诊断和治疗的潜在靶点。与AD组相比，AD + HSG组共检测到372个DEGs（图5F）：270个上调，102个下调（图4b, d）。在AD + HSG组中，RIKEN cDNA 9130008F23基因（9130008F23Rik）、Tyrosinase-related protein 1 (Tyrp1)、Transmembrane Protein 102 (Tmem102)和ATPase H+ Transporting V0 Subunit D2 (Atp6v0d2)的表达显著上调（它们在AD组中的表达未检测到，因此无法计算log2FoldChange值），而Histocompatibility 60b (H60b, log2FoldChange = -4.54)、Ovo-like 2 (Ovol2, log2FoldChange = -3.295)和Keratin 80 (Krt80, log2FoldChange = -3.025)的表达显著下调。这些变化与HSG的机制有关，它们可能作为评估治疗效果的潜在生物标志物。图5C展示了比较组间DEGs和样本的双向层次聚类结果，清楚地显示了不同队列之间基因表达模式的相似性和差异性。分析表明，AD + HSG组与WT组的聚类更为紧密，而AD组和WT组之间观察到了差异，表明HSG可能对小鼠具有保护作用。基于差异表达分析结果，我们接下来列举了每对比较之间共有的显著DEGs，并检查了它们的重叠部分。我们确定了“WT组 vs AD组”和“AD组 vs AD + HSG组”比较中共同的41个DEGs，旨在筛选与HSG治疗AD强相关的基因（图5D）。为了全面系统地解释HSG治疗AD的潜在机制，并识别与整个基因组背景相比在DEGs中显著富集的GO术语，我们对“WT组 vs AD组”和“AD组 vs AD + HSG组”中的DEGs进行了GO富集分析，并根据分子功能（MF）、生物过程（BP）和细胞组分（CC）对它们进行了分类。条形图显示了BP、CC和MF中基因计数最高的10个富集项，而气泡图显示了富集最显著的20个GO Term条目。首先，我们分析了WT组和AD组之间的基因表达差异，旨在识别病理条件下的显著变化，并为确定AD发病的分子机制提供重要线索。与WT组相比，AD组中的DEGs（图6A, B）在多个BP中显著富集，包括运动行为、管状形态发生、解剖结构形态发生、B胰腺细胞增殖和血管生成，这些涉及细胞代谢、细胞增殖、形态变化和细胞间相互作用。同时，这些DEGs也在许多CC中富集，如收缩纤维、肌纤维、神经元突起、细胞外围和树突，参与细胞连接、膜成分和细胞骨架组成。此外，这些基因也在一些MF中富集，包括钙离子结合、阳离子结合、金属离子结合、离子结合和semaphorin受体活性，在细胞信号转导的成分和功能调节中起重要作用。下载：下载高分辨率图像（964KB）下载：下载全尺寸图像图6. 分析AD小鼠中差异表达的转录组数据通路。（A）WT组和AD组之间差异表达基因（DEGs）的基因本体论（GO）富集分析：细胞组分（CC）、分子功能（MF）和生物过程（BP）。每个GO类别中P值最小的前10个GO Term条目（即富集最显著的）。（B）富集最显著的20个GO Term条目。Term（y轴）；富集因子（x轴）：富集因子是指在此GO Term中富集的DEGs数量与注释的DEGs数量之比；FDR（颜色变化）：校正后的P值，越接近0，富集越显著。气泡的大小表示在该通路中富集的基因数量。（C）京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析：p值最小的前30条通路，即富集最显著的通路。通路（x轴），-log10(p-value）（y轴）。不同颜色代表不同的生物类别。（D）富集最显著的20个KEGG通路。富集因子（x轴），通路（y轴），FDR（颜色变化）。气泡的大小表示在该通路中富集的基因数量。随后，我们分析了AD组和AD + HSG组之间的基因表达差异。这种比较有助于揭示HSG治疗对AD病理状态的潜在机制。HSG的靶点（图7A, B）主要富集在BP中，如免疫系统过程、对外部刺激的反应、免疫反应、对生物刺激的反应等。它们在细胞外区域、细胞外空间、含胶原蛋白的细胞外基质、细胞外基质和细胞表面等中丰富。此外，我们还发现这些靶点具有MF，如细胞粘附分子结合、整合素结合、信号受体结合、蛋白质结合和肽酶调节活性。这些靶点参与重要的生物功能，如外部刺激的感知、反应和免疫调节，在细胞外基质的形成和维持、细胞表面的信号转导和细胞粘附以及蛋白质相互作用等过程中起重要作用。下载：下载高分辨率图像（1001KB）下载：下载全尺寸图像图7. 分析HSG处理小鼠中差异表达的转录组数据通路。（A, B）AD组和AD+HSG组之间DEGs的GO富集分析。（C, D）KEGG通路富集分析。为了更深入地了解DEGs的功能并探究其机制，我们使用KEGG进行了通路富集分析。如图6C和图7C所示，我们以条形图格式展示了p值最小的前30条通路，并将它们分为五类：细胞过程、环境信息处理、人类疾病和有机体系统。气泡图显示了富集最显著的20条KEGG通路。与WT组相比，AD组中的DEGs（图6C, D）在多个BP中显著富集，包括运动行为、管状形态发生、解剖结构形态发生、B胰腺细胞增殖和血管生成，这些涉及细胞代谢、细胞增殖、形态变化和细胞间相互作用。同时，这些DEGs也在许多CC中富集，如收缩纤维、肌纤维、神经元突起、细胞外围和树突，参与细胞连接、膜成分和细胞骨架组成。此外，这些基因还在一些MF中富集，包括钙离子结合、阳离子结合、金属离子结合、离子结合和semaphorin受体活性，在细胞信号转导的成分和功能调节中起重要作用。下载：下载高分辨率图像（1001KB）下载：下载全尺寸图像图7. 分析HSG处理小鼠中差异表达的转录组数据通路。（A, B）AD组和AD+HSG组之间DEGs的GO富集分析。（C, D）KEGG通路富集分析。为了更深入地了解DEGs的功能并探究其机制，我们使用KEGG进行了通路富集分析。如图6C和图7C所示，我们以条形图格式展示了p值最小的前30条通路，并将它们分为五类：细胞过程、环境信息处理、人类疾病和有机体系统。气泡图显示了富集最显著的20条KEGG通路。富集因子（x轴），通路（y轴），FDR（颜色变化）。气泡的大小表示在该通路中富集的基因数量。随后，我们分析了AD组和AD + HSG组之间的基因表达差异。这种比较有助于揭示HSG治疗对AD病理状态的潜在机制。HSG的靶点（图7A, B）主要富集在BP中，如免疫系统过程、对外部刺激的反应、免疫反应、对生物刺激的反应、防御反应等。它们在细胞外区域、细胞外空间、含胶原蛋白的细胞外基质、细胞外基质和细胞表面等中丰富。此外，我们还发现这些靶点具有MF，如细胞粘附分子结合、整合素结合、信号受体结合、蛋白质结合和肽酶调节活性。这些靶点参与重要的生物功能，如外部刺激的感知、反应和免疫调节，在细胞外基质的形成和维持、细胞表面的信号转导、细胞粘附和蛋白质相互作用等过程中起重要作用。下载：下载高分辨率图像（708KB）下载：下载全尺寸图像图8.不同组之间lncRNA表达的差异分析。(A) 文氏图展示了每个比较组之间差异表达的lncRNA的数量，并显示了比较组之间的交集关系。(B) 基因组圆图：根据基因组信息分析和lncRNA的差异表达结果，在基因组上标记出显示差异表达的lncRNA。火山图比较了WT组与AD组(C)以及AD组与AD+HSG组(D)，使用Log2(倍数变化)和-Log10(P值)进行展示。3.6. RT-qPCR为了验证转录组学发现，选择了一部分已识别的基因进行RT-qPCR分析。选定的验证基因包括Tll1、Cd6和Il-1β，因为它们具有显著的差异表达模式，并且与研究的重点具有潜在的生物学相关性。使用标准RNA分离试剂盒从WT、AD和AD+HSG组的小鼠海马组织中提取总RNA，然后使用逆转录试剂盒合成cDNA。RT-qPCR在实时PCR系统上使用SYBR Green PCR主混合物进行。目标基因的相对表达水平通过2^-ΔΔCt方法计算，以Gapdh作为内部对照基因进行标准化。RT-qPCR分析的结果与转录组数据一致。具体来说，Cd6、Il-1β和Il-6在AD组中的表达显著上调，而在AD+HSG组中表达水平显著降低。相反，Ndst4和Tll1在AD组中下调，在HSG处理后上调（图9）。这些发现不仅证实了转录组分析的可靠性，还为HSG在AD背景下对基因表达的潜在调控作用提供了进一步的证据。下载：下载高分辨率图像（441KB）下载：下载全尺寸图像图9. WT、AD和AD+HSG组之间海马区的基因表达差异。数据以2^-ΔΔCt显示，GAPDH作为内部参考；每个生物学重复实验进行了三次，并标准化到WT组；n=6，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。4. 讨论阿尔茨海默病是一种进行性和复杂的疾病。除了家族突变（如APP、PSEN1等）外，各种风险因素，包括表观遗传变化、代谢紊乱和环境暴露，也会加速疾病的进展并影响认知、情绪和运动等大脑功能。尽管目前FDA批准的药物在控制AD症状方面显示出临床效果，但它们通常伴随着显著的不良反应[55]。当代药理学研究表明，许多传统中药的成分可以通过多种机制干预AD的发生，包括抑制神经元凋亡、减少Aβ的产生、抑制过量的Tau蛋白、减轻神经炎症和减少氧化应激[[56]，[57]，[58]]。Huishen颗粒（HSG）是一种中药制剂，含有几种先前报道具有神经保护作用的生物活性成分。例如：人参皂苷RH2已被证明可以增强胆碱能传递并激活ERK-CREB-BDNF通路，支持突触可塑性和记忆巩固[[59]，[60]，[61]]。Schisandrin B可以减轻Aβ诱导的神经细胞毒性和氧化应激。Tanshinone IIA通过抑制RAGE/NF-κB信号通路来抑制神经炎症。通过对mRNA和lncRNA表达的综合分析，我们确定了13个在AD小鼠中差异表达并在HSG处理后得到逆转的核心基因（例如Clec7a、Wnt2b、Crym、TLL1、H60b、Adam12）。值得注意的是，其中一些基因与HSG成分已知的药理作用功能相关：Clec7a是一种小胶质细胞激活标志物，与tau介导的突触丢失有关[62]，可能被tanshinone IIA的抗炎作用所抑制。Wnt2b和Wnt8b参与线粒体功能和突触维持，可能受到与人参皂苷相关的BDNF信号传导的调节[71,76]。Crym是一种富含星形胶质细胞的代谢调节因子，与HSG在恢复大脑能量平衡中的作用一致[65]。TLL1是一种细胞外基质蛋白酶，可能有助于HSG诱导的ECM重塑和TGF-β/BMP信号通路的恢复，促进突触稳定和Aβ清除[66]。此外，KEGG富集分析突出了钙信号通路、PI3K-Akt和NOD样受体信号通路等途径，这些途径与HSG成分在减轻兴奋毒性、促进神经元存活和调节免疫反应方面的已知机制一致。这些发现共同支持了HSG的“成分-靶点-通路”框架，其中其活性成分在AD病理的多个节点上协同作用，从突触完整性到神经炎症[67,68]。转录组测序数据的富集分析显示，与AD进展正相关的DEGs在多个GO术语和KEGG信号通路中显著聚集。它们的功能注释与AD模型小鼠的记忆障碍和突触可塑性损伤表型高度一致。此外，它还描绘了病理特征，如海马神经元的加剧丢失和细胞排列紊乱。作为早期AD病变的关键事件，Aβ的过度沉积可以激活N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和电压依赖性钙通道（VDCCs），导致细胞内Ca²⁺水平持续升高，破坏钙平衡。这一过程进一步抑制了血管内皮生长因子（VEGF）的分泌，导致微血管密度降低和脑微血管灌注减少，从而削弱了对神经元的营养和氧气供应[[69]，[70]，[71]]。钙信号传导的破坏会损害线粒体和内质网之间的钙离子运输，导致线粒体过度吸收Ca²⁺，膜电位降低，呼吸链复合体的活性降低。因此，这引发了能量代谢危机，降低了ATP合成速率并增加了活性氧（ROS）的产生[[72]，[73]，[74]]。氧化应激和ATP缺乏的协同作用促进了微管相关蛋白（MAP-2）和肌动蛋白的降解，导致细胞骨架结构松弛。这表现为神经元细胞体的萎缩和细胞排列稀疏。这些形态变化直接损害了神经元的突触可塑性——LTP的斜率下降，最终导致神经网络兴奋性的降低和神经元损伤[75,76]。异常的血管和神经元损伤可以释放炎症信号，招募中性粒细胞等免疫细胞进入大脑或激活全身免疫反应。神经炎症反过来加剧神经元损伤，形成一个恶性循环，导致海马神经元的大规模凋亡和神经网络功能的崩溃。最终，这表现为学习和记忆能力的严重缺陷[77]。HSG具有多靶点治疗的优势，可能通过平衡能量代谢过程、缓解突触传递功能障碍以及减少炎症反应和其他相关过程来改善AD病理损伤引起的认知衰退。结合AD+HSG组的RNA-seq结果，在转录组水平进行了系统分析。共鉴定出13个与HSG治疗AD显著相关的DEGs，包括Clec7a、Obscn、Wnt2b、Crym、Ndst4、Tll1、Cd6、H60b、Wnt8b、Amd2、Nxf7、Tmem215和Adam12。这些基因可能通过调节能量代谢、突触传递和炎症反应等过程在AD的病理进展和治疗中起关键作用。13个枢纽mRNA与突触可塑性以及AD病理表型之间的强相关性，加上HSG干预后分子表达改变与行为和电生理指标改善之间的时间一致性，共同提供了间接证据，证实了HSG调节的分子网络与表型结果之间的因果联系。例如，Clec7a是疾病相关小胶质细胞（DAM）的关键标志物，通过其在小胶质细胞中的信号通路直接驱动与tau病理相关的突触丢失[62]。在AD模型中，Wnt2b表达的上调有效恢复了线粒体膜电位，降低了氧化应激水平，并增强了ATP的产生，从而减轻了Aβ诱导的神经元损伤并发挥了神经保护作用[78]。Crym广泛分布于星形胶质细胞中，通过编码μ-结晶蛋白参与神经递质代谢和离子平衡调节。其缺失会导致星形胶质细胞功能障碍、兴奋-抑制突触平衡的破坏以及持续的行为异常[65]。在AD患者的外周血或脑组织中，Crym的转录水平显著低于健康对照组，可能作为AD早期检测和诊断的生物标志物[79]。NDST4被确定为最近分化的神经细胞的明确标志物之一；其表达水平随AD严重程度和生物体衰老而下降，并在治疗干预后显著恢复[80]。H60b表达水平的升高与AD的进展一致，可以激活NK细胞和T细胞，可能通过促进外周免疫细胞浸润大脑来加剧神经炎症反应[81]。Wnt信号通路在AD的发病机制中起着复杂的作用，其失调可能加速疾病的病理进程。Wnt8b通过调节经典的Wnt/β-连环蛋白信号通路，影响与AD病理变化相关的多个方面，包括APP代谢、tau蛋白磷酸化、炎症反应和认知衰退[63,64]。Nxf7基因的缺失可能会损害小鼠的社会探索能力、空间认知能力和海马区的突触可塑性，因此在AD的病理过程中可能起作用[82]。ADAM12通过其金属蛋白酶活性，在FISH适配蛋白的调节下切割突触粘附分子，直接导致树突棘的丢失。特定的抑制剂可以阻断这一反应并减轻Aβ的神经毒性[83]。后续分析集中在一个与AD核心病理机制密切相关的基因Tll1上。在这项研究中，AD模型小鼠的海马区Tll1表达显著下调，而在HSG干预后，该基因的表达水平部分恢复。现有研究表明，Tll1在易患AD的大脑区域（如海马区和大脑皮层）表现出高表达趋势。其编码产物是一种分泌型锌离子依赖性蛋白酶，主要定位于细胞外基质（ECM）区域。这种蛋白酶参与ECM重塑和信号调节，并通过调节骨形态发生蛋白（BMP）级联反应影响神经发育和组织稳态[66]。ECM稳态失衡被认为是AD的新兴病理特征之一。其重塑过程可能增强星形胶质细胞的自噬-溶酶体通路，可能提高Aβ清除的效率并抑制神经炎症反应，从而缓解AD的进展[[84]，[85]，[86]]。值得注意的是，ECM的生化重塑改变了其物理性质，例如在AD谱系中观察到大脑区域的特定硬度变化，这可能是影响细胞行为的重要机制[85]。AD患者的大脑中存在各种代谢紊乱，其中与年龄相关的胆固醇合成减少是一个重要特征[87,88]。越来越多的研究表明，胆固醇代谢紊乱、细胞外基质（ECM）重塑和淀粉样β（Aβ）病理之间存在相互作用[[89]，[90]，[91]]。同时，异常的胆固醇代谢、ECM重塑和神经炎症可能构成一个复杂的病理网络，共同推动AD的进展[92]。TLL1通过从ECM释放潜在的转化生长因子-β1（TGF-β1）持续激活TGF-β信号通路[93]。低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）本身可以通过PI3K-PPARγ-LXR通路整合胆固醇排泄和ECM受体循环[94]。同时，作为这一ECM-TGF-β通路的“分子门”，其膜定位的缺失将导致TGF-β1的过度释放，从而导致ECM硬化[95]。激活的TGF-β信号可能通过抑制SREBP-2（胆固醇合成的主要转录调节因子）显著下调神经元胆固醇水平，可能损害突触功能，如突触后密度蛋白PSD95的表达减少[86,96]。TLL1还可以通过蛋白水解作用切割BMP抑制剂，如胆碱能蛋白Chordin，释放活性BMP配体（如BMP2/4、BMP5-8），从而缓解对BMP信号的抑制作用并激活下游信号通路[97,98]。在AD海马组织中，TLL1的减少可能导致Chordin切割不足，从而抑制BMP-Smad信号[99,100]。作为兴奋性突触的关键支架蛋白，PSD95的表达水平与突触结构和功能的完整性密切相关。TLL1-BMP通路可能驱动细胞外基质（ECM）的成熟，为PSD95的富集和功能提供必要的结构基础[101,102]。研究表明，BMP4可以激活p-Smad1/5/8信号通路，促进Arg-1的表达，并诱导巨噬细胞转变为抗炎M2表型[103]。BMP-7通过SMAD-PI3K-Akt-mTOR信号通路促进单核细胞极化为M2型巨噬细胞，并通过STAT3信号通路抑制小胶质细胞的过度激活，使其向抗炎表型转变[104,105]。此外，BMP-2作为缺血后NF-κB驱动的神经炎症的正向调节因子，其信号可以被阻断以抑制NF-κB并减轻炎症损伤[106]。上述的“损失-收益”失衡最终可能导致突触可塑性的减弱和Aβ清除能力的下降，加速认知功能的衰退。此外，我们还观察到AD组中Smpx、Ly6d、Shox2、Fat2和Pirt的表达水平与WT组相比显著上调或下调。尽管动物模型和人类疾病之间存在一定的差异，但这些基因仍为理解AD的病理机制提供了有价值的信息。它们可能有助于提供新的分子靶点，用于疾病的早期诊断、疾病监测或发病机制的研究。未来的研究应重点验证这些基因在人类患者群体中的关联，并深入探讨它们在不同AD亚型中的作用。这将有助于确定它们作为AD生物标志物的潜力，并研究其在疾病早期诊断和治疗策略开发中的潜在应用。
5. 限制
本研究存在一些局限性。首先，尽管样本量足以显示显著效应，但相对较小，这可能会限制检测更微妙表型变化的统计能力。其次，仅使用了一种剂量的HSG，这是基于初步验证和文献；未来的研究将包括剂量-反应组和阳性对照组。第三，RNA-seq分析每个组使用了n=3个生物学重复样本。虽然这个样本量是通过功效分析合理确定的，并得到了先前文献的支持，但它可能限制了对表达变化微小且效应量小的基因的检测，因此需要在更大的队列中进行进一步验证。值得注意的是，这一限制并不影响具有较大效应量的差异表达基因的可靠性，这些基因是本研究的核心关注点。第四，我们的发现主要基于5×FAD转基因小鼠模型，该模型能够稳健地再现淀粉样病理，但可能无法完全代表人类中最常见的散发性AD形式。因此，将我们的结论推广到其他模型或人类情况需要进一步验证。此外，作为一种草药化合物配方，我们研究小组的其他成员目前正在对HSG进行全面的成分分析和药代动力学评估，结果将在未来的工作中报告。最后，研究的普遍性受到一个限制，即它没有考虑性别/性别问题。
尽管存在这些局限性，我们的研究仍有几个优点。使用已建立的AD模型，结合全面的行为测试、体内电生理记录和全转录组测序，使我们能够多方面且稳健地评估HSG的效果。这种多种方法的整合增强了我们发现的内部有效性。
6. 结论
本研究利用5×FAD转基因小鼠模型来研究HSG对AD相关认知功能障碍的影响，并探索其潜在的分子机制。结果表明，HSG在AD的治疗中起着重要作用，展示了多靶点治疗的优势。HSG通过调节能量代谢、突触传递和炎症反应等多种机制，改善了AD模型小鼠的认知功能障碍和神经元病理损伤。这些发现为HSG提供了临床前理论基础，但在临床应用之前还需要进一步的临床验证。此外，该研究预测了一些可能作为AD诊断潜在生物标志物的基因，从而有助于更好地理解与该疾病相关的反应机制。值得注意的是，根据我们的富集分析结果、上述相关数据和全面的文献支持，我们的发现表明TLL1-BMP/ECM重塑通路可能是HSG在早期AD中发挥神经保护作用的下游机制。这一假设得到了我们的体内转录组数据（TLL1和Wnt2b上调，Clec7a下调）和表型数据（LTP恢复、认知功能改善）的支持，以及多项已发表的研究表明该通路与AD进展和突触可塑性调节密切相关。识别HSG的潜在生物标志物和治疗靶点对于这种致残性疾病的诊断和治疗至关重要。尽管如此，该研究仍有一些局限性；虽然5×FAD模型可以反映认知缺陷，但它并不能完全模拟AD复杂的病理特征。关键基因的具体机制仍有待确认，未来的研究应结合细胞实验来阐明DEGs及相关通路在AD复杂发病机制中的具体作用，以及HSG通过调节基因表达发挥治疗效果的方式。预计这些研究将为AD的治疗提供新的见解，给患者及其家庭带来希望。
作者贡献
概念化：张玉玲；方法学：张玉玲和刘春华；软件：刘晓文；验证：刘晓文；正式分析：刘晓文；调查：刘晓文；资源：刘晓文；数据管理：刘晓文；初稿撰写：刘晓文；审稿和编辑：崔俊波；可视化：崔俊波；监督：崔俊波；项目管理：崔俊波；资金获取：崔俊波和刘春华。所有作者均已阅读并同意发表的手稿版本。
资助
本研究得到了天津市卫生健康委员会科研项目（项目编号2023123）和天津市卫生健康顶尖人才发展计划（项目编号TJSJMYXYC-D2-057）以及国家自然科学基金（32371153）的资助。
机构审查委员会声明
已获得天津师范大学动物伦理委员会批准（编号2024082801；批准日期2024年8月28日）。
免责声明/出版商说明
所有出版物中包含的声明、观点和数据仅代表个别作者和贡献者的观点。
知情同意声明
不适用。
数据可用性声明
RNA-Seq数据存储在GEO（GSE306131）中。当前研究中使用和/或分析的所有数据集均可根据合理请求向相应作者获取。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
作者贡献声明
张玉玲：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、项目管理、方法学。
刘晓文：撰写——审稿与编辑。
刘春华：监督。
陈宝贵：正式分析。
崔俊波：资源管理、调查。
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