氧化是治疗性单克隆抗体（mAb）化学降解的关键途径，而氨基酸残基氧化等化学敏感性是可开发性研究的重要组成部分。从机理上讲，治疗性mAb制剂中的氧化反应常常未被充分理解，因为通常缺乏关于氧化剂性质等关键信息。本简要综述总结了近期治疗性蛋白质的筛选和可开发性研究，特别关注氧化敏感性，并结合特定蛋白质序列中氨基酸残基氧化的机理和补充性分析信息对这些数据进行了讨论。
引言
治疗性蛋白质的化学稳定性是设计安全有效制剂的重要参数之一。氧化是这些制剂中的一个主要降解途径，但与其他降解途径（例如水解）相比，其机理理解要少得多。原因有多种，主要是：
（1）药物制剂中氧化剂的性质常常未知；
（2）氧化剂的性质可能随制剂组成、杂质的种类和数量以及制剂所承受的压力类型而变化；
（3）蛋白质的所有氨基酸残基都易于氧化，但优先靶点是芳香族和含硫氨基酸。尽管反应复杂，但通过仔细分析机理和反应产物，可以在一定程度上区分不同的氧化途径。这需要使用互补的分析方法，包括高分辨率质谱（MS）和核磁共振波谱。
蛋白质氧化反应可由本体溶液/环境中产生的活性氧（ROS）介导，和/或由位点特异性过程介导。后者将氧化反应限制在特定的蛋白质结构域，其中氨基酸组成、肽段序列和/或几何结构等因素允许高效的氧化剂生成和反应。位点特异性过程对于金属催化的蛋白质氧化非常重要，这依赖于金属优先结合到特定的蛋白质结构域。位点特异性氧化的关键是结合了一个氧化还原活性金属，该金属处于或可被还原为还原态（通过还原剂或光），并能够在金属结合位点与氧气或过氧化物反应。
蛋白质氧化也可由光介导。入射光的性质和强度对于光氧化产物的种类和产率起着重要作用。入射光可直接与蛋白质的发色团相互作用，也可与辅料和杂质中存在的发色团相互作用，这种情况可能导致源自蛋白质和辅料的各种反应中间体。制剂中的蛋白质将主要暴露于可见光和近紫外光，一个长期存在的问题是，尽管蛋白质中的单个氨基酸不显著吸收可见光，但可见光照射如何能引发蛋白质氧化？下文将提供此问题的潜在答案。
本综述将主要关注单克隆抗体。通常，mAb商品制剂中的辅料包含缓冲液（主要是组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐和/或乙酸盐）、低温保护剂或冻干保护剂（例如蔗糖或海藻糖）、表面活性剂（例如聚山梨酯或泊洛沙姆）、氨基酸（例如精氨酸、甘氨酸、脯氨酸或赖氨酸）和张力调节剂的组合。mAb制剂的pH值主要在5-7之间。辅料浓度因产品设计为液体制剂与冻干制剂或低抗体浓度与高抗体浓度制剂而异。特别是表面活性剂浓度高于临界胶束浓度时，会形成双相环境，其中氧化反应可能在表面活性剂胶束的脂质核内更有效地进行。虽然蛋白质不会与这些胶束脂质核接触，但这些核内的氧化过程会产生ROS，随后可能转移到胶束表面，在胶束表面、本体溶液或制剂中存在的其他界面与蛋白质反应。
机理细节可能对通过先导化合物优化设计稳定的制剂、解读可开发性评估以及制定缓解策略大有裨益。因此，本简要综述将重点关注药物制剂中重要氧化过程的机理方面及其对设计、生产、储存和患者给药的影响。特别强调治疗性mAb的可开发性、色氨酸和甲硫氨酸氧化的机理细节以及抗体药物偶联物的氧化降解。
可开发性
近年来，许多研究活动集中在治疗性蛋白质（主要是mAb）的可开发性上。对于抗体，可开发性是指抗体候选物成为可生产、安全和有效药物的可能性。在其他众多参数中，在发现和开发的早期阶段识别化学修饰和/或化学敏感性至关重要。甲硫氨酸和色氨酸残基最常被描述为氧化的靶点，根据这些靶点在mAb中的位置，可能对抗体特异性、亲和力或药代动力学产生影响。然而，根据压力条件，其他氨基酸残基可能变得易于氧化。
最近的一个案例研究描述了通过定点诱变试图纠正IgG1 mAb重链CDR3结构域中色氨酸104的潜在氧化敏感性。在特定光照射下，HC Trp104被氧化，伴随高分子量（HMW）物种的形成和亲和力丧失。在可开发性研究中，构建了mAb B的10个定点突变体。结果只有Tyr104Phe突变体显示出与野生型蛋白相当的高结合亲和力。然而，Trp104Phe突变体显示出增加的自缔合和粘度趋势，最终决定继续进行未修正的野生型蛋白，并接受Trp104氧化的潜在风险。
最近的研究结果表明，在特定蛋白质折叠中，Trp和O2之间因紧密相互作用而形成电荷转移（CT）复合物，其光吸收在445和480 nm附近。在特定例子中，CT激发将麦芽糖结合蛋白的Trp单重态基态与三重态氧的复合物转化为两个几乎简并的激发三重态，其中Trp以自由基阳离子形式存在，氧接受一个电子产生超氧阴离子。最终，这些激发的三重态复合物可能通过自旋翻转和内部转换过程导致单线态氧的生成。然而，这种支持Trp残基和氧之间CT复合物的蛋白质折叠是否存在于mAb中仍有待证实。机器学习研究表明，溶剂暴露和某些二级结构能最有效地促进蛋白质中的Trp光氧化。
氧化的敏感性也与获得多反应性直接相关，即mAb结合一种以上不相关抗原的能力。研究表明，抗体暴露于200 μM FeII可引起多反应性，并且通过对119个IgG1 mAb库的比较，这与特定的序列特征相关。最显著的是与HC CDR2结构域中脯氨酸残基数量的正相关。多反应性与抗原结合位点的结构动力学有关，其中更大的灵活性可能导致对各种抗原更好的适应性。
关于FeII在mAb制剂中可以发挥的各种作用及其如何依赖于蛋白质和辅料性质的机理解释需要考虑。研究表明FeII与mAb的结合可能影响构象和/或柔性，但最终得出结论认为FeII作为促氧化剂起作用，意味着其作为氧化还原反应的促进剂/催化剂的作用。其他研究未检测到FeIII与mAb结合对二级和三级结构有任何显著影响。然而，取决于mAb或mAb结构域的性质，FeIII结合可能会或不会影响热稳定性。
在蛋白质/FeII复合物中，LxFeII可以与O2反应生成LxFeIII和O2•−，或与H2O2等其它氧化剂反应。LxFeII与H2O2的反应通常称为芬顿反应，根据pH和配体的性质，可产生羟基自由基、铁氧物种甚至配体自由基。HO•和铁氧物种都是强氧化剂，可以特异性与位于金属结合位点内或附近的氨基酸残基反应。相比之下，O2•−不会与蛋白质有效反应，而是歧化为H2O2，随后可用于芬顿反应。
使用羟基自由基足迹实验研究抗体暴露于FeII和H2O2后氨基酸氧化和羰基化产物。在肽图中，作者通过质谱数据中产物搜索参数的设计区分了氧化和羰基化产物。羰基化产物主要由脯氨酸、赖氨酸、精氨酸和苏氨酸的氨基酸残基产生，这与脯氨酸与FeII依赖性多反应性最强的相关性是相关的。氧化产物主要在重链的特定序列上被检测到，而轻链上检测到的氧化要少得多。一个重要的细节是，在曲妥珠单抗暴露于FeII和H2O2后，未在HC CDR2结构域中检测到显著的氧化或羰基化产物。相比之下，通过比较119个IgG1 mAb，发现FeII依赖性多反应性与HC CDR2结构域中的脯氨酸呈强正相关。
这些结果导致了多种可能的解释。FeII依赖性多反应性与HC CDR2结构域中脯氨酸残基频率的正相关可能与脯氨酸的氧化修饰无关，而是与其构象作用有关。为了阐明这个问题，将曲妥珠单抗暴露于次氯酸盐。然而，OCl−不与简单的脂肪族氨基酸残基有效反应，而是靶向甲硫氨酸。与HC CDR2结构域中的脯氨酸相比，FeII依赖性多反应性与HC CDR1结构域中苏氨酸的频率显示出较低但仍显著的正相关。FeII依赖性多反应性与轻链框架区2中的带正电荷氨基酸以及轻链框架区1中的天冬氨酸和异亮氨酸呈正相关。
总体而言，除苏氨酸28外，目前几乎没有实验证据表明特定氨基酸残基被直接氧化，而这些残基已被确定与FeII依赖性多反应性最正相关。另一方面，曲妥珠单抗暴露于FeII和H2O2会导致甲硫氨酸的显著氧化，而甲硫氨酸与FeII诱导的多反应性无关。
Lecerf等人的反应条件足以在实验时间框架内依赖FeII生成氧化剂。多反应性是在mAb暴露于磷酸盐缓冲盐水中200 μM FeSO410分钟后监测的。磷酸盐和升高的pH促进FeII被O2氧化。预计反应条件会在实验的前3分钟内产生约50 μM H2O2。在反应过程中，H2O2可以与未反应的FeII反应生成HO•和/或铁氧物种。这些物种可能是羰基产物的一个重要部分。或者，H2O2可以与产物FeIII反应，生成相对较强的氧化剂LxFeIII(−OOH)。后一种物质很可能是实验中报告的甲硫氨酸氧化为甲硫氨酸亚砜的重要原因。值得注意的是，不同研究中应用的FeII浓度不同，并且都显著高于药物制剂中可能预期的铁浓度。
Glover等人推断FeII与IgG1的结合是H2O2诱导位点特异性氧化的基本原理。FeIII与IgG1的结合对于光诱导的苏氨酸259位点特异性氧化也至关重要。等温滴定量热法进一步证实了FeIII与mAb的结合。
甲硫氨酸
机器学习算法被应用于预测甲硫氨酸氧化，基于对来自各种来源的大型数据集的分析，包括体内蛋白质氧化和治疗性蛋白质的氧化。通常，当甲硫氨酸残基存在于具有较高溶剂可及表面积和较高柔性的结构域中，并且甲硫氨酸残基与邻近残基的接触较少时，氧化更有利。控制蛋白质甲硫氨酸被H2O2氧化的一个重要参数是二层水配位数，本质上是量化在甲硫氨酸硫原子周围特定半径内有多少水分子可用于与H2O2形成氢键。这种氢键有助于H2O2内的电荷分离，这是硫化物被H2O2氧化过程中的决速步骤。
甲硫氨酸氧化与2SWCN的相关性与机器学习识别的SASA重要性并不矛盾，因为更高的SASA也可能导致更高的2SWCN。然而，据报道，必须考虑与氨基酸残基（如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸）上存在的额外羟基的氢键作用，以便与实验观察到的甲硫氨酸氧化有更好的相关性。因此，引入了新参数WCN-OH，它同时考虑了水分子和氨基酸侧链上的羟基作为氢键伙伴。WCN-OH提供了更好的正相关性，预测了一系列抗体中所有易氧化的甲硫氨酸残基。
与机器学习预测一致，mAb CDR内一个溶剂可及的甲硫氨酸残基HC-Met111比位于同一CDR内的一个包埋的甲硫氨酸残基HC-Met115更容易被氧化。然而，包埋的HC-Met115在与H2O2的反应中表现出立体选择性，生成特定的甲硫氨酸亚砜非对映异构体。虽然S-亚砜的侧链取向与非氧化Met115相似，但R-亚砜导致沿Cβ-Cγ键旋转，从而削弱了HC-Asp116和HC-Arg106之间的肽链主链氢键。结果，在氢-氘交换实验中，R-亚砜的氘摄取速度快于S-亚砜和非氧化蛋白。然而，这些构象变化对抗原结合没有影响，表明CDR中HC-Met111和HC-Met115的氧化对该特定mAb是良性的。
根据国际人用药品注册技术协调会ICH Q1B指南推荐的条件，即暴露于冷白光和紫外光下，甲硫氨酸残基易于发生光氧化。在这些条件下，可能是紫外光成分触发了色氨酸的II型光化学，产生单线态氧。含有光敏有效载荷的ADC对这种类型的光降解特别敏感。事实上，与拓扑异构酶I抑制剂（一种喜树碱衍生物）偶联的IgG1即使在环境光照射下，也显示出三个甲硫氨酸残基的显著氧化。相比之下，当将喜树碱衍生物加入IgG1溶液时，观察到的甲硫氨酸氧化要少得多。这种趋势与高分子量物种的形成相关。
展望
- 1.
详细理解药物制剂中治疗性蛋白质氧化的机理，对于解释旨在基于现有大型数据集预测新蛋白质候选物中氧化位点和产率的机器学习和可开发性研究非常重要。
- 2.
目前，甲硫氨酸和色氨酸被认为是治疗性蛋白质中的关键氧化位点，但对现有和未来治疗性蛋白质在制剂条件下氧化的针对性研究可能会扩展潜在氧化靶点的列表。该领域的研究也应关注半胱氨酸的氧化，因为某些mAb中可能由于不完全的二硫键形成而存在低水平的半胱氨酸。
- 3.
应采用高灵敏度和高分辨率的分析方法对蛋白质氧化产物进行彻底表征，不仅要关注最易受攻击的靶点。识别额外的氧化产物可能有助于理解免疫原性。
