Myrsini Sakarika | Yi Ling Chin | Nico Boon | Julia K. Keppler
微生物生态与技术中心（CMET），根特大学生物科学工程学院，Frieda Saeysstraat 1，9052 根特，比利时
**摘要**
肉类替代品因其比传统肉类更可持续和符合伦理而受到关注，其中微生物生物质因其营养价值和潜在的环境友好型生产方式而成为一种有前景的原料。然而，目前尚不清楚微生物培养条件是否会影响其加工性和作为肉类替代品的适用性。本研究探讨了培养参数（如培养基中的盐分（NaCl）浓度和培养温度）对Gram-negative细菌Paracoccus zeaxanthinifaciens产生的生物质质量的影响，这些生物质用于混合肉类替代品的制作（微生物生物质与小麦面筋的比例为1:1）。在五种不同条件下进行生物反应器培养实验后发现，这些参数对生物质的大分子组成、物理化学性质、热性质和流变特性以及形成组织化肉类替代品的能力有显著影响。总体而言，在低于最佳生长温度的条件下培养获得了最有希望的结果。具体来说，低温培养的生物质具有最高的总氨基酸含量和最强的纤维结构，而高盐浓度培养则增加了脂质含量。在控制条件和低温下生长的微生物生物质形成了适合制作组织化肉类替代品的强纤维，但在高盐和高温条件下培养则通过剪切细胞处理后产生了无结构的糊状物。这项研究首次强调了优化培养条件以提升微生物生物质作为肉类替代品原料的质量和功能性的重要性。
**1. 引言**
全球人口的增长和平均收入的提高导致了蛋白质需求的显著增加。这种对蛋白质日益增长的需求，加上传统农业的资源密集型特点，对环境构成了严重威胁。传统农业导致了森林砍伐、生物多样性丧失、土壤退化、水资源短缺和温室气体排放（Bisoffi等人，2021年），尤其是来自肉类和乳制品等动物产品的排放（Blonk等人，2008年）。因此，尽管农业技术有所进步，除非引入替代的蛋白质生产策略，否则食品生产的整体环境影响仍将增加。此外，传统的动物性食品生产还引发了关于动物福利的问题。在这种情况下，迫切需要迅速转向安全的蛋白质生产策略，以创造营养丰富且口感良好的替代品，同时减少环境影响，包括降低排放、避免生物多样性丧失和确保生产过程的伦理性。
鉴于这种转变的需求，肉类替代品——这些食品旨在模仿肉类的味道、质地和营养成分，使用素食或纯素成分——已成为一种更可持续和符合伦理的选择（Taghian Dinani等人，2023年）。虽然培养肉类的生产被认为是一个有前景的解决方案，但由于生长培养基中使用了胎牛血清等成分，仍存在伦理和可持续性问题（Young等人，2024年）。目前创造肉类替代品的主要努力集中在植物蛋白上，这朝着正确的方向迈出了一步，因为与肉类相比，植物蛋白的环境影响要小约50%（Smetana等人，2023年）。然而，植物蛋白的生产也存在缺陷：如果不对农业实践进行可持续管理，过度生产植物蛋白会导致富营养化、水污染、土壤侵蚀和生物多样性丧失（FAO，2018年），而且其生产还依赖于气候条件。此外，植物蛋白的生物利用率通常较低，技术功能特性也不如动物蛋白，基于植物的肉类替代品经常存在异味问题（Nikbakht Nasrabadi等人，2021年）。因此，尽管目前全球植物蛋白的产量在技术上足以满足人类的蛋白质需求（Berners-Lee等人，2018年）并减少对动物来源的依赖，但这本身可能不足以在地球资源的限制范围内满足不断增长的全球蛋白质需求（Springmann等人，2018年）。
一种有前景且可能更可持续的替代品是富含蛋白质的微生物生物质（干重中蛋白质含量可达约85%），这些生物质来自细菌、酵母、丝状真菌和微藻（Ravindra，2000年）。富含蛋白质的微生物生物质的环境足迹可能远低于植物蛋白（Ciani等人，2021年），使其成为更可持续的解决方案，而基于反应器的培养方式可以确保稳定生产，提供可靠的供应。虽然历史上微生物生物质曾被提出作为食品安全的解决方案（Goldberg，1985年），但现在人们重新关注其在使用二氧化碳衍生物（如乙醇或甲醇）作为基质时实现碳中和的可能性（Van Peteghem等人，2022年）。微生物生物质在食品中的应用包括制作肉类替代品、烘焙食品的添加剂（例如，提高面包、意大利面和其他烘焙食品的营养价值）、功能性食品成分（例如，强化汤、酱料和蛋白奶昔）以及饮料（Cardoso Alves等人，2023年；Pereira等人，2024年）。微生物来源的蛋白质具有多样性，可以针对各种应用进行定制，包括肉类和乳制品替代品，这比植物蛋白具有优势。然而，尽管具有潜在的好处，但微生物生物质作为肉类替代品主要成分的食品质量特性仍缺乏研究，因此需要进一步探讨其可行性。以肉类替代品这种熟悉的产品作为市场切入点，可以加速新型替代蛋白（包括微生物蛋白）的采用（Chezan等人，2022年）。
丝状真菌因其天然的丝状结构而被认为是制作肉类替代品的有希望的候选者，这种结构有助于创建类似鸡肉的组织化产品（Finnigan等人，2019年）。同样，微藻生物质也常被探索作为微生物肉类替代品的原料（Y. Fu等人，2021年；Sägesser等人，2024年）。然而，微藻在形成肉类替代品的过程中往往保持完整，导致质地较差且颜色较深，从而影响产品吸引力（Y. Fu等人，2021年），而某些Gram-negative细菌则不存在这一限制（Jia等人，2024年）。此外，真菌生长需要精制糖（Israelidis，1988年），而细菌可以利用回收的基质，从而提高其环境可持续性并降低生产成本。与真菌和微藻相比，细菌还具有更高的蛋白质含量、资源利用效率以及更低的生产环境影响（Ciani等人，2021年）。这使得细菌生物质更适合用于肉类替代品的生产。Gram-negative细菌也已用于食品生产，例如用于醋和康普茶生产的醋酸菌（Gomes等人，2018年）。通过利用这些独特特性，细菌生物质可以在使用二氧化碳衍生物作为基质的情况下实现更高的环境可持续性和经济可行性（Van Peteghem等人，2022年）。
尽管存在许多研究空白，例如如何配制特定的食品产品（如肉类替代品）以及除了大分子组成外（Sakarika等人，2023年）可能影响微生物生物质技术功能特性的培养条件，但这项探索性研究基于先前的报告（Cotner等人，2006年；Tempest & Meers，1968年），假设这些因素也可能影响技术功能特性，尽管此前尚未有相关研究。虽然已经探讨了从加工后的细菌生物质中生产组织化肉类替代品的潜力（Jia等人，2024年），但了解不同培养参数如何影响其作为肉类替代品原料的特性至关重要。解决这些知识空白对于优化生产过程和提高微生物食品的质量和可持续性至关重要。这项筛选研究旨在通过将生物生产、食品成分评估以及微生物生物质向组织化混合肉类替代品（微生物生物质与小麦面筋的比例为1:1）的下游转化联系起来，从而为开发更可持续和高质量的动物蛋白替代品做出贡献。
**2. 材料与方法**
**2.1. 方法论**
本研究的目的是初步筛选不同培养条件是否会影响纯培养物的生物质质量，并测试这一变化是否进一步影响肉类替代品的形成。选择Gram-negative细菌Paracoccus zeaxanthinifaciens是因为它能够在不同的NaCl浓度和温度下生长（Berry等人，2003年）。尽管该菌目前尚未获得普遍认可的安全性（GRAS）认证，但在食品领域仍对其进行研究，因为它能产生具有健康促进作用的类黄酮zeaxanthin（Bouyahya等人，2021年）。培养在五种不同条件下进行（表1），其中盐分（NaCl）含量和温度各不相同，包括一个基于培养物建议的对照条件。所选的培养条件彼此之间存在显著差异，以减缓生长速度但避免完全抑制生长。初步实验在0-100 g/L的盐浓度范围内发现0、20和65 g/L的浓度适合P. zeaxanthinifaciens的生长。进一步的初步实验确认了该菌在比推荐生长温度（28°C）高或低5°C的温度下也能生长。随后进行了分批培养实验，以生成足够的生物质用于性质分析和组织化实验（图1）。培养后，收集并干燥微生物生物质，并分析其性质。最后，将生物质与小麦面筋（WG）以1:1的质量比混合（即20 g WG和20 g干微生物生物质），以生产类似鸡肉的肉类替代品。结果与常用的植物蛋白（如大豆蛋白浓缩物（SPC）、豌豆蛋白分离物（PPI）和WG）进行了比较。这些步骤的详细说明见下文。
**表1. P. zeaxanthinifaciens培养的条件**
| 条件 | 温度（°C） | 盐分（g/L） | 对照 | 高盐 | 低盐 | 高温 | 低温 |
|------|---------|--------|------|------|------|------|------|
| 28 | 20 | | | | | | |
| 28 | 65 | | | | | | |
| 33 | 20 | | | | | | |
**图1. 从P. zeaxanthinifaciens生物质生产微生物肉类替代品的方法流程图**
生物质在分批生物反应器中在不同盐浓度和温度下培养。培养后，收集生物质并冷冻干燥，分析其性质。最后，将其与小麦面筋混合并在剪切细胞中处理以形成类似鸡肉的肉类替代品。
**2.2. 微生物**
P. zeaxanthinifaciens LMG 21293从比利时微生物协调收藏中心（BCCM/LMG，根特，比利时）购买。预培养包括两个步骤：首先，在含有15 mL Marine Broth 2216（BD Difco™）的50-mL试管中过夜培养，温度为目标温度；其次，在含有250 mL矿物盐、维生素、醋酸盐和酵母提取物的1L Erlenmeyer烧瓶中在同一条件下培养（表S1）。这些培养物用于接种反应器。
**2.3. 生物反应器实验**
主要实验在5-L生物反应器（Biostat-B，Sartorius）中进行，最初以分批模式运行，随后改为分批模式，在五种不同条件下进行（表1）。为了实现碳限制并避免与氮限制相关的非蛋白质化合物积累，初始培养基的碳氮比（C/N）为5（补充信息中的S1.1部分）。醋酸盐以醋酸钾和醋酸钠的形式提供（基于醋酸盐质量的1:1比例），酵母提取物作为主要氮源（表S1），pH值用4 M HCl和5 M NaOH控制在7.5。确保初始醋酸盐浓度（10 g/L）不会抑制生长，并在整个实验过程中保持在该水平以下。
对于分批操作，使用六倍浓缩的进料溶液，使醋酸盐浓度达到60 g/L。唯一未进一步浓缩的培养基成分是NaCl，其浓度保持为目标实验所需的水平（表S1）。初始进料速率设置为与初步分批实验确定的最大醋酸盐消耗速率0.60 g/L/h相匹配，并根据需要进行调整。间歇性进料，每3小时持续30分钟。每天根据反应器体积手动调整两次通气速率，以达到1 vvm。搅拌强度在400至800 rpm之间变化，以维持溶解氧水平高于30%饱和度。分批生产持续到添加了2 L浓缩进料介质为止。当最后一次进料后溶解氧水平开始上升时，表示进料醋酸盐已被完全消耗，实验停止。**收获与干燥**
生物量通过离心法进行收获，使用的是RC6+离心机（ThermoScientific），在15°C下以22,040 g的离心力离心5分钟，该离心机配备了F14S-6X250Y转子（容量为250 mL）。为了去除残留的有机物，如酵母提取物和其他可溶性化合物，样品先用自来水清洗一次，然后在相同的条件下再次离心。离心后立即将微生物生物量在-20°C下用塑料容器冷冻。随后将样品冻干，直到产品中不再含有水分。所得到的产品用研杵轻轻搅拌均匀后直接用于实验。
**2.5 监测生物反应器性能**
为了评估培养条件对生物反应器性能的影响，监测了生物量浓度和生产力（见补充信息S1.2）。通过使用分光光度计（Spectronic 22，Thermo Scientific）在600 nm处测量光密度来监测P. zeaxanthinifaciens的生长情况。细胞干重（CDW）通过0.2 μm孔径的亲水性尼龙膜过滤器（GNWP04700；Millipore；Merck）进行量化，根据生物量密度，悬浮液体积为4–15 mL。使用pH传感器（ORION911600，Thermo Scientific）在每个时间点测量pH值。
**2.6 微生物生物量的大分子组成**
所有分析都是在用自来水清洗过一次的生物量上进行的。总细胞蛋白使用Pierce™ bicinchoninic acid（BCA）蛋白测定试剂盒（ThermoFisher Scientific）进行三倍重复测定，以牛血清白蛋白作为标准品。总细胞碳水化合物在硫酸和硼酸混合物中水解后，在520 nm处进行比色测定，以D-葡萄糖（≥ 99.5%，Carl Roth）作为标准品（Josefsson，1983）。有机酸通过离子色谱仪（930 Compact IC Flex；Metrohm，CH）测定，该仪器配备了Metrosep有机酸250/7.8柱、Metrosep有机酸保护柱/4.6和850 IC电导率检测器（Metrohm，CH）。有机酸以0.5 mL/min的流速用1mM H2SO4（95–98%，Carl Roth）洗脱。
**2.7 蛋白质表征和氨基酸谱**
2.7.1 分子量分布
冻干样品的蛋白质分子量分布通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确定，分别在还原和非还原条件下进行，如Jia等人（2024）所述，使用的生物量悬浮液中含有约10 g/L的蛋白质。
2.7.2 蛋白质二级结构
为了评估蛋白质的二级结构，使用Bruker OPUS软件系统（8.25，Ettlingen，德国）对酰胺带I区域（1580-1700 cm−1）的FTIR光谱进行矢量归一化处理，平滑点数为9。
2.7.3 氨基酸谱
所有冻干生物量样品的氨基酸（AA）分析均由外部实验室完成。除了色氨酸、鸟氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺外，所有氨基酸均使用Thermo Fisher UltiMate 3000系统上的HPLC进行测定，该系统配备了Acquity UPLC BEH C18柱（2.1x150 mm，1.7 μm粒径）和VanGuard Acquity UPLC BEH C18保护柱（Waters）。样品在110°C下用6N HCl和1%苯酚水解24小时，然后在真空下干燥，并用含有0.4 mM诺尔莱辛的内部标准溶液重新配制。重新配制的样品经过衍生化处理后，使用Chromeleon 7.1软件定量氨基酸。洗脱使用磷酸钠和四硼酸钠缓冲液（pH 7.8）、甲醇和乙腈的多梯度进行。每个样品的氨基酸含量平均值和标准偏差（% g AA/g total AA）均报告（n=3）。
**2.8 热谱分析**
冻干样品在悬浮液中的热稳定性通过差示扫描量热法（DSC）（TA instrument 250；TA Instruments，Newcastle，USA）进行评估，浓度约为100 gCDW/L，方法如Jia等人（2024）所述。计算了变性/熔化起始温度（°C）、变性/熔化峰值温度（°C）和变性/熔化焓（J/gCDW）。在本研究中，当提到与蛋白质相关的转变时使用“变性”一词，而“熔化”则更广泛地用于描述微生物生物量基质中非蛋白质细胞成分的热转变。
**2.9 Zeta电位**
冻干微生物生物体的Zeta电位按照Jia等人（2024）的方法使用Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcestershire, UK）进行测定。样品中的微生物生物量浓度约为0.020 mgCDW/L。
**2.10 保水能力、生物量和蛋白质溶解度**
在falcon管中制备了4% CDW浓度的冻干微生物生物量悬浮液，方法是将0.4 g微生物生物量加入9.6 g超纯水中。样品涡旋1分钟后用滚筒台旋转过夜，然后在20°C下以20,000 g的离心力离心30分钟。沉淀物转移到铝盘中，在105°C的烤箱（Model E28，Binder，Germany）中干燥至少16小时。测量干燥前（Initial pellet）、水合后（Mwet pellet）和干燥后（Mdry pellet）的重量。根据公式（1）和（2）分别计算每个样品的保水能力（WHC）和溶解度：
（1）
（2）
收集上清液（液相）通过Pierce™ BCA测定法定量可溶性蛋白质的量。
**2.11 最小凝胶化浓度**
在蛋白质浓度范围为3至17 g/L的生物量悬浮液中评估了最小凝胶化浓度，即热处理后能够形成凝胶的最低浓度。由于样品间的蛋白质含量不同，这些浓度对应不同的生物量浓度（8-30% CDW）。悬浮液使用超纯水制备，最终体积为1 mL，置于2-mL Eppendorf管中，在95°C下加热1小时（ThermoMixer C，Eppendorf，Germany）。样品在冰浴中冷却后，然后在4°C下保存过夜。最小凝胶化浓度确定为倒置管不滑动时的浓度。所有样品中，20% CDW生物量被确定为最小凝胶化浓度（见表S3）。
**2.12 结构性质**
2.12.1 流变性质
根据之前的最小凝胶化浓度测试（表S3），从冻干生物量样品中制备20% CDW的悬浮液。使用MCR502流变仪（Anton Paar，Graz，Austria）测量粘度，该流变仪配备了CC-10同心圆筒几何结构和溶剂陷阱，如Jia等人（2024）所述，剪切速率范围为0.1-100 s-1，温度为20°C。然后进行温度扫描，温度从20°C升高到95°C，升温速率为3°C/min，然后在95°C下保持5分钟，随后以3°C/min的速度冷却到20°C，并在20°C下保持5分钟。在温度扫描过程中，频率和剪切应变保持恒定在1 Hz和1%，并记录储能模量（G'）和损耗模量（G"）随时间的变化。接下来，将加热后的样品暴露在0.1%到1000%的振幅扫描中，频率为1 Hz。记录G'和G"对剪切应变的变化。
使用封闭腔流变仪（CCR）（RPA elite，TA instruments，USA）在1 Hz频率和1%应变下评估粘弹性性质，温度扫描范围为40-140°C。通过将2.4 g样品粉末与超纯水混合制备40% CDW溶液，最终质量为6 g。水合30分钟后，样品放置在封闭腔内的两个塑料箔之间。施加4 bar的压力以防止水分蒸发。基于测量的G′和G″计算复合模量（G*）。由于样品数量有限，进行了重复测量。
**2.12.2 高温锥形剪切细胞中的结构形成**
对于所有与WG以1:1质量比混合的微生物生物质样品，评估了结构形成情况，WG单独作为对照。首先，将20 g微生物生物质与60 g去矿物质水混合并水合30分钟。然后将水合样品与20 g WG混合，最终浓度为40% CDW。将此混合物转移到预加热的高温锥形剪切细胞（Wageningen University，Wageningen，Netherlands）（Grabowska等人，2016）中，在140°C下以30 rpm的剪切速率剪切15分钟。加热和冷却使用外部油浴进行。
**2.12.3 组织分析**
使用TA.XTplusC Texture Analyzer（配备A/MTG微型拉伸夹具，Stable Micro Systems，United Kingdom）进行变形测试。在室温下进行单轴拉伸测试，恒定变形速率为0.19 mm/s。使用在24小时内制备的新鲜结构化材料进行测试。样品切成两个方向：平行于剪切流（在剪切区内水平）和垂直于剪切流（在剪切区内垂直）。使用长度为10 mm、宽度为3.18 mm、厚度在2.8至5.2 mm之间的拉伸棒进行测试。分别测量每个样品的厚度。分析应力-应变曲线以确定断裂点，并计算断裂点的拉伸断裂应力σ（Pa）和拉伸断裂应变ε（mm/mm）。所得参数的标准误差相对较大，部分可归因于样品内的结构变化和固有的不均匀性。
**2.13 数据分析和可用性**
所有数据分析均在R版本4.3中进行。使用ATR-FTIR吸收值进行主成分分析（PCA），以评估不同培养条件对细菌样品组成的影响。在进行PCA之前，数据进行了中心化和缩放。使用双尾独立t检验对对照组和测试组之间的最终生物量组成、其氨基酸谱和物理化学性质以及结构化微生物肉类似物的拉伸应力和应变进行了成对比较。显著性水平如下：p < 0.0001（****），p < 0.001（***），p < 0.01（**），p < 0.05（*），p > 0.05（无显著性 – ns）。除非另有说明，所有分析均进行三倍重复，结果以平均值±标准偏差表示。支持数据可在补充信息中找到，如有需要可提供更多信息。
**3 结果与讨论**
**3.1 培养条件影响生物反应器性能**
培养条件通常会影响生物反应器的性能，尤其是生物量生产力。尽管最终的微生物生物量浓度没有显著变化，仍保持在12.3 ± 1.1 gCDW/L的水平，但在补料批次阶段的最大生物量生产力差异很大，从低温实验中的0.22 gCDW/L/h到对照组的1.86 gCDW/L/h（表S4）。因此，有时需要调整进料速率以防止乙酸盐积累到抑制水平。实际上，这意味着虽然可以达到相同的最终生物量浓度，但在非最佳范围内操作会减慢过程。下一节将讨论这种较低的生产力是否通过改善生物量组成得到补偿。一个有趣的观察是，高盐浓度（65 g/L NaCl）会导致大量起泡，悬浮液呈现粘稠状，表明可能产生了含有蛋白质的细胞外成分。
温度和盐耐受性是微生物种类甚至菌株特异性的，可能会影响产量和生产力。例如，大多数微藻不能在30°C以上的温度下生长，但Chaetoceros sp.可以在35°C下生长，但生长速率仅比30°C时降低10%（Renaud等人，2002）。在耐盐微藻Tetraselmis sp.中，盐度的增加（5–14% NaCl）对生长速率或生产力影响甚微（Fon Sing等人，2014年）。在细菌中，偏离最佳培养温度也会影响生长速率。在Klebsiella aerogenes中，发现生长速率和产量依赖于温度，当温度超过最佳值25°C时，其表现会受到影响（Topiwala & Sinclair，1971年）。同样，Escherichia coli在偏离最佳温度（33°C）时，无论是升高还是降低温度，都会降低生长速率（Cotner等人，2006年）。适应极端温度通常涉及生长、维持和生存需求之间的权衡（Cotner等人，2006年）。尽管极端条件可能阻碍生产力，但它们也可能提供其他优势，例如在嗜热温度下减少冷却需求（Cooney等人，1975年），由于核酸含量在最佳范围以上降低而提高微生物生物量的营养价值（Cotner等人，2006年），或者降低潜在病原微生物的入侵风险（Barbosa等人，2021年）。这些发现强调了为每种特定微生物优化培养条件的重要性，以实现生产力与生物量质量之间的平衡。
3.2. 微生物生物量的组成受培养条件的影响
培养条件影响了生物量的最终大分子组成，包括蛋白质（图2、图3、图4）、碳水化合物、非极性化合物和矿物质含量（图3、图4）、蛋白质谱（图4、图5）以及氨基酸谱（表2），这是通过批量分析和FTIR确定的。这些大分子组成的变化突显了培养条件与微生物生物量质量之间的复杂关系。
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图2. 在不同培养条件下生长的P. zeaxanthinifaciens生物量的蛋白质含量，作为培养基电导率的函数。对照培养条件（20 gNaCl/L和28°C）基于该菌种收藏的建议。
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图3. 在不同培养条件下生长的P. zeaxanthinifaciens生物量的大分子组成（表1）。显示了平均值和标准差（n=3）。使用双尾独立t检验对对照条件和测试条件进行了成对比较。显著性水平如下表示：p < 0.0001（****），p < 0.001（***），p < 0.01（**），p < 0.05（*），p > 0.05（ns）。原始数据见表S5。对照培养条件基于该菌种收藏的建议。
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图4. (a-b) 在不同培养条件下生长的P. zeaxanthinifaciens生物量的衰减全反射傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱：(a) 全谱；(b) 酰胺I带的二阶导数。显示了平均值（线条）和标准差（阴影区域）（n=3）。(c-d) 对三种不同重复实验的ATR-FTIR光谱进行的主成分分析：(c) 全谱；(d) 酰胺I带的二阶导数。对照培养条件基于该菌种收藏的建议。
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图5. 通过SDS-PAGE测得的在不同培养条件下生长的P. zeaxanthinifaciens生物量中蛋白质的分子量。平均值见表S6–S7，凝胶图片见图S6。对照培养条件基于该菌种收藏的建议。
表2. 在不同培养条件下生长的P. zeaxanthinifaciens蛋白质中的氨基酸含量。显示了平均值和标准差（n=3）。使用双尾独立t检验对对照条件和测试条件进行了成对比较。显著性水平如下表示：p < 0.0001（****），p < 0.001（***），p < 0.01（**），p < 0.05（*），p > 0.05（ns）。
空细胞
高盐
低盐
高温
低温
氨基酸含量（% g AA/g total AA）
精氨酸 7.25 ± 0.03 8.04 ± 0.10 (****) 4.43 ± 0.10 (****) 7.22 ± 0.10 (ns) 7.49 ± 0.08 (***)
半胱氨酸 0.27 ± 0.04 0.44 ± 0.10 (**) 0.76 ± 0.08 (****) 0.59 ± 0.17 (**) 0.62 ± 0.08 (****)
甘氨酸 6.59 ± 0.11 6.33 ± 0.06 (**) 5.08 ± 0.05 (****) 6.41 ± 0.06 (*) 6.61 ± 0.06 (ns)
组氨酸 1.79 ± 0.04 1.91 ± 0.04 (***) 1.41 ± 0.03 (****) 1.99 ± 0.06 (**) 1.71 ± 0.03 (++)
异亮氨酸 5.06 ± 0.06 5.11 ± 0.17 (ns) 5.83 ± 0.11 (****) 4.90 ± 0.13 (*) 4.78 ± 0.03 (****)
亮氨酸 8.61 ± 0.05 8.79 ± 0.12 (*) 8.07 ± 0.09 (****) 8.24 ± 0.13 (***) 8.46 ± 0.07 (**)
赖氨酸 4.05 ± 0.05 4.55 ± 0.13 (****) 6.40 ± 0.22 (****) 3.96 ± 0.16 (ns) 4.10 ± 0.09 (ns)
甲硫氨酸 1.41 ± 0.09 1.81 ± 0.66 (ns) 2.00 ± 0.40 (*) 1.78 ± 1.36 (ns) 3.24 ± 0.15 (****)
苯丙氨酸 5.21 ± 0.07 5.10 ± 0.07 (*) 4.97 ± 0.04 (****) 5.10 ± 0.15 (ns) 4.84 ± 0.07 (****)
脯氨酸 4.36 ± 0.10 4.35 ± 0.26 (ns) 3.16 ± 0.06 (****) 4.39 ± 0.23 (ns) 4.08 ± 0.09 (***)
苏氨酸 5.46 ± 0.05 5.42 ± 0.07 (ns) 4.88 ± 0.08 (****) 5.35 ± 0.13 (ns) 5.30 ± 0.02 (***)
酪氨酸 3.42 ± 0.11 3.46 ± 0.04 (ns) 4.09 ± 0.10 (****) 3.51 ± 0.10 (ns) 3.47 ± 0.07 (ns)
缬氨酸 7.05 ± 0.04 7.00 ± 0.17 (ns) 6.93 ± 0.08 (*) 6.78 ± 0.09 (***) 6.72 ± 0.06 (****)
非必需氨基酸 39.5 ± 0.23 7.7 ± 0.4 (****) 40.8 ± 0.4 (****) 39.8 ± 0.4 (ns) 38.6 ± 0.3 (****)
疏水性氨基酸 48.4 ± 0.14 8.6 ± 0.3 (ns) 46.5 ± 0.1 (****) 47.5 ± 0.4 (**) 48.4 ± 0.3 (ns)
2.1. 培养条件影响大分子组成
培养条件影响了生物量的最终大分子组成（图2、图3），其中蛋白质含量的影响最为显著。蛋白质含量与培养时间（图S2）或生物量浓度（图S3）之间没有明显关系。然而，观察到与电导率相关的明显趋势——电导率是盐含量的一个指标，在连续进料操作过程中随着浓缩饲料的加入而增加。这一趋势呈近似钟形分布，在60–90 mS/cm的电导率范围内蛋白质含量达到峰值（图2），这突显了盐度水平对微生物细胞大分子组成的强烈影响。与温度变化相比，盐添加的影响更为显著，这也体现在培养时间（图S2）和生物量浓度（图S3）上。在固定盐浓度（20 g NaCl/L）下，不同温度显示出一致的正相关关系，而在恒定温度（28°C）下，不同的盐浓度则导致不同的趋势。需要注意的是，本研究中使用的微生物菌株是嗜盐菌，偏离最佳盐浓度会影响其生长。
在培养期结束时，最高的蛋白质含量（67.8 ± 1.2%）出现在对照条件（20 gNaCl/L和28°C）下，而最低的蛋白质含量（37.5 ± 0.1 – 38.4 %）出现在高盐和低盐条件下，表明偏离最佳盐浓度（20 gNaCl/L）会对蛋白质含量产生负面影响。在高盐条件下生长的生物体在生物反应器操作过程中出现泡沫现象，可能表明产生了细胞外蛋白质，这可能会影响细胞内蛋白质含量。这些发现与先前的研究结果一致，即NaCl水平可以影响K. aerogenes生物量的大分子组成，但本研究并未探讨其对蛋白质含量（或任何感兴趣的大分子）的影响（Tempest & Meers，1968年）。
与对生长速率的影响类似，培养条件对生物量组成的影响似乎也是特定于微生物的。例如，盐度的增加（5–14% NaCl）对耐盐微藻Tetraselmis sp.的生物量质量影响甚微（Fon Sing等人，2014年）。在E. coli中，偏离最佳温度33°C会导致不同大分子含量的变化：在较高温度下蛋白质含量增加，可能是由于应激反应蛋白的产生（Cotner等人，2006年）。
生物量的蛋白质含量也受到温度的影响，但程度低于盐度的影响（图3；图S2–S3）。文献中注意到温度变化的影响。例如，在碳限制条件下，K. aerogenes在40°C下的蛋白质含量从59.4%增加到74.1%，而在25°C下培养时则没有变化（Tempest & Hunter，1965年）。相反，Cupriavidus necator在温度从25°C升高到40°C时，蛋白质含量从73%降低到53%（Ismail等人，2024年）。同样，在微藻中，较高温度通常会降低蛋白质含量（Renaud等人，2002年）。
这里产生的微生物生物量的蛋白质含量（37.5–67.8%）与其他微生物蛋白质来源相当。例如，Methylobacillus flagellatus的生物量含有73%的蛋白质（2%的脂质，5%的灰分，5%的可溶性核苷酸，以及14%的其他成分——可能是碳水化合物），简单的处理并未提高蛋白质含量（67-73%）（Jia等人，2024年），而一般细菌生物量的蛋白质含量在16%到74%之间（Bratosin等人，2021年）。相比之下，未加工的大豆和豌豆在干物质中的蛋白质含量分别为约40%和22%（Schreuders等人，2019年）。常见的植物来源蛋白质分离物如大豆蛋白分离物（86%）和PPI（78%）具有较高的蛋白质含量（Schreuders等人，2019年），但需要经过大量处理才能获得，从而限制了它们的可持续性。这里产生的微生物生物量为肉类替代品等应用提供了更合适的选项。
矿物质是P. zeaxanthinifaciens生物量中第二丰富的成分，含量范围为10.5 ± 1.9%到31.3 ± 3.2%，在较高温度下显著高于其他条件（图3）。同样，较高的盐度水平（12-14% NaCl相比7%）使Tetraselmis sp.的矿物质含量从61%增加到72%（Fon Sing等人，2014年）。碳水化合物含量范围为1.3 ± 0.2%（低盐）到5.0 ± 0.7%（对照），而非极性化合物（脂质、色素）的含量最低，从0.86 ± 0.26%（低盐）到1.6 ± 0.48%（高盐）不等。因此，高盐度似乎促进了脂质和色素的生成，可能是作为一种保护机制（López等人，2006年；Wang等人，2017年）。在不同培养条件下还观察到了脂肪酸组成的变化。在微藻中，较高温度通常会降低蛋白质和脂质的生成，而饱和脂肪酸增加，多不饱和脂肪酸减少（Renaud等人，2002年）。此外，在Rhodomonas sp.中，高温导致脂肪酸的平均链长度略有减少，表明脂质生物合成发生了变化以应对热应力。
ATR-FTIR光谱提供了关于不同样品大分子组成的定性和定量信息（图4）。带分配列在表S2中，明显的位移表明应仅考虑大致差异，因为多组分样品会导致各种信号的叠加（Jia等人，2024年），我们的样品中也观察到了这一点。
在高盐浓度下生长的生物量差异最大（图4(a)），特别是在脂质区域有一个主要峰，其次是低盐条件下生长的样品。它还在1200 cm-1范围内显示出一个明显的PO2-峰，这可能是由脂多糖或磷脂引起的，这种情况通常在高盐条件下发生（López等人，2006年）。酰胺I带在各个样品中相似，但在低盐条件下生长的样品形状略有不同。在高盐浓度下生长的样品的酰胺III带在1460 cm-1处有一个更尖锐的峰，在1400 cm-1处形状不同。这些差异可能是由于其他信号的叠加，在这个复杂的样品中无法进一步分配。对于碳水化合物（即900-1100 cm-1），高盐样品再次最为明显，其次是低盐样品，两者都在985 cm-1处显示一个峰，这之前被归因于吡喃糖（Oust等人，2006年）。吡喃糖是一种六元杂环糖，常见于细菌细胞壁中，例如在肽聚糖层中（Oust等人，2006年；Socrates，2001年）。
在高盐浓度下生长的生物量还显示出更多的C=O振动，表明含有脂肪酸或脂质，尽管这个信号可能来自脂多糖、磷脂或脂蛋白，由于它们的极性而无法通过己烷提取（Verardo等人，2013年）。图4(c)进一步表明，尽管对照组和温度处理组的聚类相对接近，但盐处理对大分子组成的影响更为显著。3.2.2. 蛋白质分子量谱和氨基酸组成受微生物培养条件的影响蛋白质（图4(b)-(d)，图5）和氨基酸（表2）的谱型共同影响微生物生物质的质地、凝胶化、乳化作用和营养价值，这些特性在食品应用中非常重要，它们受到培养条件的显著影响。特定蛋白质的FTIR分析（图4(b)）显示蛋白质构象存在明显差异，尤其是在高盐和低盐样品之间，高盐样品显示出强烈的α-螺旋信号。在高温下产生的生物质显示出最弱的信号，这表明不同培养条件下的蛋白质谱型存在显著差异。β-折叠带的移动可能表明蛋白质组成或构象的变化，其中高盐样品的偏差最大。高盐和高温样品的分子内β-折叠带都向较低的波长移动，这可能表明发生了分子间聚集。在图4(d)中，对照组、低盐组和低温组样品聚集在一起，而高盐组和高温组样品的蛋白质谱型则有显著不同，这可能与热休克蛋白（X. Fu等人，2014年）、冷休克蛋白（Horn等人，2007年）以及参与渗透压应激的蛋白质有关（Paul，2013年）。使用SDS-PAGE（图5）也观察到了在不同培养条件下P. zeaxanthinifaciens生物质中蛋白质分子量谱的变化，分别在还原（破坏二硫键以完全变性蛋白质）和非还原（保持二硫键以显示连接亚基）条件下进行。在高温和高盐条件下产生的生物质含有最高相对分子量的蛋白质（>200 kDa），这一差异也通过FTIR（图4(b)）得到了证实。同时，对照组的平均分子量最大（76.4 ± 61.2 kDa），而高温组的平均分子量最小（64.0 ± 57.5 kDa）（表S6）。在还原条件下，低温组产生的生物质具有最大的分子量（57.4 ± 48.1 kDa），而低盐组最低（43.7 ± 26.6 kDa）。还原和非还原SDS-PAGE（图5）之间的差异突显了二硫键的存在（非还原SDS-PAGE中较大的带表明二硫键将寡聚形式或亚基结合在一起），其中对照组产生的生物质差异最大（44.7%），而低温组最小（17.4%）（表S6）。P. zeaxanthinifaciens中的蛋白质主要是低分子量的（<50 kDa），与M. flagellatus相似（Jia等人，2024年）。然而，在后者的情况下，还原和非还原条件之间没有观察到差异，因为M. flagellatus的蛋白质由于半胱氨酸含量低而含有较少的二硫键（Jia等人，2024年）。这一点非常重要，因为含硫氨基酸在微生物蛋白质中是有限的（Sakarika等人，2022年）。现有研究还表明，蛋白质的质量及其含量同样关键，例如用于微藻肉类似物的Auxenochlorella protothecoides。尽管其蛋白质含量为50%，但其较小的、高度可溶的蛋白质由于疏水侧链较少，形成的网络较弱，从而阻碍了微藻肉类似物的形成（Sägesser等人，2024年）。此外，研究表明盐生菌的蛋白质可以执行与非盐生菌相同的功能，但其结构不同（Lanyi，1974年），这可能导致在食品应用中的技术功能特性不同。这表明除了蛋白质含量外，微生物细胞内的蛋白质质量也起着重要作用，不应被低估。根据培养条件，总氨基酸池显著变化（p < 5.8 × 10-5）。在低温条件下产生的样品中观察到最高的氨基酸含量（52.1 ± 0.93% gAA/gCDW），其次是对照组（45.1 ± 0.91% gAA/gCDW）和在低盐浓度下生长的样品（41.8 ± 0.75% gAA/gCDW）。在高盐和高温条件下生长的培养物含有相似的氨基酸水平（35.0 ± 1.81–2.26% gAA/gCDW）。虽然在大多数情况下总蛋白质和总氨基酸池的值相当（总蛋白质占总氨基酸池的0.92–1.07），但在对照组和高温生长的生物质中存在显著偏差，通过BCA测得的总蛋白质水平分别比总氨基酸池高1.50倍和1.42倍。这种差异可能反映了由于样品复杂性导致的总蛋白质的高估（Reichelt等人，2016年），这表明本研究中的BCA结果主要用作比较指标而非绝对量化。关于氨基酸谱（表2），亮氨酸（8.07–8.79% gAA/gTotalAA）和缬氨酸（6.72–7.05% gAA/gTotalAA）是最丰富的氨基酸，而半胱氨酸（0.27–0.76% gAA/gTotalAA）和组氨酸（1.41–1.99% gAA/gTotalAA）是最少的。含硫氨基酸根据培养条件的变化最为显著，与对照组相比，半胱氨酸和甲硫氨酸的含量分别增加了64.7–184.2%和26.3–130%（p < 0.0071）。甲硫氨酸在低温培养下的增加最为明显，而半胱氨酸在低盐条件下达到峰值。两种氨基酸在高温下都有中等程度的增加，而在高盐条件下变化较小。相反，甘氨酸含量在大多数条件下减少了2.6–22.9%，除了在低温下生长的生物质，其含量略有增加（2.4%）。还原和非还原SDS-PAGE（图5）之间的差异突显了二硫键的存在（非还原SDS-PAGE中的较大带表明二硫键将寡聚形式或亚基结合在一起），其中对照组产生的生物质差异最大（44.7%），而低温组最小（17.4%）（表S6）。P. zeaxanthinifaciens中的蛋白质主要是低分子量的（<50 kDa），与M. flagellatus相似（Jia等人，2024年）。然而，在后者的情况下，由于M. flagellatus的半胱氨酸含量低，还原和非还原条件之间没有观察到差异（Jia等人，2024年）。这一点非常重要，因为含硫氨基酸在微生物蛋白质中是有限的（Sakarika等人，2022年）。现有研究还表明，蛋白质的质量及其含量至关重要，例如用于微藻肉类似物的Auxenochlorella protothecoides。尽管其蛋白质含量为50%，但其较小的、高度可溶的蛋白质由于疏水侧链较少，形成的网络较弱，从而阻碍了微藻肉类似物的形成（Sägesser等人，2024年）。此外，研究表明盐生菌的蛋白质可以执行与非盐生菌相同的功能，但其结构不同（Lanyi，1974年），这可能导致在食品应用中的技术功能特性不同。这表明除了蛋白质含量外，微生物细胞内的蛋白质质量也起着重要作用，不应被低估。总氨基酸池根据培养条件显著变化（p < 5.8 × 10-5）。在低温条件下产生的样品中观察到最高的氨基酸含量（52.1 ± 0.93% gAA/gCDW），其次是对照组（45.1 ± 0.91% gAA/gCDW）和在低盐浓度下生长的样品（41.8 ± 0.75% gAA/gCDW）。在高盐和高温条件下生长的培养物含有相似的氨基酸水平（35.0 ± 1.81–2.26% gAA/gCDW）。虽然总蛋白质和总氨基酸池的值在大多数情况下相当（总蛋白质占总氨基酸池的0.92–1.07），但在对照组和高温生长的生物质中存在显著偏差，通过BCA测得的总蛋白质水平分别比总氨基酸池高1.50倍和1.42倍。这种差异可能反映了由于样品复杂性导致的总蛋白质的高估（Reichelt等人，2016年），这表明本研究中的BCA结果主要用作比较指标而非绝对量化。关于氨基酸谱（表2），亮氨酸（8.07–8.79% gAA/gTotalAA）和缬氨酸（6.72–7.05% gAA/gTotalAA）是最丰富的氨基酸，而半胱氨酸（0.27–0.76% gAA/gTotalAA）和组氨酸（1.41–1.99% gAA/gTotalAA）是最少的。含硫氨基酸根据培养条件的变化最为显著，与对照组相比，半胱氨酸和甲硫氨酸的含量分别增加了64.7–184.2%和26.3–130%（p < 0.0071）。甲硫氨酸在低温培养下的增加最为明显，而半胱氨酸在低盐条件下达到峰值。两种氨基酸在高温下都有中等程度的增加，而在高盐条件下变化较小。相反，甘氨酸含量在大多数条件下减少了2.6–22.9%，除了在低温下生长的生物质，其含量略有增加（2.4%）。其他氨基酸的变化特定于每种培养条件。P. zeaxanthinifaciens中的蛋白质通常富含缬氨酸和苯丙氨酸，但相对于未经处理的M. flagellatus生物质（Jia等人，2024年）来说，赖氨酸和组氨酸的含量较低。同样，温度显著影响了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的氨基酸组成，在22°C、30°C和37°C的培养温度下观察到组氨酸、丙氨酸和精氨酸含量的显著差异（Martinez-Force & Benitez，1995年）。氨基酸谱被发现影响微藻生物质在肉类似物中的功能。微藻生物质中的疏水氨基酸比SPC或PPI少，导致疏水相互作用潜力降低（Sägesser等人，2024年）。SPC和PPI中较高的疏水氨基酸含量促进了更强的网络形成。在这里，对照组、高盐和低温组的疏水氨基酸含量相当（约为48% gAA/gTotalAA），而低盐（46.48 ± 0.08 gAA/gTotalAA）和高温（47.52 ± 0.38 gAA/gTotalAA）组的蛋白质中这些氨基酸的含量显著较低（p<0.002）（表2）。尽管观察到一些显著差异，但1%的变化不太可能显著影响生物质的技术功能特性。因此，没有观察到疏水氨基酸含量与网络形成之间的明确关系。此外，微藻生物质中含有高水平的游离氨基酸，这些氨基酸可能作为“链断裂剂”阻碍网络形成而不是促进网络形成（Sägesser等人，2024年）。3.3. 微生物生物质的物理化学和热性质受培养条件的影响3.3.1. 生物质和蛋白质的溶解度、持水能力、等电点、pH值和ζ电位P. zeaxanthinifaciens生物质的物理化学性质受到培养条件的显著影响（图6）。生物质的分散性（或溶解度）变化很大，范围从22.3 ± 0.6%到46.0 ± 0.8%，在低盐条件下溶解度最高，在高盐条件下最低。溶解的生物质成分主要来自冷冻过程中的细胞裂解，或是未通过洗涤去除的生物质结合化合物。这些包括广泛的分子（300-5,000 kDa），包括细胞蛋白质、（多）糖类或生物质结合的细胞外聚合物物质（EPS）（Ni等人，2010年）。与生物质类似，蛋白质的溶解度也从10.4 ± 0.4%到15.6 ± 1.1%不等，低盐条件下生长的生物质溶解度最高，而在对照条件下生长的生物质溶解度最低。这表明微生物生物质的掺入和在配方中的功能性受到培养条件的影响。下载：下载高分辨率图像（354KB）下载：下载全尺寸图像图6. (a) 不同培养条件下生长的P. zeaxanthinifaciens的生物质溶解度 (b) 和 (c) 持水能力 (d) 以及等电点。显示了平均值和标准偏差（n=3）。使用双尾独立t检验对对照组和测试条件进行了成对比较。显著性水平如下表示：p < 0.0001（****），p < 0.001（***），p < 0.01（**），p < 0.05（*），p > 0.05（ns）。对照培养条件基于培养收集的建议。培养条件还显著影响了持水能力（WHC），范围从1.6 ± 0.0到3.6 ± 0.1 g/gCDW。在低温下生长的生物质样品中观察到最高的WHC，而低盐条件下的WHC最低。高WHC表明生物质保持水分的能力，这可能增强肉类似物的多汁性和质地。P. zeaxanthinifaciens生物质的WHC与植物蛋白质相当，例如豆类蛋白质分离物的WHC范围根据其加工历史和来源在1.8到6.8 g/gCDW之间（Ma等人，2022年）。然而，如低盐样品所示，低WHC可能导致干燥或易碎的质地，从而需要化学或机械处理（Cardoso Alves等人，2023年）。作为比较，未经处理的M. flagellatus生物质显示出显著更高的WHC（大约20 g/gCDW），这可能是由于蛋白质和多糖的贡献。然而，在WHC分析过程中不能排除凝胶状结构中的水分捕获，可能导致高估（Jia等人，2024年）。P. zeaxanthinifaciens生物质的pH值从高温下生长的生物质的5.71到对照组的6.89不等（表S8）。尽管大多数蛋白质被认为位于微生物细胞内，这可能限制了有效蛋白质网络的形成，但pH值的变化可能影响加工过程中自由或释放蛋白质的静电相互作用和二硫键的形成。更碱性的条件已知可以促进更强的蛋白质网络，如SPC和PPI（pH 7.0–7.5）（Sägesser等人，2024年）。M. flagellatus生物质及其蛋白质组分的pH值通常在较窄的范围内（6.2–6.3）（Jia等人，2024年），而微藻生物质的pH值在5.8到6.5之间，影响其作为肉类似物的适用性（Sägesser等人，2024年）。P. zeaxanthinifaciens生物质的等电点在2.8 ± 0.02到3.4 ± 0.1之间，其中在低盐浓度下生长的生物质具有最高的值，而在高盐条件下生长的生物质具有最低的值。这种变化可能与培养条件引起的生物质和蛋白质组成的变化有关，包括氨基酸组成或蛋白质含量的差异。此外，不同离子的含量和组成也可能导致差异，因为不同条件下的矿物质含量也有所变化（图3）。ζ电位（图S4）反映了影响溶解度和乳化的表面电荷，其值在中性pH下为高度负值（-45 mV），这是细菌生物质的典型范围（Halder等人，2015年；Jia等人，2024年；Zając等人，2023年）。这种高ζ电位低于例如豆类蛋白质分离物，在pH 6-7时的值约为-30和-35 mV（Ladjal-Ettoumi等人，2016年），但这些值取决于它们的加工历史和组成。在介质中高盐浓度下产生的生物质具有最低的绝对ζ电位（较不负），可能是由于磷脂的存在。在M. flagellatus中也观察到了类似的趋势，假设细菌脂多糖对其高度负的ζ电位有贡献，范围在-50到-40 mV之间（Jia等人，2024年）。该研究中破坏细胞的绝对ζ电位低于完整细胞，这突显了结构完整性在维持表面电荷中的作用。3.3.2. 微生物生物质的热性质受培养条件的影响DSC分析显示微生物生物质的热性质存在显著变化，蛋白质变性和其他细胞成分（如熔化）的分解都有所不同，这些都与加工过程中的行为相关，并受到培养条件的影响（表3，图S5）。在对照组和高盐条件下生长的生物质的主要热转变温度略低于100°C，而在高温下生长的生物质在100°C以上达到峰值。在低盐浓度下生长的样品变化更大，其中一个重复实验在90°C之前显示出峰值，这可能反映了生物质的异质性，需要谨慎解释，而在低温下生长的样品显示出多个明显的峰值。焓值普遍较低，这对于含有多种蛋白质和成分的样本来说是典型的。表3显示了在不同培养条件下生长的P. zeaxanthinifaciens生物体的变性/熔化起始温度（Tonset）、变性/熔化峰值温度（Tpeak）以及变性/熔化焓。分析了重复实验的平均值±标准偏差（n）。
| 条件 | Tonset (°C) | Tpeak (°C) | 焓 (J/g) |
|------|---------|---------|---------|
| 对照 | 0.0 ± 0.0 (n=4) | 0.0 ± 0.0 (n=4) | 0.0 ± 0.0 (n=4) |
| 高盐 | 0.0 ± 0.0 (n=4) | 0.0 ± 0.0 (n=4) | 0.0 ± 0.0 (n=4) |
| 低盐 | 0.0 ± 0.0 (n=3) | 0.0 ± 0.0 (n=3) | 0.0 ± 0.0 (n=3) |
| 高温 | 0.0 ± 0.0 (n=3) | 0.0 ± 0.0 (n=3) | 0.0 ± 0.0 (n=3) |
| 低温 | 64.6 ± 0.2 (n=3) | 67.3 ± 0.1 (n=3) | 0.027 ± 0.002 (n=3) |
| 峰值1 | 75.6 ± 0.6 (n=2) | 77.0 ± 0.5 (n=2) | 0.008 ± 0.000 (n=2) |
| 高盐 | 0.0 ± 0.0 (n=4) | 0.0 ± 0.0 (n=4) | 0.000 ± 0.000 (n=4) |
| 低盐 | 81.7 (n=1) | 87.2 (n=1) | 0.494 (n=1) |
| 高温 | 0.0 ± 0.0 (n=3) | 0.0 ± 0.0 (n=3) | 0.000 ± 0.000 (n=3) |
| 低温 | 80.1 ± 1.1 (n=3) | 84.8 ± 0.2 (n=3) | 0.105 ± 0.021 (n=3) |
| 峰值3 | 96.3 ± 1.5 (n=4) | 99.9 ± 1.7 (n=4) | 0.118 ± 0.023 (n=4) |
| 高盐 | 94.7 ± 0.1 (n=4) | 97.8 ± 0.6 (n=4) | 0.049 ± 0.024 (n=4) |
| 低盐 | 95.5 (n=1) | 102.1 (n=1) | 0.081 (n=1) |
| 高温 | 97.0 ± 2.2 (n=3) | 101.4 ± 1.1 (n=3) | 0.103 ± 0.012 (n=3) |
| 低温 | 96.9 ± 2.8 (n=3) | 103.6 ± 0.3 (n=3) | 0.134 ± 0.017 (n=3) |
变化的焓值突显了培养条件对生物体热特性的影响（表3），这可能会影响其加工过程。对于对照样本，在99.9°C处的峰值具有显著更高的焓（0.118 ± 0.023 J/gCDW）。在高盐和高温下生长的生物体也显示出接近97.8°C和101.4°C的可测量焓值，分别为0.049 ± 0.024 J/gCDW和0.103 ± 0.012 J/gCDW。低温样本具有最高的焓（0.134 ± 0.017 J/gCDW），并且在三个峰值中变性/熔化温度逐渐升高，表明在加工过程中具有更大的热韧性。对照样本表现出一致且显著的热转变，表明了大分子的稳定性。这些发现强调了培养条件在用于肉类替代品的微生物生物体热行为中的关键作用。
样本之间存在差异，其中低温和低盐条件下生长的生物体差异最为明显。这些差异的原因多种多样，难以解释。需要进一步的研究来理解这些热行为背后的机制。比较不同微生物物种的轮廓可以揭示这些趋势是普遍的还是特定于微生物物种的。在低温下生长的生物体在较高温度下表现出强烈的变性，表明在加工过程中具有较高的韧性。许多峰值在第二次运行后消失，表明发生了不可逆的结构损伤，这符合Jia等人（2024年）的研究结果，他们在M. flagellatus样本中识别出三个吸热峰，表明了DNA熔化、蛋白质变性和细胞壁分解的贡献。观察到的焓值较低（低于0.8 J/gCDW），可能是由于组成或各种大分子的共同作用，每种大分子都有不同的变性/熔化温度。这些发现与本研究一致，强调了培养条件对微生物生物体热特性的影响。
3.4. 培养条件影响了用于肉类替代品的微生物生物体的结构特性
3.4.1. 微生物生物体的流变特性受到培养条件的影响
这项筛选研究发现，生物体的流变特性受到培养条件的显著影响（图7），尽管需要进一步深入分析以完全理解其背后的机制。在20% CDW下的粘度变化很大，从低剪切率（0.1 s-1）时的3.3 ± 0.3 Pa⋅s到251.9 ± 66.9 Pa⋅s不等，对照样本显示出最高的粘度，而低盐和高温样本的粘度最低，并且溶解度最高（>40%）。后两种样本的WHC也最低（图6），因为高WHC通常与水分融入网络有关，从而导致更高的粘度。相比之下，对照、低温和高盐样本的较高粘度表明生物体具有更复杂的结构，这可能是由于EPS含量较高（Yang等人，2019年），EPS通常含有分支或复杂的多糖（Kaur & Dey，2023年）。与之前的研究相比，M. flagellatus生物体在15% w/w下的低剪切率（0.1 s-1）时的粘度在5到700 Pa⋅s之间（Jia等人，2024年），而SPC在13% w/w时约为8 Pa⋅s（Peng等人，2021年）。
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图7. 在不同培养条件下生长的P. zeaxanthinifaciens生物体的流变特性：(a) 粘度作为剪切率的函数；(b) 使用1%应变和1 Hz频率的温度扫描；(c) 应变在0.1–1000%之间的幅度扫描；(d) 使用1%应变和1 Hz频率的封闭腔流变仪（CCR）进行温度扫描。次要y轴代表温度曲线。显示了平均值（线条）和标准偏差（阴影区域）（n=2）。
所有样本都表现出剪切稀化行为，即粘度随着剪切率的增加而降低，降至0.3 ± 0.0-1.7 ± 0.4 Pa⋅s（100 s-1）。M. flagellatus生物体中的类似趋势归因于干燥过程中形成的细菌聚集体的破裂以及在剪切作用下的细菌细胞重新溶解或排列（Jia等人，2024年）。在较高剪切率下，如P. zeaxanthinifaciens的球形到短杆形的长微生物细胞的排列可能会降低粘度。此外，EPS可能形成在高压下解开的缠结网络，而微生物细胞、EPS和水之间的流体动力学相互作用也可能有助于降低粘度。生物体组分的变形和在剪切作用下的松散细胞分离也可能起作用，尽管需要进一步的研究来确认这些假设。
对于所有样本，储存模量G’随温度升高而增加（图7(b)），表明通过热诱导凝胶化，可访问蛋白质的展开、变性和网络形成。在室温下，对照和低温生长的生物体样本的G’最高，而低盐样本的G’最低，表明后者的流动性更强。加热（50°C）10分钟后，对照、低温和低盐样本的G’显著增加，而对于高盐生物体，G’的增加发生在大约65°C（15分钟）之后，而对于高温样本，G’的增加从开始就较为渐进。进一步将温度升高到85-90°C（22-23分钟）后，高盐、低盐和低温样本的G’显著增加，这些温度被认为是更热稳定蛋白质的变性温度（表3）。冷却后，G’继续增加，因为凝胶固化，对照、高盐和低温样本的G’达到更高的值（约850-1,500 Pa），而低盐和高温样本的G’较低（约240-350 Pa），表明前者的凝胶化性能更好。与植物蛋白质相比，不同豌豆组分在冷却结束时的G’在30到1,200 Pa之间（Kornet等人，2021年），低于M. flagellatus组分的6,000-10,000 Pa（Jia等人，2024年）。
在热诱导凝胶化之后，进行了恒定频率下的幅度（应变）扫描，以确定线性粘弹性区域的长度（图7(c)），其结束点定义为G’从其起始值偏离5%的应变，称为临界应变。随着应变的增加，G’降低，表明凝胶网络被破坏，从弹性行为转变为粘性行为。对于大多数样本，临界应变发生在0.25-0.5%，除了低盐样本的临界应变略高，约为0.8%（表S10），表明其对大变形有更高的抵抗力。
CCR也被用来模拟生物体在剪切细胞中的行为（图7(d)）。微生物生物体在CCR中显示出典型的热诱导凝胶化模式。G*在40–90°C之间增加，这是由于蛋白质变性和聚集，然后在更高温度（100–135°C）下降，这是由于分子运动或基质破坏。冷却后，凝胶固化，G*增加到最终值180,000–270,000 Pa。值得注意的是，低温、高盐和对照条件下生长的微生物生物体在冷却后再次显示出最高的G*值，证实了蛋白质之间更强的网络形成和相互作用（Berghout等人，2015年），如早期在应力控制流变仪上的温度扫描（图7(b)）所示。相比之下，高温和低盐条件下生长的生物体没有形成凝胶。
凝胶化行为的差异是多种因素相互作用的结果（总结在表S10中），包括生物体组成和结构、可访问蛋白质含量和分子特性（例如蛋白质结构、大小、天然或变性状态）、非蛋白质成分如多糖和矿物质，以及物理化学和热特性。尽管低盐和高盐生物体的蛋白质含量低于对照（图3），但它们达到了相似的最终G’，表明具有良好的凝胶化能力。低温生物体的凝胶化曲线与对照相似，初始和最终G’值接近。虽然大多数蛋白质特性（如大小和结构）以及生物体的WHC与对照一致，但不同可访问蛋白质的存在或（未考虑的）非蛋白质成分可能影响了其凝胶化行为（表3）。例如，在高温生物体的情况下，显著高的矿物质含量可能会影响凝胶结构和强度，这取决于盐的类型和浓度，如其他研究所示。因此，必须综合考虑蛋白质和非蛋白质相关因素在凝胶化中的作用（Kinekawa等人，1998年）。
鉴于凝胶化特性与其他因素（如溶解度、离子强度、颗粒大小、蛋白质浓度或半胱氨酸含量）之间缺乏明确的相关性，需要进一步的有针对性的研究来更好地理解这些复杂的相互作用。
3.4.2. 培养条件影响了通过剪切细胞制备微生物肉类替代品的特性
培养条件对微生物生物体的特性（表S10）和最终产品（图8）有显著影响，这是之前尚未探索的。即使在添加WG和剪切之前也是如此。当20克微生物生物体与60克水混合并水化30分钟后，高盐样本显得黏稠且呈水状，低盐样本也是水状的，而高温样本比其他样本更水状（图S7）。相比之下，对照和低温样本形成了稳定的混合物（图S7），从而产生了更有质地的最终产品（图8）。
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图8. (a) 在不同培养条件下生长的P. zeaxanthinifaciens微生物生物体与小麦面筋制成的肉类替代品的纤维结构，通过剪切细胞形成。微生物样本被水化，与小麦面筋（1:1 w/w）混合并剪切以形成纤维结构。单独使用小麦面筋作为对照。所有样本的最终干重为40%。使用高温生长的微生物生物体制成的肉类替代品没有产生结构化的肉类替代品。拉伸断裂（b）和（c）肉类替代品的应力及应变。显示了平均值和标准偏差（n=3）。使用双尾独立t检验对使用小麦面筋和微生物生物体与小麦面筋组合的肉类替代品进行了成对比较。显著性水平如下：p < 0.0001（****），p < 0.001（***），p < 0.01（**），p < 0.05（*），p > 0.05（ns）。应力-应变曲线显示在图S9中，原始数据在表S9中。
在制备肉类替代品时，所有微生物生物体样本都与WG以1:1的质量比混合。高温样本没有产生结构化的肉类替代品，而是形成了糊状物，这可能是由于其高矿物质含量（图3），这强烈影响了肉类替代品的特性，并与CCR结果一致（图7(d)）。盐对生物体韧性的影响已在Rhizopus生物体中得到证明，其中较高的盐含量导致较低的韧性，这可能是由于细胞内的渗透压变化（Hüttner等人，2022年）。虽然适当的盐水平可以增强凝胶强度，但过高的浓度可能导致蛋白质聚集或可访问蛋白质的盐析效应，最终也会降低凝胶强度（Taghian Dinani等人，2023年）。
另一方面，低温样本形成了厚而强的纤维，比WG对照更强。总体而言，高盐和低温条件下的样品形成了更粗的纤维，而低盐和对照样品则形成了类似于小麦面筋（WG）的较细纤维。这可能归因于更接近固体的行为，如流变测量结果（第3.4.1节）所示，这可能是由于形成了更加紧密连接的凝胶网络。然而，低盐样品质地柔软且易于变形（类似面团），而高盐样品则具有较为易碎的质地。两种盐处理方法都产生了物理上更薄的产品，其中低盐处理的肉类类似物最为薄。值得注意的是，所有含有微生物生物质的样品都比基于WG的肉类类似物更具多汁性，并且纤维更粗。质地分析显示，不同样品具有不同的机械性能，拉伸应力和应变随培养条件而变化。在与剪切流平行的方向上，常被用作肉类类似物基准的小麦面筋具有最高的拉伸应力（91,800帕）和应变（105.1%）。低温培养在应力（89,600帕）和应变（111.4%）方面与小麦面筋相当，表现出高弹性和延展性。高盐浓度培养则导致结构显著变弱，拉伸应力和应变分别仅为5,070帕和36.7%。微生物生物质表现出明显的各向异性（依赖于方向），垂直于纤维流动方向的应力和应变较低。这是预期之中的，因为延长的纤维在其长度方向上的表面积大于平行方向，从而导致拉伸性能下降（Dekkers等人，2016年）。小麦面筋再次表现出最佳性能，在该方向上的应力降至32,300帕，而对照和低温培养的样品之间没有显著差异。在低温下培养的P. zeaxanthinifaciens生物质最为柔韧，应变达到了87.3%。高盐浓度培养始终导致结构脆弱且不均匀，而低盐浓度培养则表现出相似的性能。由于内在限制，如蛋白质在细胞内的封装以及蛋白质中半胱氨酸含量低（Sakarika等人，2022年），这限制了二硫键的形成，而二硫键对凝胶网络至关重要，因此使用微生物生物质获得纤维状、类似肉类的质地仍然具有挑战性。先前对M.flagellatus生物质的细胞破坏并未改善肉类类似物的纤维结构，反而形成了更加均匀的网络（Jia等人，2021年）。解决这一问题的策略包括将微生物生物质与植物基蛋白质（如SPC、PPI或小麦面筋）混合，以在挤出过程中增强纤维形成（Cardoso Alves等人，2023年）。然而，过量的小麦面筋添加会降低硬度和粘弹性（Yuliarti等人，2021年）。值得注意的是，小麦面筋与低温培养相结合产生了坚固的质地，具有粗纤维和高水分保持能力（WHC）及粘度。将植物蛋白质（如小麦面筋）与昆虫或微生物生物质混合已成为一种有前景的策略，可以生产出营养成分更优的肉类类似物（例如平衡的氨基酸和微量营养素含量），同时减少通常与植物蛋白质相关的不良风味和抗营养因素。这类配方通常被称为混合产品（Villacís-Chiriboga等人，2025年）。尽管本研究中小麦面筋与干物质的混合比例为1:1时蛋白质含量约为78%（Schreuders等人，2019年），但根据不同的生物生产条件，微生物生物质样品的蛋白质含量范围为37.5%至67.8%。将后者与小麦面筋混合后，肉类类似物的最终蛋白质含量从57.8%（高盐）到72.9%（对照）不等。有趣的是，尽管小麦面筋含量相同，高温和高盐样品在加工过程中表现出不同的行为，这突显了生物质pH值和多糖含量等因素对结构形成的强烈影响。即使仅使用植物蛋白质制备的肉类类似物，研究也表明蛋白质和多糖（如果胶）之间的相分离会调节异质结构的形成，果胶的类型显著影响例如大豆蛋白质在肉类类似物应用中的结构潜力（Snel等人，2024年）。鉴于本研究使用的生物质成分多样，包括大量的多糖，这些成分对结构的贡献不容忽视。然而，也不清楚在制备肉类类似物的过程中生物质是否（部分）被破坏，例如在高温和剪切条件下，这可能会进一步影响肉类类似物的质地。此外，如二硫键形成和可接触蛋白质之间的非共价蛋白质-蛋白质相互作用等内在特性在决定质地特征方面起着关键作用（Zhao等人，2024年）。与使用微藻生物质生产肉类类似物的研究相比，进一步强调了蛋白质质量在网络形成中的作用（Sägesser等人，2024年）。例如，A. protothecoides的蛋白质分子量大约小20%，溶解度提高18-68%，并且疏水侧链减少15-50%，这阻碍了网络的形成。此外，高含量的游离氨基酸可能充当“链断裂剂”，从而削弱蛋白质网络。已经提出通过调整pH值、离子含量、添加半胱氨酸或转谷氨酰胺酶来增强结构潜力（Sägesser等人，2024年）。这些例子突显了微生物生物质对肉类类似物中纤维形成的复杂多因素影响，强调了需要进行详细的机制研究以充分理解和优化其对结构和质地的贡献。尽管如此，在低于最佳温度下培养P. zeaxanthinifaciens所产生的微生物生物质能够形成坚固的纤维状质地，适用于与小麦面筋的混合产品。
4. 微生物肉类类似物生产中的关键知识空白和注意事项
微生物生物质作为一种更可持续和多用途的蛋白质来源，在肉类类似物生产中具有巨大潜力，但仍存在若干挑战和研究空白。已知培养条件会影响微生物生物质的组成（Sakarika等人，2023年），本研究进一步支持了这一点，并展示了它们对下游加工和产品特性的影响（表S10）。值得注意的是，微生物培养过程中的盐含量和温度对其作为肉类类似物原料的性能有显著影响，低温下生产的生物质形成了坚固的质地。这表明生长性能和功能性之间存在潜在的权衡，即次优的培养条件可能会改善与结构相关的技功能性，尽管它们不会产生最大的生物质产量。在丝状真菌中也报告了类似的权衡，其中应力条件可以改变生长和细胞特性，包括生物质组成和菌丝分支的变化（Yue等人，2024年），这可能会影响进一步转化为肉类类似物的过程。还应注意的是，这里的技术功能性仅针对肉类类似物的生产进行了评估，而在乳液或泡沫等其他应用中，这些组成变化可能会产生不同的反应。然而，我们工作中这些观察背后的机制仍不清楚。最近的研究表明，微生物生物质组成的差异会显著影响与食品结构相关的技术功能性（Bian等人，2026年），这突显了将大分子组成与预期应用相匹配的重要性。因此，应进一步研究特定培养条件在优化目标应用的大分子组成方面的作用。蛋白质质量和氨基酸谱似乎在质构化中起着关键作用。微生物生物质中的甲硫氨酸和半胱氨酸通常有限（Sakarika等人，2022年），而半胱氨酸含量低限制了二硫键的形成，这对形成纤维状和凝胶状结构至关重要。此外，关键的热处理步骤（如干燥和核酸还原）会影响蛋白质性质，但它们对质地和功能性的影响尚不完全清楚。本研究中观察到的使用低温生产的微生物生物质制成的肉类类似物的韧性可能与生物质组成（包括多糖含量和结构）、蛋白质组成和结构有关，因此其功能性也需要进一步研究。尽管P. zeaxanthinifaciens产生了类胡萝卜素zeaxanthin，但其对肉类类似物的技术功能性和感官特性的影响在本研究中未进行评估，应在未来的工作中加以探讨。下游加工对于提高技术功能性和感官特性至关重要，但它也会引入一些权衡，如营养损失、蛋白质变性以及对环境和经济可持续性的潜在不利影响（Cardoso Alves等人，2023年；Pereira等人，2024年）。常用的碱性和酸性处理可以增强蛋白质功能，但会改变最终产品的质地（Cardoso Alves等人，2023年）。将微生物生物质与植物蛋白质（如大豆）结合已被证明可以改善纤维质地和感官吸引力，表明与其他蛋白质来源混合可能缓解其中的一些挑战（Pereira等人，2024年）。我们证明了含有微生物生物质和小麦面筋的混合肉类类似物中的纤维形成随微生物培养条件而变化，突显了它们对生物质技术功能性的强烈影响。还应强调的是，使用整个微生物生物质而不是蛋白质提取物创建了纤维状产品。最后，目前尚不清楚来自革兰氏阴性细菌的发现是否适用于具有不同细胞壁特性的微生物生物质，或者是否可以在不添加小麦面筋的情况下形成纤维状产品。消费者接受度仍然是一个关键因素，这也受到心理和文化、感官特性以及经济考虑的影响（Pereira等人，2024年）。土腥味、色素沉着和高核酸含量是常见的需要解决的问题（Cardoso Alves等人，2023年；Y. Fu等人，2021年；Pereira等人，2024年）。此外，与传统来源相比，微生物蛋白质的生产成本较高，可能会限制其普及性（Pereira等人，2024年）。立法和安全障碍，如欧盟的新食品法规，也会延迟商业化，特别是当使用回收资源（如氮）或基于二氧化碳的原料时（Van Peteghem等人，2023年；Van Peteghem等人，2022年），尽管这些方法具有可行性和可持续性潜力，但仍可能遇到消费者的抵制。优化微生物生物质在肉类类似物中的应用需要进一步研究技术功能性、营养价值、吸引力和可持续性之间的联系。这项探索性工作强调了微生物细胞中不同分子之间的复杂相互作用，以及它们对肉类类似物形成的相关技术功能性。深入了解微生物菌株、加工步骤和产品特性之间的联系至关重要，无论是旨在模仿现有产品还是创造新产品。比较不同微生物物种和培养条件可以提供更广泛的知识，了解组成和培养条件如何影响微生物生物质的性质以及最终肉类类似物的质地和吸引力。
5. 结论
本研究的结果强调了培养条件对Paracoccus zeaxanthinifaciens生物质的大分子组成和功能特性的影响。在最佳生长条件下，蛋白质含量最高（67.8%），而在偏离最佳值的盐和温度条件下，蛋白质含量下降，低温培养产生的总氨基酸含量最高（52.1%）。除了大分子组成外，物理化学、热学和流变性质也根据培养条件而变化。重要的是，在对照和低温条件下生产的微生物生物质形成了适合与小麦面筋以1:1重量比混合的坚固纤维状质地，而在高温或盐含量偏离最佳值的情况下，形成了较弱的质地或无结构的糊状物。这些发现强调了优化培养条件在调整生物质质量、技术功能性和最终环境可持续性方面的重要性。
作者贡献声明
Nico Boon：写作——审阅与编辑、资源整理
Julia K. Keppler：写作——审阅与编辑、资源整理
Myrsini Sakarika：写作——审阅与编辑、初稿撰写、可视化、项目管理、方法学、数据分析、概念化
Yi Ling Chin：写作——审阅与编辑、资源整理、方法学、调查
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
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