在Pseudomonas chlororaphis H18中构建苯嗪-1-羧酸衍生物的生物合成途径并提高其产量

摘要

背景

吩嗪类化合物是一类具有多种生物活性的天然产物，包括抗肿瘤、抗寄生虫和抗菌特性。其中，吩嗪-1-羧酸（PCA）作为一种注册的生物农药，因其广谱抗真菌效果、低环境毒性以及作为开发抗肿瘤和抗结核药物的潜在先导结构而备受关注。然而，PCA衍生物的化学合成常常受到苛刻反应条件、有毒副产物和选择性差的限制，从而影响了其可持续生产。相比之下，生物合成作为一种绿色且可扩展的替代方法逐渐受到重视，但目前用于合成结构多样化的PCA衍生物的高效微生物平台仍不完善。

结果

为了解决这一难题，我们将Pseudomonas chlororaphis H18工程化为一种多功能的PCA衍生物生物合成细胞工厂。首先，我们研究了依赖S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基转移酶Pcm2的底物选择性，证明了其能够催化多种芳香族羧酸的甲基化和乙基化反应。这种催化多样性扩展了通过生物合成可获得的PCA衍生物的范围。通过将pcm2基因整合到P. chlororaphis H18的基因组中，我们首次实现了两种关键衍生物——吩嗪-1-羧甲基（PCM）和2-羟基吩嗪-1-羧甲基（2-OH-PCM）的从头合成途径。研究表明，PCM对烟草褐斑病原菌Alternaria alternata的杀菌活性优于PCA。为了提高PCM和2-OH-PCM的产量，我们实施了系统的代谢工程策略，包括：（1）增加细胞内SAM的供应量；（2）过表达关键基因；（3）敲除负调控因子；（4）阻断竞争性代谢途径。工程菌株H18A4在KB培养基中产生了124.6 mg/L的PCM和130.8 mg/L的2-OH-PCM。为了进一步提高PCM的产量并防止PCA的羟基化，我们破坏了phzO基因以阻止其转化为羟基化衍生物，同时增加了pcm2基因的拷贝数并优化了发酵条件。最终，工程菌株H18A6在连续发酵过程中产生了1.37 g/L的PCM，这标志着朝着可扩展的、基于生物的这种高价值化合物生产迈出了重要一步。

结论

本研究通过建立一种新的PCA衍生物生物合成途径，填补了技术空白，克服了化学合成的局限性，并扩展了可持续天然产物生产的范围。所提出的综合代谢工程策略（涵盖酶特性分析、代谢途径构建、代谢通量优化和工艺改进）为复杂高价值天然产物的微生物细胞工厂工程提供了可复用的模板。最终，这项研究有助于实现功能性复杂的吩嗪类化合物的绿色生产，应用于农业和制药领域。

图形摘要

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