杨一楚|狄青义|程玉静|刘俊飞|李毅业|李然|张婷|王中原|宋桂丽|拓素兴|钟克军|曾永忠|孔波|何文灿|甘恒环|姜淼|张旺
成都中医药大学药学院，中国四川省成都市611137
**摘要**
中风是一种常见的脑血管疾病，其特点是发病率高、致残率高、死亡率高等。山胡七士威丸（བྱུར་དམར་བདུན་ཅུ།，SHQSWP）是一种藏药处方，已被纳入国家食品药品监督管理局的国家药品标准ZZ-8432，批准号为Z54020114。SHQSWP具有缓解心悸、镇静和抗惊厥的作用，主要用于治疗脑血栓、脑出血和冠心病。本研究旨在探讨SHQSWP治疗脑缺血的机制。
**研究目的**
本研究旨在筛选SHQSWP治疗脑缺血的差异蛋白，并验证其在调节内质网应激信号通路中的作用机制。
**材料与方法**
采用三重四极杆液相色谱-质谱（HPLC-QqQ-MS）技术定量检测SHQSWP中的25种化学成分。通过TTC染色、HE染色、甲苯胺蓝染色和TUNEL染色验证SHQSWP对脑缺血（MCAO模型大鼠）的治疗效果。利用蛋白质芯片筛选差异表达蛋白，并通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析可视化筛选SHQSWP在脑缺血治疗中的潜在靶点和信号通路。利用分子对接技术预测SHQSWP中关键化合物与相关靶蛋白的结合亲和力和结合模式。通过RT-qPCR、WB和IF验证SHQSWP在脑缺血治疗中调控的信号通路和靶点。
**结果**
HPLC-QqQ-MS检测出SHQSWP中含有新绿原酸、异鼠李素、绿原酸、没食子酸、羟基山柰黄-A和番红花素Ⅰ等25种化学成分。不同剂量的SHQSWP均可降低MCAO大鼠的脑梗死发生率，改善脑组织皮层的神经行为和病理变化，增加皮层区域的尼氏体数量，并减少皮层区域的阳性凋亡细胞数量。蛋白质芯片预测显示，SHQSWP可能通过调节EPHA5、IL-1α、fractalkine、IL-10、IL-7和IL-3蛋白发挥治疗作用。分子对接分析表明，GRP78可能是SHQSWP中15种成分的共同主要靶点，而芦丁可能与7个关键靶点具有最强的结合力。SHQSWP可显著提高MCAO大鼠脑组织中PARP1和XBP1的mRNA表达水平，降低CHOP、GRP78和BAX的蛋白表达水平，并增加XBP1的蛋白表达水平。中等剂量的SHQSWP可降低大鼠脑组织中NLRP3、BAX和CHOP的荧光强度，同时增强XBP1的荧光强度。
**结论**
SHQSWP通过调节BAX、CHOP、GRP78和XBP1等关键蛋白，抑制内质网应激介导的凋亡，从而在脑缺血-再灌注损伤中发挥神经保护作用。
**引言**
山胡七士威丸（SHQSWP，藏文名：བྱུར་དམར་བདུན་ཅུ།）含有70种药材，如当归（Angelica sinensis）、党参（Codonopsis pilosula）、红景天（Rhodiola rosea）、沙参（Saussurea involucrata）、余甘子（Phyllanthus emblica）、番红花（Crocus sativus）、黄精（Polygonatum sibiricum）等。经过著名藏医药科学家白玛加措近10年的挖掘和配伍研究，SHQSWP得以成功复原和改进，并于1973年正式应用于临床实践。其独特的药物配伍体系于2008年被列入国家非物质文化遗产名录。该藏药是治疗缺血性中风的常用方剂，主要用于脑血栓等多种神经系统疾病。SHQSWP已被纳入国家食品药品监督管理局的国家药品标准ZZ-8432，批准号为Z54020114。然而，由于含有多达70种药材，化学成分复杂多样且活性成分不明确，相关研究和报道较少，因此对其开展现代科学研究显得十分紧迫。
藏医学认为人体内有内外相通的脉络，称为“连接脉”（藏文名：རྩ་ནག་ནད／rtsa ng和རྩ་དཀར་ནད／rtsa dkar）。其中“黑脉”大致对应现代医学中的血管，“白脉”对应神经，大脑是“白脉”的海洋。当内外因素影响人体导致血液功能紊乱、白脉受侵时，便会引发白脉疾病，缺血性中风属于白脉疾病。症状包括口眼歪斜、肢体僵硬、麻木抽搐、偏瘫等。SHQSWP具有镇心安神、平息惊厥和调节血液的作用，主要用于治疗中风、冠心病、高血压、肢体瘫痪、小儿麻痹症和癫痫等心脑血管及神经系统疾病，充分体现了藏医学“脉脉相治”的核心治疗理念。
当归被誉为“补血圣药”，具有补血活血、润肠通便的功效，可能对脑缺血损伤具有治疗作用，其机制涉及改善脑血流、促进血管生成、抗炎和神经保护（Zhou和Han，2024）。党参具有健脾益肺、养血生津的作用。王等人（Wang等，2024）发现党参汤可通过调节趋化因子、缺氧诱导因子和神经炎症介质的水平，对慢性脑缺血大鼠具有保护作用。红景天具有补气活血、疏通经络和缓解哮喘的作用。 Wen等人（Wen等，2022）发现天然化合物salidroside可通过促进线粒体自噬和抑制线粒体依赖性神经元凋亡来改善脑缺血-再灌注损伤。沙参具有温肾壮阳、祛风除湿和活血的作用。朱等人（Zhu等，2010）发现雪莲花注射液对脑缺血-再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与降低脑组织中的TNF-α、IL-1β和MMP-9水平有关。余甘子具有清热凉血、消食健胃和生津止咳的作用。张等人（Zhang等，2014）建立了脑缺血-再灌注大鼠模型，发现余甘子提取物可显著减少脑梗死面积，提高脑组织中超氧化物歧化酶活性，降低MDA、NO、IL-1β、IL-6和诱导型一氧化氮合酶及核因子-κB（NF-κB）的水平，具有神经保护作用。番红花具有促进血液循环、活血化瘀、凉血解毒和缓解抑郁的作用。李等人（Li等，2022）发现番红花提取物可显著降低脑缺血后神经元的凋亡指数，减少TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症因子水平，下调TLR4、磷酸化NF-κB p65/NF-κB p65和磷酸化IκBα/IκBα蛋白的表达，表明其可能通过抑制TLR4/NF-κB通路和减少炎症反应及神经元损伤发挥保护作用。张等人（Zhang等，2011）发现珊瑚提取物可显著降低脑缺血大鼠血液中的MDA含量并提高SOD活性，增强机体抗氧化能力。这些药材是SHQSWP的主要成分，长期用于治疗脑神经系统疾病，多数来自青藏高原，具有独特的药理价值。
液相色谱-质谱（LC-MS）技术具有高灵敏度和选择性（Liu和Cheng，2025）。操作过程中，各物质组分依次通过液相色谱分离后进入质谱仪，在离子源处发生离子化，再由质量分析仪根据质荷比差异进行分离和检测，生成相应物质组分的质谱图。研究人员可利用这些质谱图对目标化合物进行定性和定量分析。张等人（Zhang等，2016）对SHQSWP样品进行微波消化并利用原子吸收光谱法精确测定重金属含量，发现不同批次间的重金属含量存在差异，为该方剂的定量分析提供了初步依据。目前关于SHQSWP化学成分的研究主要集中在矿物质和重金属方面，植物来源化学成分的分析和报道较少。
在内蒙古自治区兴安盟克佐中旗的图勒玛窦中心卫生中心（Bian，2012），4名经CT扫描诊断为脑出血的患者接受了SHQSWP的临床治疗，20天后症状明显缓解。出院后患者继续服用SHQSWP，未出现其他不良反应，表明SHQSWP对脑出血具有临床疗效。任旺等人（Renwang，2005）报道了208例中风患者的后遗症情况，其中138例为缺血性中风，70例为出血性中风，主要使用七士威珍珠丸和SHQSWP进行治疗，其他藏药的添加或减少根据患者体质和病情决定。缺血性中风的总有效率为86.2%，出血性中风的有效率为80%。
除用于脑出血外，SHQSWP还可用于治疗高血压（Qinglamu，2013；Zhao，2011）、腰椎间盘突出（Qiao等，2016）和顽固性心力衰竭（He等，2007）。药理学研究中仅探讨了SHQSWP的降脂作用（Chun等，2022）。Chun等人（Chun等，2022）发现低、中、高剂量的SHQSWP可显著降低血清TC、TG和LDL-C水平及HMGCR蛋白表达，提高HDL-C水平、AMPK磷酸化和LKB1蛋白表达（P < 0.05），并不同程度改善高脂血症（HLP）模型大鼠的肝组织病理变化。这些结果表明SHQSWP可降低HLP模型大鼠的血脂水平，其机制可能与抑制LKB1/AMPK信号通路有关。总体而言，关于SHQSWP作用机制的研究仍较为缺乏。本研究初步揭示了SHQSWP对抗内质网应激的机制（Bederson等），为临床实践提供理论参考。蛋白质芯片是一种高通量监测系统，可用于分析蛋白质表达谱（Zhou等，2017），作为基因芯片的补充，用于高通量比较分析（Qiu等，2014）。蛋白质与抗体或蛋白质与小分子的结合可快速高效地找到药物靶点。Roche等人（Roche等，2008）使用含8295个人类基因的蛋白质芯片研究阿尔茨海默病、多发性硬化症和睡眠呼吸暂停等患者的脑脊液，发现该方法可区分这些复杂疾病患者。Zhou等人（Zhou等，2017）利用蛋白质芯片技术发现申力佳颗粒可保护心力衰竭大鼠的心肌。在本研究中，我们还选择使用蛋白质芯片技术来筛选SHQSWP在脑缺血-再灌注损伤治疗中的差异蛋白，为后续的机制研究提供了物质基础。在缺血性中风的早期阶段，脑缺血中心区域的神经细胞主要以坏死的形式死亡；而缺血中心区域周围的神经细胞仍具有代谢活性，其随后的死亡主要是凋亡（Song等人，2012年）。脑缺血-再灌注损伤可导致内质网应激（ERS）。当内质网环境受到干扰时，蛋白质会发生折叠或错误折叠。此时，ERS被激活，它可以调节神经元的凋亡和自噬，在缺血性中风中起着重要作用（Liu等人，2021年）。脑组织损伤发生后，未折叠或错误折叠的蛋白质积累会引发ERS，通过一系列称为未折叠蛋白反应（UPR）的复杂信号通路来维持神经细胞的稳态；然而，过度激活可能会诱导凋亡（Yu和Zou，2022年）。脑缺血-再灌注会导致血液迅速回流，缺血区域血液中的氧气和葡萄糖水平迅速升高，以及活性氧（ROS）的迅速增加，最终促使丙二醛的产生，破坏内质网平衡，引发ERS，并损害脑组织结构和神经功能（Zhang等人，2022年）。脑缺血后的ERS可导致神经元凋亡和坏死，这是再灌注损伤的重要原因之一。因此，抑制ERS已成为治疗脑缺血的关键治疗靶点之一（Chen等人，2016年；Fu等人，2021年；Xie等人，2008年）。Peng等人（Peng等人，2021年）研究了改良的益气通玄方在保护脑缺血免受ERS方面的机制。结果表明，该方剂的疗效可能与ERS介导的凋亡途径相关蛋白GRP78、CHOP和Caspase 12的表达有关。GRP78是一个关键指标（Peng等人，2021年），而CHOP也起着关键作用（Peng等人，2021年）。IRE1有两种形式，IRE1α和IRE1β，它是一种位于内质网膜上的I型跨膜蛋白激酶，并具有激酶活性（Ni等人，2018年）。在接下来的研究中，我们可以从ERS入手，寻找与ERS介导的凋亡相关的因素或蛋白，并探索SHQSWP在脑缺血治疗中的抗凋亡机制。在大脑中，fractalkine主要由神经元表达，而其受体特异性地表达在小胶质细胞上，小胶质细胞被认为是表达NLRP3炎性小体的主要细胞类型。外源性fractalkine作用于小胶质细胞上的受体，调节NLRP3炎性小体亚基的水平并减少前额叶皮层中的细胞因子产生（Ślusarczyk等人，2016年），这表明fractalkine在神经炎症和ERS之间起着关键的桥梁作用。研究表明，fractalkine通过上调促凋亡蛋白BAX和下调抗凋亡蛋白BCL-2来促进凋亡（Zhang等人，2016年）。此外，内质网及其相关蛋白也可能参与Ccl2/Cx3cr1缺陷小鼠中观察到的视网膜表型。过度的ERS可以诱导多种炎症因子的表达，从而介导凋亡并促进疾病的发生和发展。例如，温阳生肌膏通过下调GRP78/CHOP通路、减少Caspase 12的表达以及降低促炎细胞因子IL-1β的水平来减轻ERS引起的组织损伤（Ding等人，2024年）。同样，甘草中的isoliquiritigenin和glycyrrhetinic acid可以调节VSIG4/NLRP3炎症复合体通路，降低IL-17水平和NLRP3及IL-1β的表达（Wang等人，2026年）。在凋亡调节方面，BCL-2家族蛋白起着关键作用：抗凋亡蛋白BCL-2抑制细胞色素c的释放并阻断caspase通路的激活，而促凋亡蛋白BAX则转移到线粒体以启动凋亡（Hu等人，2018年）。研究证实，上调BCL-2和下调BAX可以减轻导管细胞中的IL-1β诱导的凋亡（Ai等人，2022年）。此外，IL-17通过TRAF2招募PIAS2和ELAVL1来诱导EPHA5的表达，从而促进黑色素瘤的生长（Du等人，2023年）。同时，EPHA2的过表达上调Cyclin D1和抗凋亡蛋白BCL-2，同时下调促凋亡蛋白BAX（Wang等人，2025年）。总之，Eph家族蛋白、各种白细胞介素和fractalkine等因子共同构成了一个复杂的调控网络，影响NLRP3炎性小体、BCL-2/BAX平衡以及GRP78/CHOP信号通路。这个网络与ERS过程密切相关，协同参与凋亡和炎症反应的调节。目前，SHQSWP研究中仍有许多空白领域尚未得到研究。目前对SHQSWP的成分分析还不够充分，只有少数研究对其疗效和安全性进行了探讨。因此，本研究以SHQSWP为研究对象，使用三重四极液相色谱-质谱（HPLC-QqQ-MS）进行定量分析，以确保SHQSWP的质量可控性。在MCAO模型大鼠中，通过TTC染色、HE染色、甲苯胺蓝染色和TUNEL染色来验证SHQSWP治疗脑缺血的有效性。通过蛋白质芯片技术筛选了SHQSWP在脑缺血治疗中的潜在信号通路和靶点。随后，通过分子对接预测了SHQSWP中关键化合物与关键靶点之间的相互作用。利用逆转录定量PCR（RT-qPCR）、Western blotting（WB）、免疫荧光（IF）等现代分子生物学方法揭示了SHQSWP通过抑制ERS介导的凋亡来治疗脑缺血的分子机制。
**材料**
药物：SHQSWP（NMPN：Z54020114，批号：20231101）购自西藏雄巴拉库神水藏药有限公司，用于HPLC-QqQ-MS和药效学研究。尼莫地平片（NMPN：H20003010，批号：BJ45200）购自拜耳 Healthcare有限公司。
HPLC-QqQ-MS研究试剂：新绿原酸（A0023）、没食子酸（A0110）、α-阿魏酮（A1140）、羟基山柰黄A（A0380）、芦丁（A0103H）、隐绿原酸（A1352）、芒果苷（A0309）、槲皮素
**SHQSWP中25种化学成分的含量测定**
通过HPLC-QqQ-MS测定了SHQSWP中以下25种化学成分的含量：新绿原酸、异鼠李素、绿原酸、没食子酸、α-阿魏酮、羟基山柰黄A、芦丁、liquiritin、隐绿原酸、芒果苷、isoliquiritigenin、costunolide、肉桂酸、crocin I、芹菜素、咖啡酸、木犀草素、biochanin A、原儿茶酸、乌头碱、naringenin、甲基没食子酸、emodin和calycosin-7-O-beta-glucoside。
**讨论**
目前，关于SHQSWP的化学成分的研究还很少。例如，Yi等人（Yi等人，2024年）使用GC-MS分析了SHQSWP中的挥发油和脂溶性成分，并初步明确了其挥发油成分。现有的化学成分研究主要集中在SHQSWP中重金属、矿物质成分以及挥发油和脂溶性成分的定性和含量测定上。在本研究中，使用了HPLC-QqQ-MS。
**结论**
本研究共鉴定出SHQSWP中的25种化学成分，为其质量稳定性和后续研究的重复性提供了保障。低剂量、中等剂量和高剂量的SHQSWP对脑梗死区域有一定的改善效果，可以改善神经行为和病理变化，增加Nissl小体的数量，并减少凋亡细胞的数量。特别是在皮质区域观察到了最佳的治疗效果。
**作者贡献声明**
Chenlei Ganghuan：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督。
Miao Jiang：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督。
Yiyue Li：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学。
Yongzhong Zeweng：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学。
Yichu Yang：撰写 – 原稿撰写、可视化、软件应用、方法学、数据分析。
Bo Kong：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学。
Qingyi Di：撰写 – 审稿与编辑、撰写。
**未引用参考文献**
Bederson等人，1986b；Huang等人，2004；Ma和Fernández，2022；Robinson等人，2002；Sharma等人，2015；Wang等人，2024；Zhang等人，2016；Zhao等人，2015。
**数据和材料的可用性**
本研究中使用的所有数据均可向相应作者索取。
**声明**
所有方法均按照相关指南和规定执行。
文章的所有内容均遵循ARRIVE指南。
**利益冲突声明**
作者声明所提交的工作不存在任何商业或关联利益的冲突。
**资助**
本研究得到了宁夏回族自治区重点研发计划（2023BEG02012）、西藏自治区科技项目技术创新指导计划（项目编号XZ202601JX0041）和四川省自然科学基金（项目编号2023NSFSC0654）的资助。
**利益冲突声明**
本手稿的提交不存在利益冲突，所有作者均已阅读手稿并同意发表。
