摘要
前提
历史上，被子植物的种子生产一直被认为受到花粉或资源的限制。然而，种子生产不仅仅涉及花粉和种子资源，通常还涉及多朵花中的多个胚珠。因此，各种限制因素可能同时起作用。
方法
我们评估了快速繁殖的芸苔属植物（Brassica rapa）种子生产的各个组成部分，这些植物的25%、50%、75%或100%的花朵接受了人工异花授粉。
结果
果实结实率随着授粉花朵比例的增加而呈减速趋势增加。在所有处理中，只有早期授粉的花朵产生了果实，尽管在授粉不良的植物中，完全不结实的转变被延迟了。尽管柱头接收了大量的花粉，但平均只有61%的胚珠得到了受精。受精成功率在子房内存在差异，在75%花朵授粉的植物中，顶端胚珠的受精率较高；而在25%花朵授粉的植物中，基部胚珠的受精率较高。每朵花的受精率还与胚珠数量和基部果实的数量呈正相关，与花朵位置呈负相关。几乎所有受精的胚珠都发育成了种子，因此种子产量的变化主要取决于胚珠受精的影响。
结论
无论授粉处理如何，所有植物的种子生产都同时受到花粉和种子资源可用性的限制，可能还受到胚珠不育/受精能力的影响。一个简单的模型表明，如果植物产生过多的花朵，这种共同限制可能是有适应性的。授粉花朵比例和开花日的相互作用对果实结实率的影响与激素在果实间分配的调节一致。被子植物的种子生产普遍受到限制，这可能会限制现有种群的持续存在、在新地点的建立、对新环境的适应以及种子作物的产量。总体而言，种子生产受到内在限制，因为植物需要将资源分配给繁殖以外的功能，对于雌雄同体的植物来说，还需要分配给雌性和雄性性角色（Zhang和Wang，1994；Zhang，2006）。种子生产还可能受到环境条件的限制，特别是花粉媒介、配偶、种子资源的丰富程度或可用性以及食草动物的影响（Stephenson，1981；Ashman等人，2004；Strauss和Whittall，2006）。历史上，对种子生产限制的考虑主要集中在两个因素上：“个体可能受到花粉获取或可用资源的限制”（Haig和Westoby，1988，第787页；另见Ashman等人，2004；Burd，2008）。从进化的角度来看，这种观点认为，在随机环境中，自然选择倾向于在个体和繁殖季节之间平均平衡花粉和资源的限制（Haig和Westoby，1988；Burd，2008）。然而，对于个体和种群/物种来说，这些预期可能是不完整的（见Lee，1988；Holland和Chamberlain，2007）。重要的是，种子生产不仅需要柱头接收花粉和资源可用性，而且单个植物的种子生产还分布在多个花朵的多个子房中。对于被子植物来说，产生种子至少需要三个组成部分：一个可接受的、有活力的雌性配子体、由花粉管输送的一对精子细胞以及种子发育所需的资源。这些组成部分依次结合：两个精子在胚珠内使卵细胞和中央细胞受精，形成合子并开始形成胚乳（例如，Johnson等人，2019），之后胚胎和种子储存组织利用母体资源发育和生长（例如，Ingram，2010）。因此，在一个子房内，受精可能受到花粉或胚珠的限制，而发育可能受到受精或种子发育资源的限制（Harder和Routley，2006；Harder等人，2012）。总的来说，这些因素导致了单个子房种子生产的三种主要限制。根据哪个组成部分限制了受精，如果种子发育受到受精限制，则会出现花粉或胚珠的限制；而如果资源不足无法发育所有合子，则会出现种子资源的限制（Harder和Routley，2006；Harder和Aizen，2010）。从前面的描述中可以看出，花粉限制受精的发生取决于柱头接收的花粉的数量和质量（Stephenson等人，2001；Aizen和Harder，2007；Cisternas-Fuentes等人，2023；Althiab-Almasaud等人，2024）。相关的定性特征包括雄性配子体与其所在雌蕊的兼容性（de Nettancourt，2001；Takayama和Isogai，2005）以及它们生长花粉管和与其他雄性配子体竞争以获取胚珠的能力（Cruzan，1986；Stephenson等人，2001，2003；Williams和Reese，2019）。同样，胚珠限制的发生取决于每朵花的胚珠数量和受精能力（数量：Sanzol和Herrero，2001；Brookes等人，2008；Strelin和Aizen，2018）以及每个胚珠的活力（质量：Bouttier和Morgan，1992）。至少还有两个次要因素可以影响子房的种子生产（Harder和Routley，2006）。首先，胚胎质量差，特别是与近交衰退相关的胚胎质量差，即使有丰富的受精和种子资源，也会降低合子/胚胎发育的概率（Husband和Schemske，1996；Winn等人，2011；Harder等人，2012）。其次，散布前的种子捕食会减少发育中的种子数量，即使母体提供了足够的种子发育资源（Ehrlén，1992；Kolb等人，2007）。因此，至少有五个因素可以影响单个植物的种子生产（另见Lee，1988）。尽管只有一个主要或次要限制因素可以限制单胚珠子房的种子生产，但几个限制因素可能共同限制植物的年总种子生产（Casper和Niesenbaum，1993）。这种共同限制的可能性源于被子植物身体的动态、镶嵌特性（Harder等人，2019）。最明显的是，由于大多数植物的繁殖分布在多朵花/果实上，繁殖能力和限制通常在其体内变化。例如，胚珠数量通常随花朵位置系统性地变化（Diggle，2003；Austen和Weis，2014；Harder等人，2019），而花粉接收量在植物的不同花朵之间也有很大差异（例如，Herrera，2002，2004；Burd等人，2009）。因此，一些花朵的受精可能受到胚珠的限制，而其他花朵的受精可能受到花粉的限制。同样，种子发育可能同时受到种子资源和种子捕食的限制（例如，Lee和Bazzaz，1982）。多胚珠子房中不同胚珠的产量限制也可能与其距离花柱（花粉管的通道）和/或花梗（母体资源的通道）的距离有关（Lee，1988）。如果植物的花朵开花时间不同（数量和质量），后代质量和/或种子捕食在开花期间变化，那么多种限制因素的机会就会增加（见Elzinga等人，2007）。因此，多种因素可能导致植物种子生产的总体限制，而不是仅由一个因素限制生育能力。前面的例子关注的是单个花朵/果实，但植物种子生产的最终限制也取决于它们之间的相互作用。具体来说，在授粉和受精期间确定的单个果实的限制可能在种子发育期间被花序内和花序间的激素和资源动态所克服，如果早期（通常是基部的）果实的形成抑制了后期（通常是远端的）果实的形成（见Tayo和Morgan，1975；Lee，1988；Walker等人，2021）。越来越多的证据表明，资源分配是由激素调节的，而不是直接由资源短缺和竞争引起的（Stephenson，1981；Bangerth，1989，2000；Walker和Bennett，2018）。特别是，除了内源生长素在调节种子和果实发育中的作用外（Figueiredo和Köhler，2018），老果实中的生长素输出可以施加果实优势，抑制同一花序上年轻果实的发育并阻止进一步的花序发育（Walker和Bennett，2018；Ware等人，2020；Walker等人，2021）。果实的生长素输出本质上取决于其发育中的种子数量（例如，Callejas和Bangerth，1998），并且外在取决于其与血管系统中其他生长素来源的极性流动的比较（Bangerth，1989，2000；Walker和Bennett，2018：另见Prusinkiewicz等人，2009）。因此，植物初始花朵的种子生产更可能受到花粉和胚珠受精的限制，而种子资源的限制主要影响后期花朵。这种共同限制模式已被确定为影响植物内花朵间胚珠和花粉生产系统变异的一个因素（Brunet和Charlesworth，1995；Diggle，2003；Austen和Weis，2014），包括单性花、雌雄同株和雄雌同株的进化（Emms，1993；Sarkissian等人，2001；Miller和Diggle，2007）。因此，种子生产的限制不一定表明生态失败，一个或多个特定因素的限制可能是生殖适应的结果。除了可预测的生育能力限制外，随机变异可以促进资源分配模式，以适应现有的限制。在正常条件下产生比能够成熟为种子和果实的更多胚珠和花朵，可以充分利用不可预测的良好花粉输入或种子资源的可用性（Lee，1988；Burd，1995，1998；Schreiber等人，2015），并减轻不可预测的不良授粉、食花行为、低质量胚胎死亡或种子捕食的影响（Ehrlén，1991；Burd，1998；Marr和Pellmyr，2003；Porcher和Lande，2005）。由于胚珠和花朵通常比种子和果实便宜得多（见Stephenson，1981；Sutherland，1986；Ehrlén，1991；Greenway和Harder，2007；Itagaki等人，2019），“过度生产”胚珠和花朵如果其好处超过资源成本，则是有利的，尽管这会增加经历不良或平均授粉或资源可用性的个体的花粉限制相对发生率（Stephenson，1981；Burd，1995；Schreiber等人，2015）。对高于平均水平的授粉成功的额外适应反应涉及将资源从其他功能转移以支持当前的种子生产。这种选择主要适用于多年生植物，因为它需要之前储存的资源（Ida等人，2013）或以牺牲未来生存或繁殖为代价储存较少的当前资源（Obeso，2002；Dorken等人，2025）。通过缓解当前繁殖季节的资源限制，这两种反应都可以增加授粉良好的植物的胚珠限制。在这里，我们超越了花粉和资源限制的二分法，从实验和理论上评估了限制子房内、植物内不同子房间以及植物间种子生产的各种因素。实验使用了实验室培育的快速繁殖的芸苔属植物（Brassica rapa L.），我们通过完全授粉不同比例的花朵来改变每株植物的授粉强度。因此，未授粉花朵（无受精）和授粉花朵（最大，可能是胚珠限制受精）之间的受精花粉限制应该有很大差异，而在授粉花朵之间的限制较小。此外，实验条件允许种子生产受到胚珠数量和/或种子资源的限制，但花粉和后代质量可能只有有限的影响，且没有发生种子捕食。除了授粉对胚珠受精的影响外，我们还预期资源相关限制会对花序后期、远端花朵的果实结实率和受精以及果实内胚珠的发育产生更大的影响。理论分析研究了花朵数量和有限授粉对果实和种子生产资源分配的综合影响。基于实证和理论结果，我们考虑了多个因素共同限制种子生产的含义。
材料与方法
研究物种和植物培养
本研究使用了标准的快速繁殖芸苔属植物系（Wisconsin Fast Plants，威斯康星大学麦迪逊分校，美国；Williams和Hill，1986）。这些植物的开花在发芽后大约14天开始，持续7-14天。植物在复总状花序上开花，有一个大的顶端总状花序，在有利条件下，顶端总状花序的基部腋芽还会产生几个较小的总状花序。在每个总状花序中，花朵从基部到顶端依次开放。由于孢子体自交不亲和（Williams和Hill，1986），芸苔属植物必须进行异花授粉才能产生果实和种子。植物单独种植在0.57升的塑料盆中（顶部直径10厘米，底部直径7厘米，高度10厘米），每个托盘放置14个盆。每个盆含有标准的盆栽介质（Scotts Miracle-Gro盆栽混合土，Marysville，OH，美国），种植前后均未添加肥料。植物在室内（24-27°C）下使用LED生长灯（24小时/天）生长。这些灯光在5厘米处产生约840 µmol/s的PAR，在10厘米处产生790 µmol/s，在20厘米处产生610 µmol/s，在30厘米处产生420 µmol/s。每隔一个早晨从底部浇水，每个托盘倒入2升水。种子发芽后，检查幼苗的健康状况和发育问题，如叶片变色或生长受阻、花蕾少或花朵畸形。不健康的植物被排除在实验之外。实验1。果实和种子的产生
为了研究限制果实和种子产生的因素，并特别考察花粉限制（PL）对受精、果实形成和种子产生的影响，将植物随机分配到四种不同的处理组中，这些处理组在人工授粉的花朵比例上有所不同：25%（N=21）、50%（N=23）、75%（N=20）或100%（N=22）。为了控制花朵位置对花朵特征和繁殖成功的影响，每个总状花序上的花蕾被分成四组，每组内的花蕾被随机且不可重复地分配为授粉或不授粉。用于授粉的花粉来自其他随机选择的实验植物。使用细镊子从供体花朵上收集开裂的花药，并轻轻刷到受体花朵的柱头上，花粉很容易附着在柱头上。为了减少花粉与柱头之间的不兼容性，每朵受体花朵的授粉使用了来自两株供体植物的花药。人工授粉包括所有被分配为授粉的花朵，从开花的第一天开始每天进行，直到植物上的所有花朵凋谢。一旦植物停止开花，就继续对其进行常规护理，直到其衰老。对于每株植物，我们记录了腋生总状花序的数量以及哪些单个花朵产生了果实（沿总状花序从末端开始编号）。一些果实被识别为是由未故意授粉的花朵产生的。由于B. rapa是自交不亲和的，这些“意外”的果实可能是由于相邻植物之间的花朵无意接触造成的。衰老的植物被从花盆中移除，根部的所有土壤被仔细清洗干净，组织被分为营养部分（根、叶和花序下的茎）和生殖部分（花序茎和果实）。然后将每株植物的每种组织类型放入单独的纸袋中，并加入硅胶干燥几天。对于每个果实，我们计算了产生的种子数量。然而，未受精和流产的胚珠没有被计算在内，因为许多胚珠在种子提取过程中从果柄上脱落丢失了。一旦组织干燥，就从硅胶中取出，并用托盘天平将营养部分和生殖部分分别称重到最接近的毫克数。
实验2. 胚珠受精和种子发育
第二个实验评估了受精和种子发育的变化以及PL对胚珠产生的影响。在这次试验中，21株和25株B. rapa植物分别被随机分配到25%或75%的授粉处理组中，它们的花朵按照上述方法用从非实验植物中随机收集的花粉进行授粉。为了便于计数胚珠，当果实生长减缓时收集了绿色果实。在解剖显微镜下轻轻打开收集到的果实，并记录了胚珠的数量及其状态（未受精、受精但流产或受精并发育）（参见Guth和Weller, 1986; Pechan, 1988; Rigney, 1995; Liu等人, 2025）。被识别为未受精的胚珠大小均匀，明显小于被认为已受精的胚珠。在已受精的胚珠中，那些被识别为发育中的种子是膨胀的、绿色的和充满水分的，而被识别为流产的胚珠则较小、呈黄色或棕色且萎缩。对于来自顶端总状花序的果实，我们还记录了每个胚珠的位置，从花梗开始计数。
统计分析
统计分析使用了广义线性（混合）模型（GLMMs；Stroup, 2013），通过R 4.4.1中的glmmTMB包（版本1.1.10：Brooks等人，2017）在RStudio 2024.12.0界面（RStudio Team, 2020）中进行。所有分析都考虑了二项分布和对数链接函数，除了分析处理对植物营养质量的影响外，后者使用了ln-正态分布和恒等链接函数。对花序内果实形成、胚珠数量和受精以及种子发育的变异分析还考虑了随着花序内花朵间距离增加而呈指数衰减的相关响应。同样，对胚珠内受精胚珠比例和发育中的胚胎的变异分析也考虑了胚珠间距离增加而呈指数衰减。通过两种不同的分析方法研究了胚珠位置对胚珠命运的影响，这两种方法分别从柱头（顶端）或花梗（基部）端开始计数胚珠的位置。我们仅报告基于赤池信息量准则（AIC）的最佳拟合GLMM的结果。植物水平的营养质量和果实形成分析考虑了所有植物的观测数据。花水平的果实形成和胚珠命运分析排除了总状花序顶端的一些花朵或在植物开花期间晚开放的花朵，因为这些空间和时间位置在植物间的不完全表示使得相关GLMM的拟合变得困难。分析中包含的独立变量取决于因变量和观察单位（植物、花朵/果实或胚珠）。在果实形成的分析中，营养质量用ln（营养质量）表示。授粉强度用授粉处理表示（每株植物的果实产量；胚珠受精和种子流产），或者授粉花朵的对数比例（每朵花的果实产量）。对单个花朵的分析还包括它们所在的总状花序及其在总状花序中的位置（相对于基部花朵；胚珠受精和种子流产）或植物的开花期（相对于植物首次开花日的开花日；每朵花的果实产量）。对于每朵花的果实产量分析，开花日具有曲线影响，我们用自由度为2的自然样条函数来表示。对于胚珠在子房内的位置对受精概率的影响也采用了类似的方法。授粉处理和总状花序作为分类变量，而所有其他独立变量都是定量变量。对于给定的分析，首先使用包含所有感兴趣的独立变量及其交互作用的模型开始。为了限制独立效应之间的共线性，我们使用基于AIC的向后消除方法排除了统计上不显著的交互作用（但不包括主效应）。大多数分析涉及多个独立变量，这使得具体展示每个变量的效应变得复杂。因此，我们展示了独立变量的边际效应，这些效应表示在其他独立变量效应保持不变的情况下因变量的变化。对于分类独立变量，使用emmeans包的emmeans函数（版本1.10.6：参见Milliken和Johnson, 1984; Lenth, 2016）估计边际均值。对于连续协变量，基于总体线性模型计算边际回归关系，不感兴趣的协变量用它们的均值表示。在这种情况下，依赖变量的观测值的边际值是通过其边际回归值加上总体拟合GLMM的残差来计算的。对于两个连续变量之间的交互作用，我们展示了边际回归表面，但没有包括依赖变量的相关残差变化，因为这样做会掩盖所描绘的三维回归关系。
结果
果实形成
在实验1中，有意授粉花朵的比例差异改变了限制整个植物及其花朵果实和种子产生的因素。由于B. rapa植物的营养生长在开花开始时（即授粉之前）基本停止，因此营养质量在授粉处理组之间没有统计学上的差异（表1）。因此，任何处理组之间的繁殖成功差异不可能源于植物大小的差异。相比之下，产生有意授粉果实的花朵比例（果实形成）随着授粉处理的增加而增加（表1，图1A），表明至少在25%和50%的授粉后存在花粉限制。对于所有处理组，果实形成都少于有意授粉花朵的比例，且这种差异随着授粉花朵比例的增加而增加，因为果实形成开始独立于授粉而变化（75%和100%的处理组：图1A，比较橙色符号和灰色虚线）。这一变化表明限制整体结果成功的因素有所不同。除了授粉效应外，不同总状花序之间的果实形成也有所不同（表1，图1B），顶端总状花序上的果实形成最多，而在腋生总状花序上逐渐减少。果实形成还随着ln（营养质量）的增加而减少（表1；偏回归系数，b±SE = –0.321±0.148：图1C）。这种效应是因为果实形成的分子（果实数量）随营养质量的增加而增加的幅度小于分母（花朵数量：见附录S1：图S1）。
表1. 广义线性模型评估实验1期间植物间营养质量变化和有意及总果实形成比例的结果。
影响
营养质量
有意果实
总果实
授粉处理
= 3.74
= 218.22***
= 107.11**
总状花序
= 89.48***
= 109.11***
ln（营养质量）
= 4.46*
= 6.33*
* P<0.05
** P<0.01
*** P<0.001
图1. 在图查看器中打开
实验1中每株植物（A）、每个总状花序（B）和每朵花（D）的果实形成比例的影响（N=86），包括（A）授粉处理（有意授粉花朵的比例），（B）总状花序，（C）植物营养质量，以及（D）实际授粉花朵的比例（有意和无意）和花朵在植物开花序列中的开放日。在A和B面板中，符号代表边际均值（±95% CI），不同字母对应的均值在统计上有所不同（Tukey检验）。在A面板中，虚线表示如果所有授粉花朵都结果实的情况；符号和字母的颜色区分了有意授粉花朵产生的果实和所有果实的结果。B-D面板中的结果基于对所有果实的分析。在C面板中，点代表个别植物的边际效应，其中指出了授粉处理，曲线描绘了拟合的回归关系。在D面板中，网格表示拟合的边际回归表面，符号表示有观测数据的部分，但没有表示表面以上或以下的变化。D面板的分析基于植物开花前11天内顶端总状花序上的14朵花和三个基部腋生总状花序。25%、50%和75%处理组中的一些植物产生了一些意外果实，因此总果实产量（总果实占总花朵的比例）略高于这些处理组的有意果实产量（图1A，灰色符号）。对于有意果实，总果实产量随着有意授粉强度的增加而增加，从顶端总状花序到最远端的腋生总状花序逐渐减少，并且随着植物营养质量的增加而减少（表1）。然而，与有意授粉花朵不同，所有花朵的果实形成在50%和75%处理组之间以及75%和100%处理组之间在统计上没有差异（图1A，橙色符号）。鉴于授粉良好的植物果实形成受到更多限制以及产生了一些意外果实，授粉花朵的比例并不是衡量发育中果实总资源需求的一致指标。为了更好地表示这些需求，在后续分析中，我们使用了植物中结果实的花朵的总体比例作为相关的独立变量，而不是授粉处理。为了研究植物内部果实形成变化的影响，我们进行了两项分析：（1）包括顶端和基部三个腋生花序上的14朵花的四总状花序分析；（2）仅包括顶端总状花序及其基部38朵花的分析（表2）。我们仅详细介绍了四总状花序的分析结果，因为它们概括了顶端总状花序分析中发现的模式。对果实形成影响最显著的是植物内部授粉花朵之间的突然时间变化及其对植物授粉强度的依赖性（表2，开花日×授粉花朵比例的交互作用：图1D）。实验1中的植物平均开花时间为（±SD）11.6±4.9天（最长28天），但只有在植物开花期间早期开放的花朵才会结果实（见图1D）。果实形成期的平均持续时间随着植物授粉强度的不同而负相关，授粉不良的植物为9天，而完全授粉的植物仅为5天（图1D）。这种突然的转变表明，无论植物的授粉情况如何，后期花朵的果实发育都受到强烈限制，但授粉不良延迟了这一转变。
表2.在实验1中，对在植物开花期前11天内开放的有意授粉花朵的果实形成比例的植株内变异进行了广义线性混合模型分析。对于四个最老的穗状花序的分析考虑了顶端和三个基部腋生花序上的前14朵花，而顶端穗状花序的分析则涉及了前38朵花。
**结果：**
| 自变量 | 回归系数 | t值 | P值 |
|------------------|-------------|-----------|-----------|
| 四个最老的穗状花序 | 10.53* | 11.3 | <0.001 |
| 顶端穗状花序 | 5.61* | 10.5 | <0.001 |
| 对数（授粉花朵比例） | 4.40* | 9.6 | <0.001 |
| ln（营养质量） | 6.03* | 11.3 | <0.001 |
| 开花日期 | 8.87** | 13.5 | <0.001 |
| 穗状花序 × 对数（授粉花朵比例） | 5.71 | 10.2 | <0.001 |
| 穗状花序 × ln（营养质量） | 6.60 | 10.7 | <0.001 |
| 穗状花序 × 开花日期 | 14.95* | 13.1 | <0.001 |
| 开花日期 × 对数（授粉花朵比例） | 12.67** | 13.7 | <0.001 |
| 开花日期 × ln（营养质量） | 6.38* | 10.4 | <0.001 |
| 穗状花序 × 开花日期 × 对数（授粉花朵比例） | 9.00 | 12.4 | <0.001 |
* P < 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001。
**注释：**
- 使用自然样条函数来表示开花日期的效应（在第4天有一个节点）。
- 除了时间模式外，每朵花的果实形成比例在植物的不同穗状花序之间也存在差异，这主要是因为它们在不同的时间开始开花[表2，穗状花序、穗状花序 × 开花日期和穗状花序 × 开花日期 × ln（营养质量）]；详见附录S2：图S2。
- 顶端穗状花序上的花朵首先开放（即开花日期为1），至少1天后是第一和第二腋生穗状花序，4天后是第三腋生穗状花序（除了有一朵花在开花第三天开放）。
- 第一和第二腋生穗状花序上的果实形成涉及在它们开放的前5天内开放的花朵，这与植物的营养大小关系不大。
- 对于第三腋生穗状花序，只有最大的植物保持了这种果实形成持续时间，而在最小的植物上，只有在前2天内开放的花朵会结果实（附录S1：图S2）。
**实验2：胚珠数量**
在实验2中，胚珠数量在穗状花序之间以及穗状花序内花朵的位置上有所不同，但在两种授粉处理之间没有差异（表3；附录S3：图S3）。平均而言，顶端穗状花序上的花朵产生的胚珠数量比腋生穗状花序上的多一个（附录S3：图S3A）。总体而言，穗状花序基部一半的花朵的胚珠数量变化不大，但在更远端的花朵中数量减少，因此最远端的花朵产生的胚珠数量比基部花朵少约16%（附录S3：图S3B）。
**广义线性混合模型结果：**
**实验2：每朵花的胚珠数量以及受精胚珠的比例、发育成种子的受精胚珠数量和所有成为种子的胚珠数量（果实形成）**
- **花朵水平分析：顶端和第一、第二腋生穗状花序**
- 授粉处理 | = 3.03 | = 0.10 | = 2.50 |
- 穗状花序 | = 16.35** | = 14.23*** | = 7.03* |
- 相对花朵位置 | = 67.32*** | = 24.30*** | = 6.30* |
- 更基部果实的数量 | = 25.02*** | = 1.74 | = 23.87*** |
- 每朵花的胚珠数量 | = 9.31** | = 6.83** | = 10.20** |
- **仅顶端穗状花序的分析**
- 授粉处理 | = 3.53 | = 0.21 | = 2.29 |
- 花朵位置 | = 9.01* | = 7.77* | = 9.22** |
- 每朵花的胚珠数量 | = 11.678*** | = 17.21*** | = 15.72*** |
- 胚珠位置 | = 181.06*** | = 22.52*** | = 174.83*** |
* P < 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001。
**注释：**
- 这些分析考虑了穗状花序内的前17朵花。
- 用自然样条函数表示，其中有一个节点代表绝对花朵位置（发育）或相对位置（胚珠数量、受精、果实形成）从穗状花序基部开始。
- 这些分析考虑了穗状花序内的前34朵花，并且没有包括更基部果实的数量，因为它在统计上不影响胚珠的命运（所有情况下P > 0.05）。
- 对于受精和果实形成，胚珠位置是从子房的顶端开始计算的；对于果实形成，是从基部开始计算的。用自然样条函数表示，受精有2个节点，果实形成有3个节点。
**受精情况：**
尽管进行了有意的人工授粉，并且使用了来自多个供体的丰富花粉，但在实验2中，每朵花的受精胚珠比例变化很大（图2A），总体平均值为0.61（置信区间=0.567–0.658）。在从顶端和两个基部腋生穗状花序中采样的719朵授粉花朵中，超过95%的胚珠受精，但在两种授粉处理之间没有统计学差异（P = 2.49，P > 0.1）。
**图2解释：**
- （A）实验2中每朵花的受精胚珠比例的整体变异以及对其边际平均受精比例的影响，包括（B）花朵的穗状花序位置、（C）花朵相对于穗状花序基部的位置、（D）焦点花朵下方的果实数量、（E）子房内的胚珠数量，以及（F）授粉处理和子房内的胚珠位置。在面板A中，受精比例<0.95被认为是花粉限制，而较高的比例被认为是胚珠限制（0.95到<1和1的单独条形图）。
- 在面板B中，平均值伴随着95%的置信区间：不同字母对应的平均值在统计上有所不同（Tukey检验）。
- 在面板C–F中，平均值伴随着标准误差，曲线展示了拟合的边际回归关系。
- 在面板F中，直方图显示了每个位置采样的胚珠数量：25%授粉处理的条形图在前面，部分遮挡了75%处理的条形图。注意，在面板F中，胚珠位置是从子房的顶端（柱头）开始计算的。
**分析结果：**
- 在有意授粉的花朵中，受精胚珠比例的变异揭示了几个影响因素（表3，花朵水平分析）。两种授粉处理之间的受精比例在统计上没有差异。
- 相反，它在不同穗状花序之间有所不同，顶端穗状花序上的受精胚珠比例低于第一和第二腋生穗状花序（图2B）。
- 在所有三个穗状花序中，从基部到远端花朵，受精胚珠的比例下降了41%（b ± SE = –1.554 ± 0.315；图2C）。
- 此外，授粉花朵中受精胚珠的比例随着穗状花序中更基部发育果实的数量增加而增加（b ± SE = 0.145 ± 0.029；图2D）以及花朵内的胚珠数量增加而增加（b ± SE = 0.047 ± 0.015；图2E）。
- 每朵花的受精胚珠比例在两种授粉处理之间没有统计学差异，这表明在单个子房内的授粉效应不同，如顶端穗状花序上的果实所示（表3，胚珠水平分析）。
- 总体而言，受精胚珠的平均比例随着它们与柱头的距离而变化（即花粉管的进入位置：图2F）。具体来说，这个比例从位置1到位置8（75%授粉）或位置9（25%授粉）增加，然后随着位置的增加而减少（自然样条函数，在位置8和16处有节点）。
- 这种模式在两种授粉处理之间有所不同（处理 × 位置），因为在接受75%授粉的植物上，子房的峰值更高，远端的下降更陡峭（图2F）。
- 实验2中，顶端穗状花序内花朵的平均受精成功率也随着花朵的相对位置和胚珠数量而变化。
- 与花朵水平分析中观察到的从基部到远端花朵的受精成功率持续下降不同（图2C），胚珠水平分析检测到中间位置的花朵受精率略高，但在两端的成功率较低（自然样条函数；附录S3：图S4A）。
**种子发育和果实形成：**
- 实验2中几乎所有受精的胚珠都发育成了种子（平均比例=0.963，置信区间=0.954–0.969）。
- 对花朵水平的影响分析没有检测到两种处理之间的统计学差异（表3）。
- 然而，不同穗状花序之间的发育比例有所不同，顶端和基部腋生穗状花序上的比例略高于第二腋生穗状花序（图3A）。
- 在穗状花序内，发育成种子的受精胚珠的比例在更远端的位置有所下降（表3；b ± SE = –0.981 ± 0.391：图3B）。
- 此外，在胚珠数量较多的子房中，有更多受精胚珠发育成了种子（表3；b ± SE = 0.047 ± 0.035：图3C）。
**实验2期间受精胚珠发育成种子的边际平均比例的影响：**
- 包括（A）花朵的穗状花序位置和（B）其相对于穗状花序基部的位置、（C）每朵花的总胚珠数量，以及（D）子房内的胚珠位置。在面板A中，平均值伴随着95%的置信区间：不同字母对应的平均值在统计上有所不同（Tukey检验）。
- 在面板B–D中，平均值伴随着标准误差，曲线展示了拟合的边际回归关系。
- 在面板D中，胚珠位置是从子房的基部（花梗端）开始计算的，直方图显示了每个位置采样的胚珠数量。
- 对顶端穗状花序内受精胚珠的发育分析发现，胚珠位置和数量以及花朵位置对受精胚珠的发育有影响，但授粉处理没有影响（表3）。
- 最适合这种分析的模型是从子房的基部开始计算胚珠位置（即子房的资源供应）。
- 接近花梗的受精胚珠的发育可能性略高于靠近柱头的胚珠（b ± SE = –0.054 ± 0.011；图3D）。
- 此外，顶端穗状花序内受精胚珠发育成种子的比例随着穗状花序中更基部发育果实的数量增加而减少（b ± SE = 0.145 ± 0.029；图2D）以及花朵内的胚珠数量增加而增加（b ± SE = 0.047 ± 0.015；图2E）。
**种子形成：**
- 所有成为种子的胚珠的比例（果实形成）等于受精胚珠的比例与发育成种子的受精胚珠的比例的乘积。因此，比较这三个过程的统计效应应该能揭示受精和发育对果实形成的相对影响（表3，图2，3；附录S3：图S4，图S5，S6）。
- 根据花朵水平分析，受精、受精胚珠的发育和果实形成在穗状花序内从基部到远端花朵的方向上都有所不同（图2C，3B；附录S4：图S5B），并且与每朵花的胚珠数量呈正相关（图2，3；附录S4：图S5D）。
- 相比之下，种子发育在穗状花序之间的变化模式与受精和果实形成不同（图2B，3A；附录S4：图S5A），并且在焦点花朵下方的果实数量上没有统计学差异（表3）。
- 此外，在顶端穗状花序的子房内，受精和果实形成与胚珠位置的关系呈峰值，这种关系在两种授粉处理之间有所不同（图2F；附录S4：图S6A），而受精胚珠的相对发育随着胚珠位置的增加而单调下降（图3D）。
**相互作用限制的模型：**
上述结果表明，授粉强度共同影响了胚珠的受精（图2F）和果实发育（图1D）。我们现在通过一个简单的模型来理论上探讨这种联合限制是如何产生的，该模型考虑了每朵花都有可育胚珠的植物。在这些花朵产生后，D资源可用于果实/种子的发育。假设p比例的花朵被授粉（授粉比例），并且每朵授粉的花朵接收到的花粉足以使其z比例的胚珠受精（如果授粉的话）。如果启动单个果实的资源成本是cf，每个种子的额外成本是cs，那么单个果实的发育需要总共cf + zocs资源。因此，发育资源D提供了植物最多生产Fc个果实的容量：
(1a) 和 Sc个种子：
根据方程1a，这种发育能力随着资源可用性（D）的增加而增加，但随着每朵授粉花朵的受精比例（zo）的增加而减少（图4A，左侧纵坐标，实线曲线）。负面效应是因为高受精成功率增加了每个果实的种子数量，减少了消耗可用发育资源所需的果实数量。因此，每朵花的较高受精率提高了植物的资源利用效率。具体来说，当所有授粉花朵中的胚珠都受精并且每个果实的种子生产受到胚珠数量的限制时（即z = 1），发育资源被最有效地分配，最大果实数量被最小化（图4A，实线曲线），总种子产量也被最大化（图4B，实线曲线）。图4 在图形查看器或PowerPoint中打开
每朵花受精卵子的比例（z）对以下方面的理论影响：(A) 每株植物的果实数量（F，左侧纵轴）和最大可授精花朵数量（f+，右侧纵轴）；(B) 总种子数量；以及 (C) 与花朵生产和发育能力限制相关的限制因素总结。以下解释适用于A和B部分。当z=1时，受精受卵子数量限制；而当z<1时，受精受花粉数量限制。实线曲线表示在有足够可授精花朵（f≥Fc）和可用发育资源（D）的情况下，植物产生果实（Fc）和种子（Sc）的最大能力。虚线表示在某些授粉强度下，花朵数量f小于结果能力的情形。灰色虚线表示一种特殊情况，即当所有花朵的受精都受卵子数量限制时，植物产生的总卵子数量恰好足以最大化种子产量。彩色虚线表示总卵子产量超过这个阈值（F=f1）或低于该阈值（F=f2，即f1>f2）的情况。实际产生的果实（和种子）数量取决于授粉花朵的数量（p·f）和如果消耗所有发育资源所能发育的果实数量（Fc），从而形成了两种相互限制的情况：
- **花朵限制**：如果植物能够产生更多的果实和种子，但它产生的花朵数量较少（图4A、B中的虚线；图4C）。在这种情况下，由于花粉管不足和卵子数量太少，种子产量受到严格限制（图4B中的虚线）。因此，更多的花朵将允许接收更多的花粉，尽管每朵花的授粉和受精比例相同，这将增加可用于受精的总卵子数量（即，在授粉和受精的“彩票”中拥有更多的“票”：另见Stephenson, 1981; Burd, 1995; Schreiber等人, 2015）。需要注意的是，花朵限制可能发生在每朵花的受精成功率较低的情况下（z），即min(Fc) < pf < Fc（例如，图4A中的左侧纵轴虚线f1），或者无论每朵花的受精情况如何，如果授粉的花朵数量太少（即p较低），以至于pf ≤ min(Fc）（例如，图4A中的虚线f2）。相比之下，**发育能力限制**影响的是那些授粉花朵数量至少与在可用资源下能够发育的果实数量相等的植物。在这种情况下，发育资源普遍限制了种子产量。然而，限制的程度取决于资源利用效率，这又取决于受精卵子在花朵之间的分布。具体来说，即使所有发育资源都被消耗，如果每朵花的授粉不完全（z<1），或者花朵中有更多的花粉管（z=1：图4B中的实线曲线：也见图4C），那么可以用更少的花朵更高效地生产更多的种子。由于资源分配效率低下，如果植物产生的花朵数量超过了能够有效发育成果实的数量，就会发生发育能力限制。具体来说，为了使所有可用资源都被消耗，所需的额外“可授精”花朵的最小数量是
其中等号后的比例表示由可授精花朵贡献的植物结果能力（图4A中的右侧纵轴实线曲线）。请注意，这一最低要求与授粉花朵的比例（p）和每朵花的授粉率（z）都呈负相关。总之，该模型揭示了种子产量的普遍性共同限制（图4C）。花朵限制涉及植物总授粉量和卵子产量的限制。发育能力限制涉及发育资源和每朵花授粉量或卵子数量的限制。
**种子产量的多重限制**
先前的实验和理论结果表明，多个因素可以共同限制单个植物的种子产量。在我们的实验中，大多数胚珠都发育成了种子（图3），并且排除了种子捕食者。因此，种子产量可能仅受限于花粉管或卵子数量不足以及种子发育所需资源不足这两个主要限制因素。对于这些条件，模型识别出了两种不同的限制类型，通常分别归因于花朵数量限制或植物结果和种子发育的资源能力限制（图4C）。我们通过改变植物上授粉花朵的比例（即模型中的参数p）以及授粉花朵中卵子受精不完全（即z<1）来操纵实验条件，发现了这两种类型的证据。25%和50%的处理似乎主要受到花朵数量的限制，这导致参与受精的花粉管和卵子数量太少，无法生成足够的胚珠来消耗所有可用的种子资源。有两个特征支持这一结论：50%甚至25%的花朵被授粉的植物果实产量很低（图1A），这说明了花粉限制的花粉比例成分。尽管柱头上施加了大量的花粉（图2A），但由于授粉花朵的平均受精失败率为35%（即z≈0.65），这种限制更加严重。这种受精限制的原因尚不清楚，但花粉管和可接受、可存活的卵子都可能不足（见下文关于“植物内部卵子受精变异”的讨论）。相比之下，75%和100%的处理结果似乎更符合结果和种子发育资源有限的情况。在这种情况下，种子产量受到发育资源的限制，但由于每个子房中的卵子受精数量有限，这些资源在果实之间的分配效率低下。果实产量在75%和100%的处理之间没有差异（图1A），表明整体上花粉限制较小。然而，由于每朵花授粉的卵子受精数量有限（图2A），发育资源的分配效率仍然低下。此外，在75%和100%授粉处理后，早期花朵结果与后期花朵完全不结果之间存在着明显的资源限制（图1D）。这些结果共同表明，受精和发育资源的限制都限制了总种子产量（另见Casper和Niesenbaum, 1993）。然而，这些限制的贡献随着授粉花朵比例的增加而变化。在自然条件下，以及对于允许更自由交配的自交亲和植物，种子产量可能受到上述三种主要限制中的两种或更多种类的限制，还可能受到其他次要限制的影响（如可变授粉和资源可用性、种子捕食者的存在）。因此，开花植物的种子产量通常可能受到上述三种主要限制中的两种或更多种类的限制。
在考虑共同限制的机制及其影响之前，我们先讨论一下实验2中产生果实的花朵中卵子受精的一些令人困惑的现象。尽管授粉花朵接受了大量的花粉，且某些花朵中超过90%的卵子受精了，但结果花朵之间的受精成功率差异很大（图2A），平均只有61%。这种现象在多胚珠花朵的物种中很常见（见Harder和Routley, 2006）。尽管接受了大量花粉，但受精不完全可能由多种方法学和生物学原因造成，包括人工授粉过程中柱头的损伤、使用不兼容或不可存活的花粉进行授粉、花粉多样性低、在柱头上立即施加大量花粉后花粉管之间的激烈竞争，以及授粉与柱头和/或卵子可接受性之间的时间不匹配（见Young和Young, 1992; Le Deunff等人, 1993; Sanzol和Herrero, 2001; Harder等人, 2016）。特别值得注意的是，Bouttier和Morgan（1992）观察到Brassica napus花朵中有35%的卵子是不育的，因为它们缺乏胚囊（大配子体）。虽然这些原因中的每一个都可能影响了实验2中某些花朵的受精，但它们中的大多数应该是随机发生的，因此不太可能是导致植物内部花朵之间以及子房内卵子之间受精成功率系统性变化的原因（图2B–E；附录S3：图S3A,B）。这些模式似乎更符合受体花朵之间和内部雌蕊/卵子状态的变化。雌蕊/卵子对不完全受精的影响可能解释了子房内靠近柱头的卵子受精成功率较低的现象，与子房中央的卵子相比，以及这种模式与母本植物授粉状态的关系（图2F）。在相关的Raphanus sativus中也报告了类似的受精限制现象（Marshall和Diggle, 2001）。花粉管只在向显示可接受性的卵子生长（Zhong等人, 2025）。因此，尽管顶端卵子最容易接触到花粉管，但它们的受精成功率较低，这表明在授粉时，与中央卵子相比，较少的一部分卵子是可受精和可接受的（见Le Deunff等人, 1993; Albuquerque等人, 2002; Yu等人, 2020）。例如，Bouttier和Morgan（1992）发现Brassica napus子房的顶端区域有较少的可育卵子。然而，在授粉花朵较少的植物中（25%的处理：图2F），顶端和中央卵子的较低受精成功率表明较高的授粉成功率促进了卵子的可育性/可接受性。这种意外的效应可能反映了花序内的资源和/或激素动态（见Bouttier和Morgan, 1992）。无论其原因是什么，这一效应表明卵子的可接受性部分取决于在花序内普遍发生的过程，而不仅仅是在单个子房内。每颗卵子的受精成功率与授粉处理之间的关联在子房的基部末端发生了逆转（图2F），因此不同处理之间的总体受精成功率在统计上没有差异（表3）。如果两种处理中授粉花朵的子房内进入的花粉管数量平均相同，但这些处理中可育、可接受卵子的可用性不同，这些结果可能是由于这些原因造成的。如果许多子房中的受精受到限制（图2A），那么花粉管不必在整个子房长度内生长就能遇到可接受的卵子。因此，随着卵子与柱头距离的增加，受精卵子比例的最终下降可能反映了未受精花粉管的耗尽，因为它们受精了更靠近柱头的卵子。如果在75%的授粉处理中，更多的花粉管受精了靠近柱头的卵子，那么较少的未受精花粉管会剩余下来受精更远的卵子，导致受精成功率随卵子位置的增加而更急剧下降。如果是这种情况，那么子房内受精的限制从靠近柱头的卵子的可育性/可接受性转变为靠近花梗的卵子缺乏足够的花粉（花粉管）。尽管如此，这种解释表明了一种共同限制的方面（由卵子和花粉共同作用），至少在具有线性子房的物种中是在受精过程中发生的。在具有统计效应的穗状花序和花朵特征中，有两个特征似乎特别有影响力。无论分析中包括了哪些其他变量，每朵花的受精成功率始终与每朵花的卵子数量呈正相关（图2E；附录S3：图S3B）。如果许多花朵中有更多可育的卵子，如Bouttier和Morgan（1992）所观察到的，这种关系就可能成立。这也可能是因为具有更多卵子的雌蕊具有更大的柱头和/或柱头，使得更多的花粉管能够进入相关的子房。相比之下，对于穗状花序中“下方果实”的数量对受精成功率的正面影响则不太明显。从统计上看，这种效应非常显著，因为它从分析中排除后，广义线性模型（GLMM）的拟合度大大降低（ΔAIC=22.6），并且花朵的穗状花序及其在穗状花序中的位置对统计效应不再明显（P>0.05）。基部果实数量的正面效应可能不是因果关系，而可能是由于它与实验2中未测量的实际原因相关。重要的是，在实验1中，单个花朵的开花日期强烈影响了它们是否结果（图1D），并且与基部果实的数量呈强正相关（附录S5：图S7）。无论哪个变量最相关（可能是两者都有），这种效应以及花朵的穗状花序及其在穗状花序中的位置都提供了额外的证据，表明在花序内普遍发生的过程影响了卵子的可接受性，尽管涉及的机制尚不清楚。这些结果表明激素和/或资源状况在受精成功率中起着作用；然而，我们尚未发现先前研究中有任何关于此类影响的证据。预期中的主要限制因素之间的关联如下：
在我们的实验中，种子生产的共同限制主要发生在发育资源主要限制果实形成时，而受精受限则主要限制了单个子房的种子生产。这种对比源于受精和发育资源分配的不同尺度。具体来说，花粉管的成功和受精在植物内的雌蕊之间基本上是独立发生的，而种子发育则涉及果实之间的相互作用，这些相互作用决定了果实序或植物内部种子资源的分配（Knight等人，2006年；Wesselingh，2007年；Walker和Bennett，2018年）。由于这种对比，限制种子生产的因素取决于这两种限制尺度之间的相互作用。我们推导出的模型表明，如果植物产生的花朵数量足够多，可以缓解总胚珠受精的限制，那么种子生产可能会受到种子资源和每朵花受精的共同限制。这一条件似乎在我们的实验中得到了验证；植物产生的花朵数量超过了果实数量，尤其是在那些大部分花朵被授粉的植株上（图1A，不同授粉强度下的虚线符号差异）。这种情况在异花授粉的被子植物中很普遍——许多物种产生的花朵数量超过了它们能够成熟为果实的数量（Stephenson，1981年；Lee，1988年）。这种“过剩”花朵的产生可能是对每朵花种子生产环境限制的一种通用解决方案，因为从理论上讲，这也是一种适应随机授粉、食花行为以及低质量胚胎死亡或种子捕食的方式（Ehrlén，1991年；Burd，1998年；Marr和Pellmyr，2003年；Porcher和Lande，2005年）。因此，对于许多被子植物来说，种子生产的共同限制条件可能是满足的。我们的实验结果支持共同限制的存在，因为在所有处理中，后期花朵的果实形成都失败了，但这种转变与授粉花朵的比例有关（图1D）。在其他几个物种中也报告了由发育能力限制的相关直接证据（例如，Tayo和Morgan，1975年；Tayo，1986年；Campbell和Halama，1993年）。之前的模型仅考虑了种子生产的主要限制因素，但它也支持这样的预期：当花粉质量差阻碍受精（降低给定花粉接收量的z值）或后代质量差或种子捕食减少合子转化为种子的比例时，更复杂的共同限制可能性更大。激素和雌性生育能力
尽管授粉饱和，但总状花序中后期花朵的果实生产完全停止（图1D），这表明早期果实对后期果实有负面影响。这种抑制现象在多种物种中都有发生（Stephenson等人，1988年；Bangerth，1989年；Walker和Bennett，2018年）。最近的证据表明，这是由于正在发育的果实基于它们输出的种子生成生长素的优势而对新启动的果实产生的（Bangerth，1989年，2000年；Walker和Bennett，2018年）。为了认识这种基于种子的机制，Walker和Bennett（2018年）将这种现象称为“果实优势”。果实优势导致了四个显著后果（Bangerth，1989年，2000年；Walker和Bennett，2018年），其中三个在我们的实验中也很明显。首先，花序内的激素介导的优势模式明显反映了果实启动时间的变化，而不是果实位置的变化，这在开花初期、种子发育资源需求达到高峰之前就已经建立。与这一预期一致，包括花朵开放和首次授粉日期在内的四总状花序GLMM模型（表2）比仅考虑总状花序内花朵位置的模型更好地符合观察结果（ΔAIC = 101.9）。此外，果实形成主要涉及最早开放的花朵，而后期花朵很少结果实。这种效应在第二个和第三个腋生总状花序上更为明显，因为它们至少在基部总状花序之后2到3天才开始开花，但它们的果实形成与早期总状花序同时减少（附录S2：比较图S2A、B与C、D）。其次，具有许多和/或强壮种子的果实往往表现出更强的果实优势，并优先获得资源。相应地，具有许多胚珠的子房中有更大比例的受精胚珠发育成了种子（图3C）。第三，保留的果实倾向于获得足够的资源以完成发育，因此资源不会浪费在资源不足的果实上。最后，果实之间的激素相互作用允许根据条件的变化（例如，授粉、食草行为）动态调整果实和种子发育的资源分配，前提是存在有能力的花朵（Stephenson，1981年；Bangerth，2000年；Sadka等人，2023年）。这种适应性反应在实验1中授粉不足的植物果实启动延迟的现象中得到了体现（图1D）。这些结果与果实优势假说的吻合表明，在我们的实验中，激素在果实发育资源分配中起着关键作用。更一般地说，果实优势可能在许多被子植物的果实和种子生产及其共同限制中起着关键作用。如上所述，在多种物种中，较老的果实会抑制较年轻果实的发育。因为果实优势主要取决于花朵之间的受精时间，而不是它们在花序中的位置，所以无论花序结构如何，它都可能发生（Bangerth，1989年，2000年）。此外，许多物种产生的花朵数量超过了实现最大果实生产所需的数量（Lee，1988年；Ehrlén，1991年），从而能够灵活调整果实和种子生产以适应现有的资源可用性和授粉及传播前种子捕食的发生率。
结论
这里报告的结果支持了关于种子生产限制的几个一般性结论。最普遍的是，种子生产可能受到多种因素的共同限制。正如Haig和Westoby（1988年）所提出的，种子生产的主要限制因素（花粉管、胚珠和种子发育资源）应该在植物层面的限制之间进行二分法区分，这些限制要么是由胚珠受精不足（我们的花朵限制）引起的，要么是由资源限制（我们的发育能力限制）引起的。然而，Haig和Westoby对花粉限制和资源限制的具体区分有两个不足之处。首先，他们的花粉限制将受精涉及的花粉管和胚珠这两个要求合并为一个单一的限制因素。其次，他们对资源限制的植物层面描述没有考虑到由于受精不完全导致的发育资源使用效率低下。正如我们的模型所示，考虑种子生产的主要限制因素之间的相互作用揭示了二分法中的每个类别都涉及这两个限制因素的共同限制。当胚胎质量和传播前种子捕食的次要限制也影响雌性生育能力时，还会出现更多的共同限制机会。鉴于共同限制的可能性，证明某一特定限制因素（例如，通过补充花粉来量化花粉限制）的影响，并不排除其他因素也限制生育能力的可能性（Aizen和Harder，2007年）。实际上，即使检测到了某一特定限制因素（例如，花粉限制），其影响也可能小于其他因素的影响。因此，植物或种群的种子生产是否受到某一特定因素（例如，花粉接收）的限制，与种子生产的限制因素及其相对贡献是什么是两个不同的问题。部分原因是由于受精和发育资源的限制尺度不同。因此，果实形成和每个果实的种子数量单独提供的信息不足以完全了解不同限制对雌性生育能力的相对影响（另见Knight等人，2006年）。总的来说，这些可能性表明，要全面量化种子生产的限制因素，需要列举所有限制因素及其贡献（另见Campbell和Halama，1993年；Wesselingh，2007年；Brookes等人，2008年）。对于一个种群来说，这种量化应该考虑到不同限制因素的发生率和相对贡献在植物之间的差异。最后，这项实验的结果表明，植物的授粉成功率与其激素和发育资源动态之间的相互作用值得进行生理学研究。
作者贡献
L.D.H.和N.J.H.-M.构思了研究和实验设计，N.J.H.-M.进行了实验，L.D.H.和N.J.H.-M.进行了统计分析，L.D.H.撰写了初稿，两位作者共同修订了后续版本。
致谢
我们感谢Sandy-Lynn Steenhuisen和两位匿名审稿人对手稿提出的有益意见。这项研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会的支持（L.D.H.：RGPIN 2018-03907）。
数据可用性声明
所有支持这项研究的数据都可以在公开可用的Dryad存储库中找到（https://doi.org/10.5061/dryad.hx3ffbgtq）。
