摘要
与C. manginecans相关的Ceratocystis物种的分类界限一直存在争议，这主要是由于形态变异有限、实验室交配研究中的可育性以及不同物种概念的应用。然而，最近的研究强调了那些最近被归为C. manginecans同义词的物种之间的显著差异，包括宿主关联和生物学特征，这些都对疾病管理具有重要意义。我们研究了广泛被认为是Ceratocystis manginecans的分离株的系统发育关系、遗传多样性和种群结构，特别是那些在先前研究中被归为C. eucalypticola和C. manginecans的分离株。该研究包括来自多个宿主和地区的全面分离株数据集，涵盖了Ceratocystis溃疡病和萎蔫病的历史和近期爆发情况。通过多基因位点的系统发育分析，并结合16个SSR位点的基因分型，确定了两个遗传上不同的谱系：谱系1（先前被归为C. eucalypticola）和谱系2（先前被归为C. manginecans）。这些谱系在地理区域和宿主关联上表现出结构化的遗传分化，这与之前报道的侵袭性和感染生物学差异一致。详细的形态学比较也支持了这种分组。尽管结果揭示了目前被归为C. manginecans的分离株中存在两个谱系，但不同位点之间的不一致性和部分分离株中的混合遗传信号表明存在混合祖先和/或谱系分选不完全的现象。这表明不完全的生殖隔离导致了当前的分类模糊和混乱。研究结果支持将这两个组的分离株视为C. manginecans内的不同谱系（谱系1和谱系2），在保持保守的分类方法的同时承认它们的差异，从而有助于重要的检疫考虑和未来针对疾病管理的研究。
1 引言
Ceratocystis属包括几种具有经济重要性的植物病原体，其中最具侵袭性的物种属于拉丁美洲支系（LAC）。根据Harrington等人（2024年）的定义，Ceratocystis manginecans包括应用系统发育物种识别（GCPSR）概念（Taylor等人，2000年）时被认为是不同物种的分离株，这些分离株包括C. manginecans（ITS类型1和2）、C. eucalypticola、C. mangivora和C. mangicola。这些分离株非常重要，因为它们会引起严重的疾病，尤其是在用于人工林和水果生产的树木上（Harrington等人，2024年；Liu等人，2021年）。尽管它们在不同宿主上引起相似的疾病症状，如萎蔫、维管束染色、树皮病变和茎溃疡（Roux等人，2020年；Tarigan等人，2011年；van Wyk等人，2012年，2007年），但最近被归为C. manginecans同义词的分离株在生物学和生态学上表现出重要差异，特别是在宿主范围和感染生物学方面（Al Adawi等人，2013年；Anjum等人，2021年；Barnes等人，2003年；Chi等人，2019年；Li等人，2016年；Liu等人，2021年；Pratama等人，2021a，2021b，2024年；Razzaq等人，2020年；Roux等人，2020年；Tarigan等人，2011年；van Wyk等人，2007年）。这些差异对于疾病管理策略至关重要，包括检疫规定，强调了准确区分具有经济重要性的C. manginecans分离株的必要性。多年来，目前被归为C. manginecans的分离株的鉴定和分类一直存在问题。混淆的原因包括单个分离株中存在多种ITS类型（例如，基于ITS的C. manginecans类型1和类型2；Fourie等人，2016年；Harrington等人，2014年；Naidoo等人，2013年）、形态学差异有限、使用不同编码区域的DNA序列进行的系统发育不一致（de Beer等人，2014年；Fourie等人，2015年；Kanzi等人，2020年），以及先前定义的物种的分离株在实验室条件下具有可育性（Harrington等人，2024年）。因此，这些分离株要么被视为密切相关的物种，要么被视为单一物种复合体的成员。例如，Harrington等人（2024年）目前归为C. manginecans的几个分类单元最初被描述为不同的物种（van Wyk等人，2007年，2011年，2012年），然后基于实验室交配兼容性被认为与C. fimbriata同种（Harrington等人，2014年）。尽管存在这种交配兼容性，C. fimbriata现在被认为是一个主要感染甘薯（Ipomea batatis）的独立谱系，而不是一个包含多个相关谱系的广泛物种概念（Harrington等人，2024年）。尽管群体遗传学研究主要用于物种或谱系边界的探索，而不是主要用作物种界定工具，但它们提供了关于物种或谱系边界的见解（Choi，2016年；Hey和Pinho，2012年）。这些研究通过分析等位基因频率、遗传漂变、基因流、突变和选择来评估遗传多样性和结构。先前对Ceratocystis manginecans（以前称为C. manginecans和C. eucalypticola）的分离株进行的群体遗传学研究集中在遗传多样性、传播途径、宿主关联和这些经济重要真菌的可能起源等方面（Al Adawi等人，2014年；Ferreira等人，2013年；Fourie等人，2016年；Hlongwane，2022年；Li等人，2016年；Liu等人，2021年）。然而，关于它们分类位置的混淆阻碍了比较研究。例如，Fourie等人（2016年）提出东南亚（SEA）可能是先前被鉴定为C. manginecans的分离株的起源地。相比之下，巴西的研究揭示了显著的遗传变异，表明这种病原体（以前称为C. fimbriata）原产于巴西，并通过受感染的桉树繁殖材料在全球传播（Ferreira等人，2011年，2013年；Harrington等人，2024年；Li等人，2016年）。Liu等人（2021年）比较了来自SEA和巴西的分离株，但由于巴西分离株的代表性有限而无法完全确定谱系边界（Harrington等人，2024年；Oliveira等人，2015年）。然而，他们的研究根据宿主将分离株分为两个主要的遗传群：一个来自桉树属（以前称为C. eucalypticola），另一个来自金合欢属（称为C. manginecans）。Fernandes等人（2024年）也报告了类似的宿主关联模式，表明物种形成是由宿主关联和多次宿主扩展事件驱动的。在Tarigan等人（2011年）首次描述C. mangium上的C. manginecans之后，由Ceratocystis属引起的严重疾病爆发在SEA持续发生，特别是在金合欢属和桉树属上。这些爆发包括印度尼西亚（Hlongwane，2022年；Pratama等人，2021a，2021b，2024年；Suwandi等人，2021年）、马来西亚（Wingfield等人，2023年）和越南（Thu等人，2024年）。在南非（Hlongwane，2022年；Roux等人，2020年）和巴西（Benso等人，2024年；Ferreira等人，2011年）的桉树上也发生了疾病爆发。此外，还在中国（Liu等人，2021年）和最近的哥伦比亚（C.A. Rodas，未发表）从新砍伐的桉树表面收集到了Ceratocystis属的分离株。最近由Harrington等人（2024年）定义的C. manginecans引起的疾病爆发，以及分离株在宿主范围、地理分布和生物学上的相关差异（Fernandes等人，2024年；Liu等人，2021年）的证据，强调了探索这些差异如何在遗传聚类中反映出来的必要性。基于这一推理，我们的研究旨在准确表征和鉴定C. manginecans的分离株，包括与新疾病爆发相关的分离株。这是通过研究之前被鉴定为C. manginecans或C. eucalypticola的广泛Ceratocystis分离株数据集，并考虑它们的多基因位点系统发育、遗传多样性和种群结构来实现的。
2 材料与方法
2.1 来自新地点的真菌分离和DNA提取
本研究专门从首次经历Ceratocystis感染爆发、新地点或新宿主树木的国家收集样本（表S1）。从种植园区域内的症状树木中随机收集木材样本。选择树木以最大化受影响区域的空间覆盖范围，并尽可能在大约10米的距离内进行采集，以限制局部感染集群内的重复采样。感染的常见症状包括萎蔫和边材的棕色条纹变色。来自哥伦比亚的分离株是从新鲜收获的桉树砍伐后的树桩中收集的（表S1）。通过将约50克来自变色木材的薄片放置在两个1厘米的胡萝卜圆盘之间，并在含有0.001克/体积硫酸链霉素（SIGMA，Steinheim，德国）的ddH2O中浸泡过夜来进行分离。这些胡萝卜诱饵被放置在潮湿的培养箱中，在28°C下培养长达2周，以刺激Ceratocystis子囊盘的形成（Moller和De Vay，1968年）。或者，将木块在密封的塑料袋中培养以保持湿度并诱导孢子形成。如果存在子囊盘，则从子囊盘中取出单个孢子滴，并转移到含有2%麦芽提取物琼脂（MEA：20克/升麦芽提取物来自Biolab，20克/升琼脂来自Difco）的培养皿中，在25°C下培养10天。使用单个菌丝尖端转移在2% MEA上制备纯培养物。每棵树只选择了一个分离株，以最小化与单次感染事件重复采样相关的偏差，并最大化种群级别的地理和宿主覆盖范围。在25°C下培养10天后，用无菌手术刀从琼脂表面刮取菌丝体，并按照制造商的说明使用Zymo Quick-DNA Fungal/Bacterial Kit提取基因组DNA。DNA被标准化为30 ng/μl。选定的分离株用于系统发育分析，所有分离株都按照以下方法进行了SSR基因分型。所有分离株都保存在南非比勒陀利亚的林业和农业生物技术研究所（FABI）培养物收藏库（CMW）中。
2.2 来自其他研究的DNA和数据获取
为了将先前生成的数据与新分离株结合，从De Mar Angel（未发表）、Hlongwane（2022年）、Fourie等人（2016年）、Liu等人（2021年）和Lynn（2017年）那里获得了所有可用的ITS、MS204和rpb2序列以及微卫星等位基因数据。Liu等人（2021年）和Hlongwane（2022年）的数据仅包含10个SSR标记；因此，检索了这些研究中的DNA以生成额外的SSR数据。还包括从巴西患病桉树中获得的、之前没有分子数据的分离株的DNA。
2.3 PCR扩增、测序和系统发育分析
所有新获得的DNA样本都进行了ITS和MS204基因区域的测序，以确认物种身份。ITS单倍型历史上一直用于定义和比较Ceratocystis内的谱系（Harrington等人，2024年）；然而，C. manginecans的ITS区域包含大的、特定于谱系的插入和缺失，这可能会使比对和系统发育推断复杂化。因此，MS204在C. manginecans中提供了更大的区分能力（Fourie等人，2015年），并且在之前的群体遗传学和系统发育研究中已被证明具有高度信息性（Liu等人，2021年），因此与ITS一起使用以支持谱系分配。内部转录间隔区（ITS）rDNA区域和5.8S rRNA基因使用引物ITS1和ITS4（White等人，1990年）进行扩增。鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基β样蛋白（MS204）基因使用引物MS204F.ceratoB和MS204R.ceratoB（Fourie等人，2015年）进行扩增。两个位点的PCR反应包含2.5 μL 5× MyTaq缓冲液（Bioline，伦敦，英国）、0.25 μL MyTaq DNA聚合酶（Bioline）、1 μL DNA模板、0.5 μL每种引物（10 mM）和8.25 μL无菌去离子水，总反应混合物为13 μL。PCR循环程序为95°C 5分钟，10个循环95°C 30秒，56°C 45秒，72°C 90秒，另外30个循环95°C 30秒，56°C 45秒，72°C 90秒（每个循环在72°C下增加5秒），最后一步在72°C下持续10分钟。PCR扩增的成功通过琼脂糖凝胶电泳（AGE）进行评估。扩增子使用ExoSAP-IT PCR Product Clean-up Reagent（Thermo Fisher Scientific）进行纯化，并使用BigDye Terminator v3.1（Applied Biosystems，Forster City，加利福尼亚）进行双向测序，使用相同的引物。热循环条件包括25个循环96°C 10秒，5秒56°C，4分钟60°C。测序在比勒陀利亚大学的ABI PRISM 3100上进行。正向和反向测序读段使用CLC Bio Main Workbench 6（CLC Bio，www.clcbio.com）组装成contigs。每个contig都进行了手动检查；模糊的碱基调用被编码为‘N’，只有当正向和反向读段都支持时才接受插入和缺失。生成的共识序列被导出用于下游系统发育分析。通过对ITS和MS204序列进行核苷酸BLAST搜索 against 国家生物技术信息中心（NCBI）GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），使用‘type’仅设置，获得了分离株的初步身份。根据这些结果，所有被识别为属于C. manginecans广泛概念（Harrington等人，2024年）的序列被纳入拉丁美洲支系（LAC）外型物种的数据集中（Barnes等人，2018年；表S3）。在MEGA v7（Kumar等人，2016年）中进行比对，使用MUSCLE比对软件（Edgar 2004），并在比对过程中修剪了本研究中生成的序列，以确保不同分类单元之间的可比性。根据最大似然（ML）方法，使用raxmlGUI 2.0（Edler等人，2021年）构建了ITS和MS204基因区域的独立系统发育树。对于ITS比对，保留了富含插入和缺失的区域。通过对序列数据进行1000次自助法重复的非参数分析，为生成的ML树的分支提供了统计支持。使用Ceratocystis albifundus CMW4068作为ML树的根节点。基于新收集的分离株的ITS和MS204测序的初步结果以及所得到的单基因座系统发育树的拓扑结构，选择了一部分分离株进行额外的多基因座测序以确认其身份（表S1和S2）。选择这些分离株的原因包括：（i）代表初步分析中检测到的每个主要分支；（ii）代表每个分支中最广泛的地理覆盖范围；（iii）限制来自同一地点的多个分离株具有相同ITS和MS204谱型的情况。额外扩增的标记包括使用引物βT1a和βT1b（Glass和Donaldson，1995年）扩增的β-微管蛋白1（βT1）区域，使用引物TEF1F和TEF2R（Jacobs等人，2004年）扩增的转录延伸因子-1 alpha（tef1）基因区域，以及使用引物RPB2-5Fb和RPB2-7Rb（Fourie等人，2015年）扩增的RNA聚合酶II的第二大亚基（rpb2）。PCR和测序反应按照上述方法进行，使用特定的退火温度（Fourie等人，2015年）。额外基因区域的序列被组装并纳入LAC Ceratocystis分类群的相应基因座特异性参考数据库中，包括模式/参考分离株（表S3），并使用上述相同的协议构建系统发育树。MS204、βT1、tef1和rpb2区域的四个独立数据集使用FASconCAT-G（Kück和Longo，2014年）进行了合并。合并后的数据集在RAxML中作为单一的、未分割的对齐序列，在GTR+Γ（GTRGAMMA）替换模型下进行分析，使用上述相同的参数。使用Ceratocystis albifundus分离株CMW4068作为ML树的根节点。还对ITS和MS204系统发育树中识别的每个主要分支的几个代表性分离株进行了MAT1-1-2（MAT1）和MAT1-2-1（MAT2）区域的测序。这些基因座被扩增，以筛查Harrington等人（2024年）描述的五个新描述的LAC物种，因为这些物种的序列数据在本研究中不可用。MAT1和MAT2区域使用引物CFMAT1-F和CFMAT1-R以及X9978R1R和CFM2-1F进行扩增和测序，遵循Harrington等人（2014年）描述的PCR和测序循环反应。所得序列被纳入LAC模式物种的数据集中（Harrington等人，2024年；表S3），并使用上述相同的协议构建单独的系统发育树。使用Ceratocystis albifundus分离株CMW2475（C1060）作为ML树的根节点。
2.4 微卫星标记基因分型
使用了十六个先前已被证明对Ceratocystis具有信息量的微卫星标记（Barnes等人，2001年；Fourie等人，2016年；Steimel等人，2004年）对所有分离株进行基因分型（表S1）。PCR混合物和循环程序遵循已发表的协议（Barnes等人，2001年；Fourie等人，2016年；Steimel等人，2004年）。通过AGE验证了扩增的成功。扩增产物在GeneScan（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific，美国卡尔斯巴德）上运行，使用Fourie等人（2016年）描述的面板。每个面板的扩增产物与无菌水以1/200的稀释比例混合，然后从混合液中取出1μL与0.2μL Liz500(-250)大小标准品（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific）和10μL甲酰胺混合，在比勒陀利亚大学（Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）的ABI PRISM 3500xl自动测序仪上运行。片段大小使用GeneMapper v. 6软件（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific）进行评分。通过结合16个基因座的等位基因生成多基因座基因型（MLGs）。之前研究中缺失的SSR数据中的标记（Hlongwane 2022年；Liu等人，2021年）按照上述方法扩增和评分，并纳入更大的数据集中。对于本研究中调查的16个基因座，选择了几个代表性等位基因进行Sanger测序，以确认GeneScan获得的等位基因大小。这些等位基因使用Barnes等人（2001年）、Fourie等人（2016年）和Steimel等人（2004年）描述的协议，使用未标记的微卫星引物进行扩增和测序。序列被组装成contigs，并使用CLC Bio Main Workbench v. 6（CLC Bio，www.clcbio.com）进行手动检查。
2.5 种群遗传分析
2.5.1 遗传多样性统计
为了计算各种多样性统计指标，将所有分离株的数据（新获得的和之前研究中的）根据其来源国家分组，而不考虑它们之前被鉴定为C. manginecans还是C. eucalypticola。这种方法允许研究任何遗传聚类是否与通过多基因系统发育分析确定的C. manginecans谱系一致。还为这些谱系中识别的亚群计算了额外的多样性统计指标。分析使用了R包poppr（Kamvar等人，2014年）在R v. 4.0.0（R Core Team 2020）中运行，在RStudio（RStudio Team 2020）上进行，使用未校正克隆的数据集。统计指标包括总MLGs、预期MLGs（eMLG；Hurlbert 1971）、遗传多样性（Hexp：Nei 1978）、Shannon-Wiener指数（H：Shannon 2001）、Stoddart和Taylor指数（G：Stoddart和Taylor 1988）、Simpson指数（λ：Simpson 1949）和基因型均匀度（E5：Grünwald等人，2003）。
2.5.2 种群结构
使用STRUCTURE 2.3.4（Falush等人，2003）中的贝叶斯聚类算法，采用具有独立等位基因频率的混合模型（Pritchard等人，2000），将个体分配到簇（K）并推断种群结构。使用R中的clonecorrect()函数按国家应用克隆校正，以便每个克隆基因型在STRUCTURE分析中只表示一次。这样做是为了减少由克隆繁殖产生的相同多基因座基因型的过度代表。首先进行了STRUCTURE分析，测试了从1到20的K值，每个K值进行20次独立运行。每次运行包括10,000次马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）迭代，然后是100,000次MCMC迭代。使用StructureSelector（Li和Liu 2018）根据Evanno ΔK方法和LnP(K)值（Evanno等人，2005）确定最佳簇数K=2（ΔK方法），在K=5处有一个次要峰值（LnP(K)）。确定最佳K值后，进行了最终的STRUCTURE分析，测试K=1–10，每个K值进行20次独立运行，包括100,000次迭代和1,000,000次MCMC迭代。结果使用上述相同的参数使用StructureSelector进行总结，并使用CLUMPAK（Kopelman等人，2015）进行可视化。由于STRUCTURE主要检测大型数据集中的主要遗传结构（Evanno等人，2005），因此还对初始运行中识别的每个主要簇对应的数据集进行了额外的层次结构STRUCTURE分析，以评估更细的亚结构。根据多基因最大似然系统发育树中识别的主要谱系定义了子集（表S2）。对于这些谱系内的分析，保留了完整的未校正克隆数据集。种群遗传结构还使用R v. 4.0.0（R Core Team 2020）中的RStudio（RStudio Team 2020）和discriminant analysis of principal components（DAPC；Jombart等人，2010）进行了可视化。DAPC使用adegenet包（Jombart和Ahmed 2011）在未校正克隆的数据上进行。通过贝叶斯信息准则（BIC）选择最佳簇数，并使用xvalDapc函数确定分析中保留的主成分数量（PCA）。还对具有混合血统和/或不完全谱系分选的分离株进行了DAPC分析，以评估杂交区域。
2.6 最小生成网络分析
使用Edwards（1971）的遗传距离和R包poppr（Kamvar等人，2014）及ape（Paradis等人，2004）通过最小生成网络（MSN）可视化了个体之间的关系。选择Edwards遗传距离进行此分析，因为它能有效捕捉分离株之间的遗传变异，适用于解决本研究中分析的广泛数据集的物种边界和种群结构。还为具有混合血统的分离株的数据集生成了额外的MSN，以及一个仅包含来自不同地区的Eucalyptus分离株的数据库，以评估潜在的宿主采样偏差。
2.7 成对种群分化和基因流计算
进行了分子方差分析（AMOVA：Excoffier等人，1992），以确定种群内部和之间的遗传变异是否有所不同。AMOVA在R v. 4.0.0中运行，在RStudio（RStudio Team 2020）中使用poppr（Kamvar等人，2014）包和poppr.amova函数进行，使用未校正克隆的数据集。使用1000次置换进行显著性测试，当零假设（无遗传分化）在p≤0.001时被拒绝。还对具有混合血统的分离株进行了AMOVA分析。使用poppr（Kamvar等人，2014）中的pairwise_Gst_Hedrick函数计算成对种群分化（ϕPT）和Hedrick的标准Gst（Hedrick 2005）。基因流（Nm）根据ϕPT（Slatkin和Barton 1989）计算。分析针对按国家定义的种群和两个ML树谱系进行。Gst值接近1表示高分化且基因流低，而接近0的值表示低分化且基因流高。使用R v4.0.0中的perm_test函数进行1000次置换，应用0.05和0.01的显著性阈值来测试观察到的分化值的显著性。
2.8 形态学比较
选择了来自南非KwaZulu-Natal地区Eucalyptus种植园的三个Ceratocystis分离株（CMW56740、CMW58001、CMW57998）和来自印度尼西亚Riau地区受感染Eucalyptus树木的三个分离株（CMW60227、CMW60230、CMW60225）进行形态学比较。这些分离株代表了从遗传分析中出现的两个主要簇。南非的分离株与根部疾病相关，而印度尼西亚的分离株则与地上感染相关，且根部没有疾病。每个系统发育组每个分离株有三个重复样本（总共18个），随机选取并进行盲法评估。重复样本在含有2% MEA的60毫米Petri培养皿中，在黑暗条件下25°C培养7天。第七天，从每个重复培养皿的六个相等区域收集10-15个子囊盘及其相邻的分生孢子梗。真菌结构最初用水固定，然后更换为85%乳酸进行观察和保存。评估了24个形态学特征（表4）。对于23个特征，每个重复样本进行了25次测量（每个特征225次）。计算了与单个子囊盘相关的简单或有分支的子囊孢子梗的数量，并在分析中使用了分支比例。对于分支模式，检查了每个重复样本的30个子囊盘（每个谱系270个数据点）。使用尼康显微镜（Eclipse Ni，日本）和相机（Nikon DS-Ri2）以及成像软件（NIS-Elements BR，尼康，日本）进行测量。之后，数据按分离株和系统发育簇重新分组，用于统计分析。由于一个分离株（CMW60227）缺少数据，因此排除了与桶状分生孢子细胞相关的三个特征。在GraphPad Prism v.10（https://www.graphpad.com/）中对23个特征（包括比例）进行了统计分析（α=0.05）。使用MS Excel的箱形图检测异常值。使用Anderson-Darling检验测试正态性。使用Welch的t检验和Mann–Whitney检验评估谱系之间的差异。使用GraphPad Prism生成箱形图和条形图。
3 结果
3.1 来自新地点的真菌分离株和DNA提取
从巴西、哥伦比亚、南非、马来西亚和印度尼西亚共获得了365个在形态上典型的Ceratocystis分离株（表S1和S2）。大多数来自患病的Eucalyptus物种，少数来自印度尼西亚的患病Acacia物种，以及两个来自Lansium domesticum和Mimusops elengi的分离株（表S1和S2）。来自东南亚的分离株主要来自仅表现出地上感染的宿主，而来自南非的分离株来自患有根部疾病的树木及其周围的受感染土壤。哥伦比亚的分离株是从新鲜砍伐的Eucalyptus树桩中获得的，没有可见的疾病症状。
3.2 DNA和数据获取
从之前的研究和合作者那里获得了707个分离株的DNA（表S1和S2）。总共使用了1192个分离株，涵盖11个地区和8个宿主，用于后续分析（图1；表S1和S2）。图1显示了不同地理区域中Ceratocystis簇/谱系的分布，包括植物宿主及其在每个国家的比例。地图展示了簇的位置及其相关宿主，突出了每个国家中每种宿主的相对丰度。
3.3 PCR扩增、测序和系统发育分析
3.3.1 ITS和MS204基因区域
大多数新筛选的分离株获得了ITS（600 bp）和MS204（930 bp）序列。213个分离株的ITS色谱图（表S1和S2）显示了由于存在多种ITS类型而产生的冲突序列数据（Naidoo等人，2013）。这些ITS数据并未用于鉴定。根据ITS区域的核苷酸BLAST结果，152个样本属于C. manginecans，并被分为Lineage 1（之前称为C. eucalypticola）或Lineage 2（之前称为C. manginecans；见表S1），或者根据Harrington等人（2024年）的定义，在C. manginecans内部独立聚类。对于MS204区域，362个样本也被类似地鉴定并分为C. manginecans的Lineage 1或2（见表S1）。ITS（图S1）和MS204（图S2）的ML系统发育分析支持将这些样本分为两个谱系。总共检测到9个ITS序列变异，其中来自巴西的样本显示出显著的变异。变异包括ITS5（= Lineage 1/C. eucalypticola）、ITS6和ITS7b（= Lineage 2/C. manginecans ITS类型1和2；Al Adawi等人2013年；Harrington等人2014年），以及另外6个变异。两个来自巴西的样本（变异4）在ITS系统发育树中形成了一个单系群，具有较高的统计支持度（74%；图S1：红色）。其他几个来自巴西的样本在多个样本中显示出固定的SNP变异，形成了另外3个ITS序列变异（变异5-7）。这些SNP变异的统计支持度较低，这些变异与C. cacaofunesta（CMW14798）和C. manginecans（C1442）聚在一起（图S1：黑色）。同样，一些来自哥伦比亚的样本也显示出固定的SNP变异，形成了另外2个ITS序列变异（变异8和9），但统计支持度较低（图S1：黄色）。由于ITS基因区域的局限性，这些数据未被纳入综合分析中。
3.3.2 Tef、βT 1和rpb2基因区域
在新获得的样本代表中，tef的DNA序列长度为725 bp，βT 1为580 bp，rpb2位点为1130 bp。tef1（图S3）、βT 1（图S4）和rpb2（图S5）的最大似然系统发育分析进一步确认了所有样本的身份，将它们归类为C. manginecans。tef1的ML系统发育分析将新获得的样本中的所有样本（除了5个）与C. manginecans的原始类型物种（包括C. eucalypticola和C. mangivora）、C. cacaofunesta、C. fimbriata和C. fimbriatomima归为一类（图S4），因为这个基因区域无法区分这些谱系（Fourie等人2015年）。剩余的5个样本全部来自巴西，形成了一个具有高统计支持度的单系群（75%），与上述分类最为接近（图S4：绿色）。同样，βT 1的ML系统发育分析也将新获得的样本与C. manginecans的原始类型物种（包括C. eucalypticola和C. curvata）归为一类（图S4；Fourie等人2015年）。只有rpb2基因区域的结果与MS204区域一致，将样本分为C. manginecans内的两个主要谱系。总共检测到9个ITS序列变异，其中来自巴西的样本显示出显著的变异。变异包括ITS5（= Lineage 1/C. eucalypticola）、ITS6和ITS7b（= Lineage 2/C. manginecans ITS类型1和2；Al Adawi等人2013年；Harrington等人2014年），以及另外6个变异。两个来自巴西的样本（变异4）在ITS系统发育树中形成了一个具有高统计支持度的单系群（74%；图S1：红色）。其他几个来自巴西的样本在多个样本中显示出固定的SNP变异，形成了另外3个ITS序列变异（变异5-7）。这些SNP变异的统计支持度较低，这些变异与C. cacaofunesta（CMW14798）和C. manginecans（C1442）聚在一起（图S1：黑色）。同样，一些来自哥伦比亚的样本也显示出固定的SNP变异，形成了另外2个ITS序列变异（变异8和9），但统计支持度较低（图S1：黄色）。由于bootstrap支持度较低以及ITS基因区域对于该属的已知局限性，ITS被排除在综合分析之外。
3.3.2 Tef、βT 1和rpb2基因区域
在新获得的样本代表中，tef的DNA序列长度为725 bp，βT 1为580 bp，rpb2位点为1130 bp。tef1（图S3）、βT 1（图S4）和rpb2（图S5）的最大似然系统发育分析进一步确认了所有样本的身份，将它们归类为C. manginecans。tef1的ML系统发育分析将新获得的样本中的所有样本（除了5个）与C. manginecans的原始类型物种（包括C. eucalypticola和C. mangivora）、C. cacaofunesta、C. fimbriata和C. fimbriatomima归为一类（图S4），因为这个基因区域无法区分这些谱系（Fourie等人2015年）。剩余的5个样本全部来自巴西，形成了一个具有高统计支持度的单系群（75%），与上述分类最为接近（图S4：绿色）。同样，βT 1的ML系统发育分析也将新获得的样本与C. manginecans的原始类型物种（包括C. eucalypticola和C. curvata）归为一类（图S4；Fourie等人2015年）。只有rpb2基因区域的结果与MS204区域一致，将样本分为C. manginecans内的两个主要谱系。总共检测到9个ITS序列变异，其中来自巴西的样本显示出显著的变异。变异包括ITS5（= Lineage 1/C. eucalypticola）、ITS6和ITS7b（= Lineage 2/C. manginecans ITS类型1和2；Al Adawi等人2013年；Harrington等人2014年），以及另外6个变异。两个来自巴西的样本（变异4）在ITS系统发育树中形成了一个具有高统计支持度的单系群（74%；图S1：红色）。其他几个来自巴西的样本在多个样本中显示出固定的SNP变异，形成了另外3个ITS序列变异（变异5-7）。这些SNP变异的统计支持度较低，这些变异与C. cacaofunesta（CMW14798）和C. manginecans（C1442）聚在一起（图S1：黑色）。同样，一些来自哥伦比亚的样本也显示出固定的SNP变异，形成了另外2个ITS序列变异（变异8和9），但统计支持度较低（图S1：黄色）。由于bootstrap支持度较低以及ITS基因区域对于该属的已知局限性，ITS被排除在综合分析之外。
3.3.2 Tef、βT 1和rpb2基因区域
在新获得的样本代表中，tef的DNA序列长度为725 bp，βT 1为580 bp，rpb2位点为1130 bp。tef1（图S3）、βT 1（图S4）和rpb2（图S5）的最大似然系统发育分析进一步确认了所有样本的身份，将它们归类为C. manginecans。tef1的ML系统发育分析将新获得的样本中的所有样本（除了五个）与C. manginecans的原始类型物种（包括C. eucalypticola和C. mangivora）、C. cacaofunesta、C. fimbriata和C. fimbriatomima归为一类（图S4），因为这个基因区域无法区分这些谱系（Fourie等人2015年）。剩余的五个样本全部来自巴西，形成了一个具有高统计支持度的单系群（75%），与上述分类最为接近（图S4：绿色）。同样，βT 1的ML系统发育分析也将新获得的样本与C. manginecans的原始类型物种（包括C. eucalypticola和C. curvata）归为一类（图S4；Fourie等人2015年）。只有rpb2基因区域的结果与MS204区域一致，将样本分为C. manginecans内的两个主要谱系。总共检测到9个ITS序列变异，其中来自巴西的样本显示出显著的变异。变异包括ITS5（= Lineage 1/C. eucalypticola）、ITS6和ITS7b（= Lineage 2/C. manginecans ITS类型1和2；Al Adawi等人2013年；Harrington等人2014年），以及另外6个变异。两个来自巴西的样本（变异4）在ITS系统发育树中形成了一个具有高统计支持度的单系群（74%；图S1：红色）。其他几个来自巴西的样本在多个样本中显示出固定的SNP变异，形成了另外3个ITS序列变异（变异5-7）。这些SNP变异的统计支持度较低，这些变异与C. cacaofunesta（CMW14798）和C. manginecans（C1442）聚在一起（图S1：黑色）。同样，一些来自哥伦比亚的样本也显示出固定的SNP变异，形成了另外2个ITS序列变异（变异8和9），但统计支持度较低（图S1：黄色）。由于bootstrap支持度较低以及ITS基因区域对于该属的已知局限性，ITS被排除在综合分析之外。
3.3.2 Tef、βT 1和rpb2基因区域
在新获得的样本中，tef的DNA序列长度为725 bp，βT 1为580 bp，rpb2位点为1130 bp。tef1（图S3）、βT 1（图S4）和rpb2（图S5）的最大似然系统发育分析进一步确认了所有样本的身份，将它们归类为C. manginecans。tef1的ML系统发育分析将新获得的样本中的所有样本（除了五个）与C. manginecans的原始类型物种（包括C. eucalypticola和C. mangivora）、C. cacaofunesta、C. fimbriata和C. fimbriatomima归为一类（图S4），因为这个基因区域无法区分这些谱系（Fourie等人2015年）。剩余的五个样本全部来自巴西，形成了一个具有高统计支持度的单系群（75%），与上述分类最为接近（图S4：绿色）。同样，βT 1的ML系统发育分析也将新获得的样本与C. manginecans的原始类型物种（包括C. eucalypticola和C. curvata）归为一类（图S4；Fourie等人2015年）。只有rpb2基因区域的结果与MS204区域一致，将样本分为C. manginecans内的两个主要谱系。来自巴西、南非、哥伦比亚和印度尼西亚的样本被归类为Lineage 1（之前被鉴定为C. eucalypticola；图S5）。来自印度尼西亚和马来西亚的样本，以及之前被鉴定为C. manginecans、C. mangicola和C. mangivora的样本，被归类为Lineage 2（图S5）。单基因位点的聚类结果总体一致（图S2-S5）。一个结合了四个基因位点（MS204、tef、βT1和rpb2）的ML分析（数据库比对长度为3239 bp）将55个新获得的样本归类为Lineage 1（之前被指定为C. eucalypticola）或Lineage 2（之前被指定为C. manginecans）（根据Harrington等人2024年的定义）（图2）。来自巴西、哥伦比亚、南非和印度尼西亚的样本形成了一个具有统计支持度的单系群（69%），在这里被鉴定为Lineage 1（图2）。来自马来西亚和印度尼西亚的样本形成了一个具有统计支持度的单系群（74%），在这里被鉴定为Lineage 2。MS204和rpb2的系统发育树是最有信息量的基因区域，能够区分C. manginecans内的样本。因此，图3展示了一个结合了MS204和rpb2的ML系统发育树。之前发表的样本（De Mar Angel，未发表；Fourie等人2016年；Hlongwane 2022年；Liu等人2021年；Lynn 2017年）根据这个ML分析被重新分配到不同的谱系中（图2）。
基于多基因最大似然（ML）分析的Ceratocystis物种的MS204、βT 1、tef1和rpb2序列的系统发育树。本研究中使用的Ceratocystis样本（每个国家和宿主只包括代表性的单倍型）。彩色框表示在本研究中测序的样本，来自五个地区（巴西、哥伦比亚、南非、马来西亚和印度尼西亚）。在相应的分支上标出了bootstrap值高于50%的样本。图3基于MS204和rpb2基因序列的组合数据集的Ceratocystis样本的最大似然（ML）分析的系统发育树（每个国家和宿主只包括代表性的单倍型）。加粗并突出显示在彩色块中的样本是在本研究中测序的样本，并被鉴定为C. manginecans复合体中的Lineage 1或Lineage 2。在哥伦比亚的Eucalyptus中的56个样本中出现了拓扑差异（8个），在南非（34个），在印度尼西亚（10个）和巴西（4个），主要是在ITS和MS204之间（49个样本；表S1：用蓝色突出显示）。七个印度尼西亚样本在MS204和rpb2之间显示出差异（图3：黑色框）。这些位点不一致的模式与不完全的谱系分化一致，表明两个谱系之间的生殖隔离不完全，不排除混合血统的可能性。
3.3.3 MAT 1和MAT 2基因区域
在96个代表样本中，每个MAT位点的DNA序列长度约为1130 bp。MAT的系统发育树与多基因树大体一致，每个都恢复了三个得到良好支持的谱系（图S6和S7），尽管如下所述，一些样本独立聚类。在MAT1的ML系统发育树中，样本形成了三个谱系（图S6）。组1（97%的bootstrap支持）主要来自巴西、南非、哥伦比亚和印度尼西亚。组2（97%的bootstrap支持）主要由马来西亚和印度尼西亚的样本组成。组3（98%的bootstrap支持）主要由巴西的样本组成。剩余的来自巴西的样本与组1的样本紧密相关，而一个来自哥伦比亚的样本（CMW 56431）单独聚类，但与C. fimbriatomima密切相关。MAT2的ML系统发育树也解析了三个谱系（图S7）。组1（94%的bootstrap支持）包含了大多数样本，除了来自马来西亚的样本。组2（77%的bootstrap支持）由马来西亚和印度尼西亚的样本组成。组3（93%的bootstrap支持）包括四个印度尼西亚的样本，与组1聚类最为接近。同样，CMW 56431形成了自己的分支，与C. fimbriata（菌株C1476）和C. fimbriatomima密切相关。
3.4 微卫星标记基因分型
所有16个微卫星标记都表现出多态性，每个位点的等位基因数量从3到32不等。共生成了134个不同的等位基因。总共测序了159个代表性等位基因。偶尔，测序得到的等位基因长度与片段分析得到的长度不同。测序得到的等位基因长度被用来重新校准所有后续分析的片段长度（表S1）。
3.5 种群遗传分析
3.5.1 遗传多样性统计
对具有完整SSR数据集的1174个样本进行了种群遗传分析。由于缺少SSR数据，有18个样本被排除在后续的种群遗传分析之外。在1174个样本中，检测到了466个MLGs。11个国家层面的种群的基因型多样性（G和H）各不相同，六个国家的变异相对较高（表1）。六个国家的Simpson指数（λ > 0.90）较高，而其他国家的λ较低，表明这些种群可能更倾向于克隆（例如，阿曼λ = 0.20；巴基斯坦λ = 0.37）或在最近引入后经历了瓶颈效应（例如，哥伦比亚λ = 0.51）。均匀度（E5）的范围从0.45到0.84，表明基因型分布的均匀度中等至较高（表1）。基因多样性（Hexp）也因国家而异，越南最高（0.51），其次是印度尼西亚（0.46）、巴西（0.36）和中国（0.35）。Oman、巴基斯坦和哥伦比亚的Hexp值最低（< 0.05）。当按谱系（1和2）分析时，结果相似，尽管一些样本量较小，限制了有意义的多样性统计的计算（表1）。值得注意的是，巴西（Cluster 1，Lineage 1）的Hexp最高（0.36），越南（Cluster 2，Lineage 2）的Hexp最高（0.42）。在假定的杂交亚群中，在56个样本中检测到了31个MLGs，巴西的多样性最高（0.24），其次是南非（0.16）、印度尼西亚（0.13）和哥伦比亚（0.03）（表1）。表1显示了根据地理位置和多基因ML系统发育簇/谱系分组的样本的遗传多样性统计。
3.5.1 遗传多样性统计
对1174个具有完整SSR数据集的样本进行了种群遗传分析。由于缺少SSR数据，有18个样本被排除在后续的种群遗传分析之外。从1174个样本中检测到了466个MLGs。11个国家层面的种群的基因型多样性（G和H）各不相同，六个国家的变异较大（表1）。六个国家的Simpson指数（λ > 0.90）较高，而其他国家的λ较低，表明这些种群可能更倾向于克隆（例如，阿曼λ = 0.20；巴基斯坦λ = 0.37）或在最近引入后经历了瓶颈效应（例如，哥伦比亚λ = 0.51）。均匀度（E5）的范围从0.45到0.84，表明基因型分布的均匀度中等至较高（表1）。基因多样性（Hexp）也因国家而异，越南最高（0.51），其次是印度尼西亚（0.46）、巴西（0.36）和中国（0.35）。Oman、巴基斯坦和哥伦比亚的Hexp值最低（< 0.05）。当按谱系（1和2）分析时，结果相似，尽管一些样本量较小，限制了有意义的多样性统计的计算（表1）。值得注意的是，巴西（Cluster 1，Lineage 1）的Hexp最高（0.36），越南（Cluster 2，Lineage 2）的Hexp最高（0.42）。在假定的杂交亚群中，56个样本中检测到了31个MLGs，巴西的多样性最高（0.24），其次是南非（0.16）、印度尼西亚（0.13）和哥伦比亚（0.03）（表1）。
3.5.2 种群结构
未经先验假设的STRUCTURE分析表明，最优的K值为2和5（Evanno ΔK, LnP(K)；图4；图S8）。当K = 2时，来自巴西、中国、哥伦比亚、印度尼西亚和乌拉圭的样本聚在一起（蓝色），而来自印度尼西亚、马来西亚、阿曼、巴基斯坦和越南的样本聚在一起（橙色）。这些结果与多基因ML树中观察到的谱系一致，并表明这些群体在地理上有一定程度的分离。在几个种群中观察到了混合的迹象，特别是在越南、印度尼西亚和哥伦比亚。在K = 5的条形图中（图4），来自巴西、哥伦比亚和乌拉圭的样本聚在一起（蓝色），中国和刚果的样本聚在一起（紫红色），而来自印度尼西亚（橙色）和南非的样本各自形成了自己的群体。这个较高的K值揭示了在K = 2时确定的两个主要群体内的额外亚结构。后续的群体内STRUCTURE运行表明，Cluster 1的K值为2和6（图S8b），Cluster 2的K值为2和9（图S8c）。观察到的亚结构与使用所有数据进行的分析中观察到的群体一致。图4显示了从11个国家收集的Ceratocystis样本的克隆校正数据集的种群结构（K）分析。每个个体由一条垂直线表示，颜色表示样本分配到特定群体的比例。结构分析在没有任何先验假设的情况下，揭示了最优的簇数为2和5个。DAPC K-means分析和基于未校正克隆数据集的BIC聚类分析得出的结果与STRUCTURE分析识别的簇一致，将数据分成了两个遗传簇（图5）。来自巴西、哥伦比亚、刚果、南非和乌拉圭的个体仅属于簇1，而来自马来西亚、阿曼和巴基斯坦的个体仅属于簇2。来自越南和印度尼西亚的个体主要归入簇2，但也有个体同时属于两个簇。对于中国来说情况则相反，其个体主要属于簇1，但也存在于两个簇中。这种明显的分离和簇内的紧密聚集表明这两个种群在遗传上是不同的，并且之间的基因交流或混合非常有限。
遗传簇的主成分判别分析（DAPC）显示，两个簇中的分离度很高。簇1包括来自巴西、哥伦比亚、刚果、南非和乌拉圭的隔离株，而簇2包括来自马来西亚、阿曼和巴基斯坦的隔离株。来自越南和印度尼西亚的隔离株主要归入簇2，但也有个体同时属于两个簇。相反，来自中国的隔离株主要归入簇1，但也存在于两个簇中。这种明显的分离和簇内的紧密聚集表明这两个种群在遗传上是不同的，并且之间的基因交流或混合非常有限。
3.6 最小生成树网络分析（MSN分析）显示，1174个隔离株可以分为两个不同的簇（图6），这与ML、STRUCTURE和DAPC K-means分析的结果一致。来自巴西、哥伦比亚、刚果、南非和乌拉圭的隔离株仅属于簇1（谱系1），这些隔离株彼此之间的亲缘关系也更为密切。同样，来自马来西亚、阿曼和巴基斯坦的隔离株仅属于簇2（谱系2）。来自越南（图S10a）、印度尼西亚（图S10b）和中国的隔离株同时存在于两个簇中，其中印度尼西亚的隔离株在单倍型上的差异更大。不同的钟形曲线和最小的重叠表明这些种群在遗传上是不同的，它们之间的基因交流或混合非常有限。对具有混合特征的隔离株进行的DAPC K-means分析和BIC聚类分析也将其分为两个组（图S9）。来自印度尼西亚的个体仅属于组1，而来自巴西、哥伦比亚和南非的个体仅属于组2。
3.6 最小生成树网络（MSN）分析显示了基于Edwards遗传距离的Ceratocystis隔离株之间的关系。每个节点代表一个多基因型（MLG），节点的大小与该MLG的个体数量成正比。节点的颜色根据采样地点进行区分。节点之间的线条颜色渐变表示遗传距离：深色线条表示遗传相似性较高，浅色线条表示遗传差异较大。仅对桉树样本进行的分析也得出了相同的两个主要谱系（图S11）。对于混合特征的隔离株，MSN分析没有显示出明显的结构或共享的单倍型。来自印度尼西亚的隔离株仅属于组1，而来自巴西、哥伦比亚和南非的隔离株仅属于组2。
3.7 成对种群分化和基因流分析显示，STRUCTURE和DAPC确定的簇得到了AMOVA计算的统计支持，表明种群间存在显著分化（44%），同时种群内也存在56%的变异（表2）。这些数值表明种群内具有较高的多样性，种群间结构也很强。对于具有混合血统的隔离株进行的AMOVA分析表明，不同种群之间存在显著分化（64%），其中种群是根据每个国家的隔离株来定义的。表2显示了按国家分组的Ceratocystis隔离株的分子方差层次分析（AMOVA）的结果。
成对分化和基因流分析使用国家级别的种群数据（表3）显示，当比较属于同一谱系的国家的种群时，Gst值较低；而当比较来自不同谱系的国家的种群时，Gst值较高。例如，比较巴西（谱系1）和阿曼（谱系2）时，Gst接近1（0.98），而比较巴西和哥伦比亚（均为谱系1）时，Gst较低（0.38），表明分化程度较低。这一模式在Nm值中也得到了体现，接近零的值反映了高分化程度和有限的基因流。结果与ML、STRUCTURE、DAPC和MSN分析的结果一致。对于两个Ceratocystis亚种群（谱系1：C. eucalypticola；谱系2：C. manginecans），Gst=0.68和Nm=0.12表明它们具有高度分化且基因流有限，这可能表明这些谱系正在经历由地理隔离驱动的物种形成过程。所有成对比较都具有显著性（p=0.000–0.021，基于1000次置换）。表3显示了基于国家划分的所有Ceratocystis种群的分化情况。
3.8 形态学比较显示，在评估的23个特征中，有17个特征的零假设（无形态差异）被两个样本t检验所拒绝，从而表明两个谱系之间存在显著差异（图7）。对于统计上显著的特征，差异程度是通过计算谱系1和谱系2中每个特征的隔离株平均值之差，再除以两个簇的平均值来确定的，以提供差异的相对度量（绝对平均差异：表4）。两个谱系之间的尺寸平均差异范围从2%到121%不等（表4）。值得注意的是，分枝状分生孢子梗与简单分生孢子梗的比例差异达到了121%，谱系1的比例为0.19，而谱系2的比例为0.77（图7）。此外，孔状菌丝的平均长度差异为23%，谱系1的测量值为44.9 μm，谱系2的测量值为56.7 μm。
4 讨论
本研究考虑了来自11个国家和8种宿主植物（包括金合欢、桉树和芒果树）的大量Ceratocystis隔离株。先前从Ceratocystis枯萎病和溃疡病爆发中鉴定出的隔离株被归类为C. manginecans、C. eucalypticola或C. fimbriata复合体的成员。通过对7个基因区域进行系统发育分析，并结合使用16个微卫星标记的群体遗传学分析，来评估物种边界。多基因位点系统发育将谱系边界与模式标本进行了锚定，而SSR分析进一步支持了这些边界，并提供了更详细的多样性、克隆性和基因流的信息。所有方法一致地将隔离株划分为Harrington等人（2024年）定义的C. manginecans内的两个得到充分支持的谱系。尽管大多数隔离株被正确分类，但有一小部分隔离株显示出位点不一致性和混合现象，表明生殖隔离不完全，暗示了谱系分选不完全和/或潜在的杂交。多基因系统发育分析将新获得的隔离株划分为C. manginecans内的两个得到统计支持的谱系。这些谱系对应于之前被单独处理的物种，其中谱系1包括之前被指定为C. eucalypticola的隔离株，谱系2包括被指定为C. manginecans的隔离株。区分这两个谱系的最强信号来自编码基因rpb2和MS204的序列，这些序列共同区分了13个物种。MAT基因区域的序列数据也被用来区分本研究中의隔离株与Harrington等人（2024年）描述的新物种。结果显示，使用MAT区域的ML分析对隔离株进行聚类与多基因ML系统发育的结果基本一致，尽管有些隔离株的分类不一致。在筛选的隔离株中，ITS区域发现了显著的变异，其中来自巴西的隔离株表现出最多的独特ITS序列变异（单倍型）。这种rDNA插入缺失的种内和基因组内变异已被广泛认可，因此仅依靠ITS序列进行物种划分是不可靠的（Harrington等人，2014年；Naidoo等人，2013年）。研究结果突显了仅基于从种群中抽取的代表性基因型来定义物种边界的复杂性，并强调了理解种群内部和种群之间的自然变异对于准确划分物种的重要性（Oliveira等人，2015年）。通过对1174个分离株使用16个微卫星标记进行的群体遗传分析，发现了两个不同的种群簇，分别对应于两个系统发育谱系（谱系1=种群簇1和谱系2=种群簇2）。尽管K=2能够代表这两个谱系的种群结构，但在K=5时观察到的次要信号可能反映了这些谱系内部更细粒度的种群亚结构。与Liu等人（2021年）的研究结果一致，簇1中的分离株主要与桉树相关，具有广泛的地理分布，并显示出较低的多样性。相比之下，簇2中的分离株局限于亚洲，表现出更高的遗传多样性，并且与更广泛的宿主范围相关。来自越南的种群在遗传上最为多样化，这与Fourie等人（2016年）的研究结果一致。然而，在亚种群水平上，分析显示巴西的分离株具有最高的遗传多样性。这支持了Ferreira等人（2011年）的研究结果，并与ITS单倍型观察到的高多样性相符。各簇之间的基因流有限，表明虽然它们代表了不同的实体，但并未完全实现生殖隔离。这支持了这样的假设：这些谱系可能有不同的原产地范围，或者很久以前就被引入到这些地区，现在正通过宿主关联和地理隔离经历物种形成过程（Harrington等人，2024年；Liu等人，2021年）。由于桉树在东南亚的全球分布范围相对于金合欢更广，因此采样偏向于桉树可能会降低检测宿主相关结构的效力。然而，使用仅包含桉树的子集进行的MSN分析恢复了两个谱系/种群簇之间的主要分裂（图S11）。这表明这里报告的主要种群结构足够稳健，可以解释宿主采样的偏差。一部分分离株显示出不一致的系统发育位置和混合信号，这与不完全的谱系分选以及可能的渐渗或杂交一致。在其他Ceratocystis物种复合体（Engelbrecht和Harrington，2005年；Harrington等人，2024年；Kanzi等人，2020年；Naidoo等人，2013年）和其他真菌物种复合体（Sillo等人，2019年）中也报告了类似的模式。在这项研究中，在巴西、哥伦比亚、南非和印度尼西亚发现了混合分离株，主要来自商业繁殖的桉树。尽管在混合种群中没有观察到共享的单倍型，但DAPC分析分辨出了两个不同的簇。一个簇包括来自巴西、哥伦比亚和南非的分离株，它们的ITS和MS204拓扑结构不一致，这表明发生了祖先杂交或渐渗事件，随后通过桉树贸易传播（Ferreira等人，2011年，2013年；Liu等人，2021年）。第二个簇包括来自印度尼西亚的分离株，这些分离株是从桉树克隆和金合欢物种中收集的，这表明可能的杂交事件可能是由于两个谱系在该地区的共同存在而促成的。其中一些分离株在rpb2和MS204之间显示出不一致性。这些发现共同支持了最近分化谱系之间有限的但持续的基因流，这与生殖屏障仍在演化的系统预期一致（Harrison和Larson，2014年）。遗传多样性模式提供了关于传播途径的见解。遗传多样性较低的地区，如哥伦比亚，与谱系1（种群簇1）的近期引入一致。一种可能的引入途径是通过受感染的桉树繁殖材料传播，这一点得到了哥伦比亚和巴西之间共享的MLG的支持。之前已有研究提出种植材料的传播是一个关键途径（Ferreira等人，2011年，2013年；Liu等人，2021年），并且本研究的成果也支持这一点，即共享的MLG主要出现在簇1中的桉树克隆上。宿主扩展事件也显得很重要，特别是对于谱系2而言。这一点通过Ceratocystis（簇1）在 Punica 和桉树上的遗传关联得到了证明（Harrington等人，2014年；Liu等人，2021年），以及在印度尼西亚的Acacia和桉树上的关联（簇2：Hlongwane，2022年）。在马来西亚（种群簇2）也观察到了从金合欢到桉树的类似转变。这些发现突出了关键的传播路线，并强调了严格检疫的必要性。本研究还发现了来自以前未报道的宿主和地区的分离株。来自哥伦比亚的分离株被归入谱系1，这是该国家首次报告这种谱系在桉树上的存在。这些分离株是从无症状树木的新鲜伤口中收集的，这与中国的报告（Liu等人，2021年）和南非的报告（van Wyk等人，2012年）一致。之前被鉴定为C. manginecans（Pratama等人，2021b）和C. fimbriata（Suwandi等人，2021）的Mimusops elengi和Lansium domesticum的分离株被重新归入谱系1。相反，来自马来西亚的桉树分离株被归入谱系2，这是该地区首次报告这种病原体在该宿主上的存在。野外观察和已发表的研究表明，不同谱系中的分离株在致病性上可能存在差异。谱系1已从中国（Liu等人，2021年）、南非（van Wyk等人，2012年）和哥伦比亚（当前研究）的无症状桉树的新鲜伤口中分离出来，表明其致病性较弱或表现为腐生行为。Hlongwane（2022年）显示，谱系1的代表在南非已经存在多年，但没有疾病发生的证据。相比之下，谱系2的分离株与所有报道的宿主上的严重萎蔫和溃疡爆发有关（Al Adawi等人，2013年；Tarigan等人，2011年）。在其他Ceratocystis病原体系统中也报告了类似的种内疾病严重程度差异（Oliveira等人，2016年，2021年）。需要使用代表性分离株和宿主基因型进行控制接种试验来验证这些报告的差异。对代表两个谱系的分离株进行详细的形态学比较后发现，在分析的23个特征中有17个特征存在细微但统计上显著的差异。最显著的是分支状的aleuriospore分生孢子梗的比例较高以及较长的ostiolar菌丝，这两个特征在谱系2的分离株中更为常见。虽然这些特征单独来看并不具有诊断性，但它们的综合评估可以提供生物学见解。与其他Ceratocystidaceae家族一样，形态学上的重叠相当大（de Beer等人，2014年），这些差异最好解释为支持谱系分化的定量变异。还应注意的是，用于形态学比较的分离株数量相对较少；更广泛的采样可能会揭示更多的种内变异。这些特征的生态和生物学意义仍有待研究，特别是在潜在的疾病生物学差异方面。属于两个谱系的分离株显示出不同的地理分布，这对检疫具有重要意义。防止这些种群引入新地区将是管理它们的第一步，从而减少桥头效应（Lombaert等人，2010年）、宿主扩展（Slippers等人，2005年）和杂交事件（Brasier，2000年）的可能性。如果这些病原体在新地区成功建立，监测这些爆发中的分离株的遗传多样性将成为管理它们的关键下一步，特别是为抗性育种策略提供信息，正如Fernandes等人（2024年）和Oliveira等人（2021年）所展示的。从生物安全的角度来看，识别本研究中确定的两个谱系将有助于提高识别、诊断和监测的能力。分布和遗传多样性的差异可以指导高风险途径的监测，特别是繁殖材料的传播，并为新爆发的应对提供信息。这也将限制与混合和宿主扩展事件相关的危险。鉴于报告的攻击性差异（Al Adawi等人，2013年；Tarigan等人，2011年；van Wyk等人，2012年）和流行病学差异（Al Adawi等人，2006年；Benso等人，2024年），谱系级别的识别也对疾病管理具有直接意义，包括基于风险的种植材料部署和有针对性的控制策略。
**5 结论**
确定与C. manginecans相关的Ceratocystis物种的分类边界一直具有挑战性。Harrington等人（2024年）建议将C. eucalypticola、C. mangivora和C. mangicola归为C. manginecans的同义词，同时保留C. fimbriata作为一个独特的、宿主特异性的克隆谱系。在这项研究中，多基因位点分析支持将之前被指定为C. eucalypticola和C. manginecans的分离株区分开来，这与基因谱系一致性（GCPSR）框架大体一致（Fourie等人，2015年；Taylor等人，2000年）。然而，可育性（Harrington等人，2024年）和混合信号表明生殖隔离不完全，某些位点之间的不一致性表明基因谱系一致性并未完全解决。尽管这些不一致性的原因（例如，不完全的谱系分选或杂交）没有得到明确调查，但这些模式与分化谱系一致，而不是完全不同的物种。我们采取了保守的方法，认定了C. manginecans内的两个谱系：谱系1（以前称为C. eucalypticola）和谱系2（以前称为C. manginecans）。需要进一步的多基因位点研究来澄清最近被归入C. manginecans的其他分类单元（例如，C. mangivora、C. mangicola）的位置。尽管如此，识别这两个谱系为诊断、流行病学和检疫提供了一个实用的框架，同时支持有效的疾病管理和风险评估。
**作者贡献**
Kira M. T. Lynn：概念化（平等），数据管理（负责人），正式分析（负责人），调查（负责人），方法学（负责人），验证（负责人），可视化（负责人），写作——初稿（负责人）。
Michael J. Wingfield：概念化（平等），资金获取（负责人），方法学（平等），项目管理（负责人），资源（负责人），监督（负责人），写作——审阅和编辑（负责人）。
Leonardo S. S. Oliveira：概念化（平等），数据管理（平等），资源（平等），写作——审阅和编辑（平等）。
Acelino C. Alfenas：数据管理（平等），资源（平等），写作——审阅和编辑（支持）。
Rafael Ferreira Alfenas：数据管理（平等），资源（支持），写作——审阅和编辑（支持）。
Seonju Marincowitz：数据管理（支持），正式分析（支持），调查（支持），方法学（支持），验证（支持），可视化（支持），写作——审阅和编辑（支持）。
Irene Barnes：概念化（平等），资金获取（负责人），调查（平等），项目管理（负责人），资源（负责人），监督（负责人），写作——审阅和编辑（负责人）。
**致谢**
我们感谢Johannes Joubert和Nam Pham博士在形态学比较中的统计分析方面的帮助。我们感谢Carlos Rodas博士提供来自巴西米纳斯吉拉斯州维索萨联邦大学植物病理学系的分离株，以及巴西分离株的DNA样本。感谢Marthin Tarigan博士提供来自Lansium domesticum和Mimusops elengi的分离株。感谢Samuel A. Santos博士在印度尼西亚协助样本收集。这项研究是通过比勒陀利亚大学林业和农业生物技术研究所（FABI）与印度尼西亚APRIL集团RGE之间的双边协议启动的。我们感谢RGE-FABI树木健康计划和南非国家研究基金会（NRF，MND190619448979）的资助。
**资金**
这项工作得到了以下机构的支持：国家研究基金会（10.13039/501100001321）* MND190619448979 RGE-FABI树木健康计划。
**利益冲突**
作者声明没有利益冲突。
**数据可用性声明**
所有数据均公开发布在支持信息S1中。序列数据已存放在公共数据库NCBI中，访问编号在表S1中提供。
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