摘要
缺血性心脏病仍然是全球主要的死亡原因之一。我们研究了选择性分化簇-36受体（CD36）调节剂azapeptide MPE-298在心肌缺血-再灌注小鼠模型中的心脏保护作用。在再灌注之前给予单次静脉注射MPE-298，可使风险区域的梗死面积减少44%，并暂时降低左心室长链脂肪酸（LCFA）的积累，这一效果与脂肪酸的饱和状态无关。代谢组学分析发现了可能为三羧酸循环提供能量并支持谷胱甘肽依赖性抗氧化防御的氨基酸变化。基因表达分析显示，心脏和脂肪组织中的氧化应激及炎症相关基因发生了短暂性调节。因此，我们得出结论：MPE-298通过调节CD36显示出治疗急性心肌缺血和再灌注的潜力，其机制可能是通过促进代谢恢复和限制过量LCFA的吸收。
缩写
5-LO：5-脂氧合酶（5-lipoxygenase）
AAR：风险区域（area at risk）
Alox12：花生四烯酸12-脂氧合酶（arachidonate 12-lipoxygenase）
Alox15：花生四烯酸15-脂氧合酶（arachidonate 15-lipoxygenase）
Alox5：花生四烯酸5-脂氧合酶（arachidonate 5-lipoxygenase）
CCL2：CC基序趋化因子配体2（CC motif chemokine ligand 2）
CD36：分化簇36（cluster of differentiation 36）
Cebpβ：CCAAT/增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancer-binding protein beta）
Tc：循环阈值（cycle threshold）
DEPC：二乙基焦碳酸酯（diethylpyrocarbonate）
DHA：二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid）
dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxynucleoside triphosphate）
DPA：二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid）
ETE：二十碳三烯酸（eicosatrienoic acid）
FA：脂肪酸（fatty acids）
FAMES：脂肪酸甲基酯（fatty acid methyl esters）
GHRPs：生长激素释放肽（growth hormone-releasing peptides）
IA：梗死面积（infarct area）
IHD：缺血性心脏病（ischemic heart disease）
IV：静脉内（intravenous）
Ki：抑制常数（inhibition constant）
LCAL：左冠状动脉结扎（left coronary artery ligation）
LCFA：长链脂肪酸（long-chain fatty acids）
LOX-1：凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1）
LTB4：白三烯B4（leukotriene B4）
LV：左心室（left ventricle）
MI：心肌梗死（myocardial infarction）
MI/R：心肌缺血和再灌注（myocardial ischemia and reperfusion）
MMLV：莫罗尼小鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus）
MUFA：单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids）
NEFA：非酯化脂肪酸（nonesterified fatty acids）
Nfe2l2：核因子红细胞衍生2类似物2（nuclear factor erythroid-derived 2-like 2）
NOX：NADPH氧化酶（NADPH oxidase）
Nrf2：核因子红细胞衍生2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2）
oxLDL：氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoproteins）
PCI：正化学电离（positive chemical ionization）
PPAR：过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor）
PUFA：多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids）
qPCR：定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction）
R-FSL-1：R-成纤维细胞刺激脂肽-1（R-fibroblast-stimulating lipopeptide-1）
ROS：活性氧物种（reactive oxygen species）
SC：皮下（subcutaneous）
SFA：饱和脂肪酸（saturated fatty acids）
TCA：三羧酸（tricarboxylic acid）
TNF-α：肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α）
TTC：2,3,5-三苯基四唑啉氯盐（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride）
μPET：微正电子发射断层扫描（micro-positron emission tomography）
尽管在预防、治疗和监测方面取得了进展，心血管疾病（尤其是缺血性心脏病IHD）和中风的发病率仍然在全球范围内持续上升[[1]]。由于人口老龄化以及高血压、糖尿病和肥胖症的发病率增加，预计与IHD相关的死亡将持续[[2-4]]，尽管某些高收入国家的报告表明这些疾病有所减少[[5]]。年轻人和中年人患IHD和心肌梗死（MI）的病例急剧增加，这对患者及其家庭造成了重大的健康问题、心理压力和经济负担[[6]]。在幸存的心肌梗死患者中，即使实施了药物治疗，仍有高达30%的人会发展成心力衰竭[[7]]。迫切需要新的治疗方法来改善当前策略的有限长期效果，尤其是在存在多种合并症和人口老龄化的背景下。及时的临床再灌注对于保护心肌组织和防止缺血后的不可逆损伤至关重要[[8, 9]]。然而，再灌注可能会因氧化和炎症反应加剧而加重组织损伤[[8]]。再灌注后的代谢紊乱，特别是循环中非酯化脂肪酸（NEFA）水平的升高，会损害心脏功能的恢复[[10]]。心肌缺血和再灌注（MI/R）后，脂肪组织中的NEFA迅速释放会通过增加早期再灌注期间的心肌长链脂肪酸（LCFA）可用性，从而引发有害的代谢转变，这一过程部分受到分化簇36（CD36）受体的调节[[11]]。在这种脆弱状态下，心肌的β-氧化产生的ATP效率低于葡萄糖代谢，破坏了糖酵解和丙酮酸氧化之间的耦合，导致心肌细胞酸化、离子失衡、心脏效率降低以及功能恢复受损[[10]]。CD36是一种B2类清除受体，广泛表达于免疫和非免疫细胞中，在响应多种细胞外配体时发挥不同的细胞类型特异性功能[[12]]。它在免疫代谢中起核心作用，整合了对多种配体的代谢和免疫信号传导，包括含有血栓反应蛋白结构域的蛋白质、危险相关分子模式、LCFA和氧化低密度脂蛋白（oxLDL）[[12]]。在心脏中，CD36对于心肌细胞质膜对游离LCFA的摄取至关重要，从而将脂肪酸（FA）的运输与心肌代谢活动联系起来[[13, 14]]。最初发现生长激素释放肽（GHRPs）可以与小鼠心脏膜中的CD36蛋白结合[[15]]，这促使人们探索非GH分泌的GHRP类似物可能的心血管效应。在喂食高脂高胆固醇饮食的动脉粥样硬化载脂蛋白E缺乏小鼠模型中，GHRP-6类似物和azapeptide衍生物减缓了动脉粥样硬化的进展[[16]]并促进了主动脉病变的消退[[17, 18]]。这些肽主要作用于内膜巨噬细胞，通过CD36依赖的方式减少oxLDL的摄取，增强胆固醇的外排和反向运输，并降低血管炎症[[16-21]]。在我们之前的研究中，发现用CD36调节剂进行14天的预处理可以改善小鼠短暂心肌缺血后的心肌代谢和功能障碍[[11]]。然而，像hexarelin（H-His-D-2-Methyl-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2）这样的GHRP作为CD36配体的使用在进一步研究中受到限制，因为它们对胃饥饿素受体（ghrelin receptor）具有非选择性 binding[[22]]。相比之下，GHRP-6的azapeptide衍生物显示出对CD36的高选择性和亲和力，其抑制常数（Ki）为100 nm，这是通过竞争分析确定的[[23, 24]]。此外，像MPE-298这样的环状azapeptides在抑制促炎的一氧化氮和细胞因子（包括肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 和CC基序趋化因子配体2 (CCL2)）的产生方面表现出显著的效力，其作用浓度（10−7 m）低于线性对应物[[25]]。在巨噬细胞中，MPE-298被发现可以通过激活Lyn (Src家族) 和Syk (spleen) 酪氨酸激酶来诱导CD36的内吞作用[[26]]。内化的CD36-MPE-298复合物随后抑制了由oxLDL触发的凝集素样oxLDL受体-1 (LOX-1) 介导的信号传导，从而减少了CCL2的分泌，并防止了线粒体膜电位的去极化和活性氧物种 (ROS) 的产生。以往对CD36配体的研究主要依赖于预处理方案，而再灌注前急性干预的直接影响尚未确定。在这项研究中，我们探讨了在C57BL/6小鼠左冠状动脉结扎 (LCAL) 期间给予单次静脉注射MPE-298是否可以减少心肌损伤，通过脂质组学和代谢组学分析改变左心室 (LV) 的能量代谢和代谢底物积累，以及调节与CD36相关的信号通路。
材料与方法
化学物质
Azapeptide MPE-298是通过固相合成方法制备的，采用A3-大环化反应，具体方法如前所述[[27]]。结合亲和力通过竞争性结合实验评估，结果表明MPE-298是在其他合成的GHRP-6类似物中亲和力最高的（0.08 μm）[[25, 27]]。其效力通过测量MPE-298对RAW264.7小鼠巨噬细胞中R-FSL-1刺激的炎症反应的抑制作用来评估，结果发现MPE-298减少了TNF-α和CCL2的分泌，这些数据是用商业ELISA试剂盒（mouse ELISA Ready-SET-Go!™ kits; eBioscience, San Diego, CA, USA）测定的。
动物
野生型C57BL/6J近交小鼠品系（品系号000664）（Cd36+/+）和CD36缺陷型（Cd36−/−）小鼠（品系号019006）从Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME, US）购买，并在无特定病原体（SPF）设施中饲养。小鼠在被转移到静态笼子中的控制环境之前，首先被关在通风笼子里。小鼠按照12小时光照/12小时黑暗的周期生活，并自由摄取Teklad辐照全价饲料（T.2918.15; Inotiv Inc., West Lafayette, IN, US）和饮用水。所有实验方案均获得了机构动物伦理委员会的批准（编号23-034），并遵循加拿大动物护理委员会和美国国立卫生研究院制定的指南。
实验组和方案
年龄相匹配的雄性Cd36+/+和Cd36−/−小鼠（30–35克）被随机分配到两个主要实验组之一：一组接受30分钟的LCAL手术，另一组接受相应的假手术。在再灌注后24小时，评估两组小鼠的心肌梗死面积（IA）。在另一组中，Cd36+/+小鼠接受了LCAL并再灌注3小时或24小时，以便进行代谢组和脂质组学分析。LCAL按照之前描述的方案进行，但有一些修改。小鼠首先用3.5%异氟烷在1.5升/分钟氧气流量下麻醉，然后插管并给予6毫克/千克腹腔注射利多卡因以防止心律失常。监测心电图，并使用加热垫维持体温。最初的一小时内给予0.9% NaCl–2.5%葡萄糖溶液（10毫升/千克）皮下注射，之后根据需要继续给予。为了防止角膜干燥，涂抹了眼药膏。手术在Nikon SMZ645立体显微镜（0.8–5倍放大倍数）下进行。在第三肋间间隙进行左胸廓切开术。使用牵开器分离横向和深部胸肌以暴露心脏。在光块下方观察左冠状动脉，并在左心房附件下游1毫米处用1/2圆形手术刀片和8号尼龙线结扎动脉。结扎后保持30分钟的缺血状态，期间风险区域变得明显苍白。在再灌注前10分钟，小鼠接受150微升的溶剂（0.9% NaCl）或MPE-298（3微摩尔/千克）的静脉注射。结扎释放后，缝合手术部位，并皮下给予长效丁丙诺啡（1毫克/千克），然后拔管。在再灌注后3小时或24小时，通过过量异氟烷麻醉处死小鼠。假手术的小鼠接受相同的程序，但不进行结扎。
再灌注24小时后，小鼠再次麻醉并在LCAL原位进行结扎。通过主动脉逆行注射0.5毫升的2.0% Evans蓝染料（Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, US）以区分非缺血组织（蓝色染色部分）。取出心脏，用PBS冲洗，快速冷冻，然后用小鼠心脏切片机将LV切成1毫米厚的切片。切片在37°C下用2,3,5-三苯基四唑啉氯盐（TTC）浸渍15分钟以可视化IA，然后固定在10%中性缓冲福尔马林中12小时。使用Coolpix 4500数字相机（Nikon）通过计算机化平面测量法（Adobe Photoshop CC 2015）测量每个切片的LV面积、风险区域（AAR）和IA，并对处理组和未处理组进行盲法分析。每个切片的结果使用面积加权平均法计算，公式为（A1 × W1）+（A2 × W2）+…+（An × Wn），其中A是通过平面测量确定的IA百分比，W是相应切片的重量[[11]]。
目标脂肪酸甲基酯的分析
LV组织经过气相色谱-质谱法进行定量分析，方法如前所述[[28, 29]]。简要来说，大约50毫克的组织在4°C下用含0.004%丁基羟基甲酚（BHT）的2:1氯仿/甲醇溶液中过夜孵育，过滤后用氮气干燥。脂肪酸以甲基酯（FAMES）的形式分析，通过甲醇中的乙酰氯进行酯交换反应。分析在7890B气相色谱仪上完成，该色谱仪连接5977A质量选择检测器（Agilent Technologies, Santa Clara, USA），使用J&W Select FAME CP7420毛细管柱（内径100微米；Agilent Technologies Inc.），并在正化学电离（PCI）模式下进行，氨气作为载气。样品在以下条件下处理：注射温度270°C，分流比50:1，载气为高纯度氦气，流速为0.44毫升/分钟。温度梯度设置为190°C持续25分钟，然后逐步升高至236°C。脂肪酸以[M + NH3]+离子的形式分析，浓度通过标准曲线和同位素标记的内标物确定。
氨基酸和有机酸的靶向分析
50毫克的LV组织用液氮冷冻后研磨成粉末，用70%甲醇和羟胺（1摩尔/升）溶液在pH 7.6的条件下提取。以下内部和外部同位素标记的标准被添加到样本中：13C3-乳酸（400 nmol），13C3-丙酮酸（20 nmol），13C4-β-羟基丁酸（20 nmol），13C4-α-酮丁酸（1 nmol），D4-柠檬酸（20 nmol），13C4-α-酮戊二酸（20 nmol），D4-琥珀酸（20 nmol），D3-苹果酸（40 nmol），13C4-乙酰乙酸（20 nmol），13C4-富马酸（20 nmol），13C3-丙氨酸（150 nmol），13C2-甘氨酸（50 nmol），13C5-缬氨酸（20 nmol），13C6,15N-亮氨酸（10 nmol），13C6-异亮氨酸（10 nmol），13C5,15N-脯氨酸（5 nmol），13C5-甲硫氨酸（15 nmol），13C5,15N-丝氨酸（50 nmol），13C4,15N-苏氨酸（50 nmol），D5-苯丙氨酸（15 nmol），13C4,15N-天冬氨酸（100 nmol），13C5,15N-谷氨酸（400 nmol），13C6-精氨酸（150 nmol），13C9-酪氨酸（10 nmol），13C6-组氨酸（20 nmol），13C5,15N2-谷氨酰胺（400 nmol），13C4,15N2-天冬酰胺（15 nmol），13C11,15N2-色氨酸（5 nmol），13C3,15N-半胱氨酸（40 nmol），以及13C6,15N2-赖氨酸（50 nmol）。在超声处理浴中搅拌2分钟后，混合物中加入了氧化锆颗粒（直径2.8 mm，Omni International，肯纳索，GA），并使用Bead Ruptor进行匀质化。随后，使用盐酸（1 mol·L^-1）将混合物的pH值调整至5到6之间。样品在70°C下孵育15分钟，然后在22,000 g的离心力下离心10分钟。将上清液蒸发至接近干燥状态。样品用100%甲醇（2 mL）消化，用硫酸铵干燥，再用甲醇冲洗，此步骤重复两次。在7000 g的离心力下离心后，浓缩上清液，并将减少的体积转移到GC–MS小瓶中并干燥。干燥的样品在吡啶中溶解，加热至45°C持续90分钟，使用N-叔丁基二甲基硅基-N-甲基三氟乙酰胺在90°C下衍生化4小时，然后注入与5975 N质谱仪连接的Agilent 6890 N色谱仪中，质谱仪以电子离子化模式运行，载气为氦气，流速保持为7.7 mL·min^-1（分流比为5.6:1）。程序温度设置为150°C持续3分钟，然后以7°C·min^-1的速率升高至210°C，保持3分钟，再以7°C·min^-1的速率升高至310°C，保持5.5分钟，最后以40°C·min^-1的速率升高至320°C。根据m/z比率和保留时间鉴定代谢物，并使用内部和外部标准及标准曲线进行定量。基因表达分析。
总mRNA使用基于酸-胍-酚的Trizol™试剂（Invitrogen Canada Inc.，本顿维尔，安大略省，加拿大）通过两步法从组织中提取，随后使用Aurum™ total RNA Mini Kit（Bio-Rad，密西沙加，安大略省，加拿大）在柱子上进行固相纯化，以去除残留的污染物，如基因组DNA。逆转为cDNA的体积为20 μL，使用脱氧核苷三磷酸（dNTP）核苷酸和Moloney鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶（Invitrogen）在37°C下进行75分钟，然后在95°C下进行10分钟。样品体积用经过DEPC处理的水稀释1:10以去除RNases，并在-20°C下保存直至使用。实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）扩增在含有1 μL cDNA模板、每种特异性引物0.25 μL（20 μM储备液）和5 μL SsofastTM EvaGreen® Supermix（Bio-Rad Laboratories，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国）的10 μL反应混合物中进行，最终体积用蒸馏水调整。循环协议包括40个循环：首先在95°C下运行30秒，然后在60°C下运行90秒，最后在95°C下运行15秒，使用QuantStudio 5 RT PCR系统。相对mRNA表达水平使用比较循环阈值（Ct）方法确定。
从组织中提取总mRNA使用的是两步法，使用基于酸-胍-酚的Trizol™试剂（Invitrogen Canada Inc.，本顿维尔，安大略省，加拿大），然后在装有Aurum™ total RNA Mini Kit（Bio-Rad，密西沙加，安大略省，加拿大）的柱子上进行固相纯化，以去除残留的污染物，如基因组DNA。逆转录为cDNA的总体积为20 μL，使用脱氧核苷三磷酸（dNTP）核苷酸和Moloney鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶（Invitrogen）在37°C下进行75分钟，然后在95°C下进行10分钟。样品体积用经过DEPC处理的水稀释1:10以去除RNases，并在-20°C下保存直至使用。实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）扩增在含有1 μL cDNA模板、每种特定引物0.25 μL（20 μM储备液）和5 μL SsofastTM EvaGreen® Supermix（Bio-Rad Laboratories，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国）的10 μL反应混合物中进行，最终体积用蒸馏水调整。循环协议包括40个循环：首先在95°C下运行30秒，然后在60°C下运行90秒，最后在95°C下运行15秒，使用QuantStudio 5 RT PCR系统。相对mRNA表达水平使用比较循环阈值（Ct）方法确定。
2
−
Δ
Δ
C
t
$$ {2}^{-\Delta \Delta {C}_{\mathrm{t}} $$
使用内部参考基因进行标准化。引物序列列在表1和表2中。额外的引物组合（表2）用于确认qPCR结果。数据表示为相对于相应3小时和24小时假手术对照组的倍数变化。表1. 用于qPCR的小鼠引物序列。
表1. 小鼠qPCR引物序列。
引物
产物长度（bp）
NCBI基因ID
表2. 小鼠qPCR验证引物序列。
引物
产物长度（bp）
NCBI基因ID
Alox5
正向 GTCCTGAGGGATGGACGTGCAAAAT
反向 TGCCGTGCCTCCAGTTCTTTACG
89
11689
Alox12
正向 AGTGCGTTTGTGGCTGGTTGGG
反向 AAGTCAAACTCCTCCTCCTTGCCCC
90
11684
Alox15
正向 TGGGGCAACTGGAAGGATGGCA
反向 AACGGTGTCCATTGTCCCCAGAAC
138
11687
Cd36
正向 TGGAGCAACTGGTGGATGGTTTCC
149
12491
反向 CTACGTGGCCCGGTTCTACTAATTCA
106
12608
反向 GCGACAGCTGCTCCACCTTCTT
Hprt
正向 TCCTCCTCAGACCGCTTTTTGCC
80
15452
反向 CATCGCTAATCACGACGCTGGGA
Nfe2l2
正向 ACCATGAGTCGCTTGCCCTGGAT
80
18024
反向 TGCCAAACTTGCTCCATGTCCTGC
Ppara
正向 TTTGCTGTGGAGATCGGCCTGG
100
19013
反向 TGGTTGCTCTGCAGGTGGAGCTT
Ppard
正向 ACACACGCTTCCTTCCAGCAGC
138
19015
反向 TTGTCCCCGCACACCCGACATT
Pparg
正向 GCTGAACGTGAAGCCCATC
150
19016
反向 ACGTGCTCTGTGACGATCTG
Ppia
正向 AGACTGAATGGCTGGATGGCAAGC
98
268373
反向 GCCATTCCTGGACCCAAAACGCT
表2. 小鼠qPCR验证引物序列。
引物
产物长度（bp）
NCBI基因ID
Alox5
正向 CAGGGTCAAGAAGTTGGTGG
反向 CCGTGTAGGAGGGCATGACT
99
11689
Alox12
正向 GGAGAGGGAATCCTGAGCC
反向 GTGGCCCAGCAGTAGGT
125
11684
Hprt
正向 TTGGATACAGGCCAGACTTTGT
153
15452
反向 TGCGCTCATCTTAGGCTTTGT
Ppard
正向 ATGAAGACAAACCCACGGTAAAG
118
19015
反向 CTGTGGCTGTTCCATGACTGAC
统计分析
分析使用GraphPad Prism（版本10.4.2；圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）进行。数据以平均值±标准误（SEM）表示。使用Statistics Kingdom（www.statskingdom.com）评估数据的正态性和方差的同质性。当需要满足统计测试的假设时，对对数转换后的数据进行进行分析。组间比较使用Student的t检验或双向ANOVA，以时间和处理为因素，随后进行Fisher的最小显著差异（LSD）事后检验进行多重比较。当处理×时间的交互作用显著时，在每个时间点评估简单效应。使用Grubbs检验评估潜在的异常值。P值<0.05（α=0.05）的数据从后续分析中排除，如图所示。统计显著性定义为P<0.05。结果和讨论。
Azapeptide MPE-298在心肌缺血和再灌注后减少左心室损伤
最初通过在再灌注前短时间内给予单次静脉注射来研究azapeptide MPE-298的心脏保护作用。假设azapeptide MPE-298通过CD36依赖的方式起作用，因此将Cd36+/+和Cd36−/−小鼠分别暴露于LCAL和24小时的再灌注中以评估心肌损伤。在再灌注前10分钟，小鼠接受 vehicle（0.9% NaCl）或azapeptide MPE-298（3 μmol·kg^-1）的静脉注射（图1A）。选择的剂量基于之前的剂量-反应实验，这些实验显示剂量依赖性的梗死面积减少[[30]]。相对于LV的AAR (area-at-risk) 使用面积加权方法测量，在不同基因型和处理组中一致，平均为47%。这种统一的AAR表明所有动物经历了类似的缺血损伤，并证明了实验的可重复性（图1B,C）。大约50%的LV AAR表明结扎部位位于LAD的近端，从而产生了较大的缺血区域。在Cd36+/+小鼠中，MPE-298处理显著减少了IA (infarct area) 相对于LV，从vehicle处理的小鼠的16.2 ± 1.4%降低到MPE-298处理的小鼠的9.4 ± 0.6%（P<0.01；图1B）。当表示为IA相对于AAR时，MPE-298处理减少了44%，从35.9 ± 3.3%降低到20.0 ± 1.5%（P<0.001；图1B）。这些发现与预期的一致，即坏死性梗死发生在AAR内，其中包含存活和坏死的心肌。相比之下，在Cd36−/−小鼠中没有观察到显著的IA减少（图1C），表明MPE-298的心脏保护作用是CD36依赖的。这种保护作用在代表性的TTC染色的中室切片中进一步得到证实，其中MPE-298处理的Cd36+/+小鼠显示出明显的较小梗死区域（白色区域），与vehicle处理的 mice或未经处理的Cd36−/−小鼠相比（图1D）。这些图像是定性的，用于补充定量梗死面积分析。
MPE-298处理减少了心肌缺血和再灌注后Cd36+/+小鼠的梗死面积（MI/R）（A）实验时间线：小鼠接受LCAL 30分钟，随后进行再灌注并在3小时和24小时进行监测。在再灌注前10分钟，通过静脉注射azapeptide MPE-298（3 μmol·kg^-1）或vehicle（0.9% NaCl）。（B, C）在MI/R后24小时量化心肌梗死面积。条形图和点图显示AAR/LV（左图）作为LV面积的百分比；IA/LV（中图）作为LV面积的百分比；IA/AAR（右图）作为AAR的百分比，在Cd36+/+小鼠（n=11/组）和Cd36−/−小鼠（n=5/组）中。（D）代表性的TTC-和Evans blue染色的中室横截面，显示AAR（红色和白色）、梗死组织（白色）和非缺血组织（蓝色）在再灌注后24小时的情况。数据为平均值±标准误（SEM）。***P<0.001，非配对t检验。刻度尺，1 mm。风险区域，AAR；梗死面积，IA；LCAL，左冠状动脉结扎；LV，左心室。在再灌注前短时间内给予单次剂量的azapeptide MPE-298提供了对LV损伤的急性保护，这种保护是CD36依赖的。在早期的研究中，使用非选择性的线性CD36配体EP 80317或在30分钟缺血期前每天给予选择性的线性azapeptide CP-3(iv)（剂量为0.3至1 μmol·kg^-1）处理14天，分别将IA相对于LV的面积减少了34%和56%[[11, 30]]。这种LV损伤的减轻主要归因于心肌脂质负担的减少，这与由于脂解降低而导致的血浆NEFA水平暂时降低有关[[11]]。CP-3(iv)处理的小鼠还表现出脂肪组织中脂联素的表达增加以及循环中的脂联素水平升高[[30]]。此外，在再灌注前10分钟给予CP-3(iv)在最高剂量（1 μmol·kg^-1）下，与vehicle处理的Cd36+/+小鼠相比，将IA相对于LV的面积减少了44%。Azapeptide MPE-298减少了心肌缺血和再灌注后LV中的LCFA积累。
细胞对LCFA的摄取主要由细胞膜（肌膜）上的CD36调控[[31]]。因此，在再灌注后检查了azapeptide MPE-298对FA组成和丰度的影响。MI后，可挽救的缺血 myocardium的再灌注导致FA摄取和氧化的快速恢复[[10]]。LCFA β-氧化的早期增加破坏了葡萄糖和FA氧化作为腺苷三磷酸（ATP）生产竞争来源的平衡[[32]]。β-氧化的优先性需要更多的氧气来生产ATP，这导致过多的氢离子产生，进而导致离子不平衡，从而降低心脏效率[[33]]。再灌注后早期LCFA摄取的暂时抑制可能保护心脏免受再灌注后的有害氧化应激，并改善收缩恢复。与此假设一致的是，使用[18F]-标记的氟-6-十七烷酸作为示踪剂，通过μPET（正电子发射断层扫描）显示，预先用GHRP肽EP 80317处理的小鼠在再灌注后6小时表现出心肌FA摄取减少[[11]]。在酯化为甲基酯（FAMES）后对FA进行了靶向分析。对LV的分析显示，在再灌注后3小时，接受单次静脉注射azapeptide MPE-298的小鼠与vehicle处理的对照组相比，某些LCFA的种类出现了暂时的减少。在所有饱和度类别的FA中都观察到了减少：饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA，热图图2A）。与vehicle处理的小鼠相比，显著减少了SFA [肉豆蔻酸、十五碳酸和棕榈酸（图2B–D）]、MUFA [棕榈油酸、油酸和油酸（图2E–G）和PUFA [亚油酸、二十二碳六烯酸（ETE）和二十二碳六烯酸（DHA）（图2H–J）]的相对丰度。二十二碳五烯酸（DPA）和亚油酸（图2K,L）的减少趋势较为温和。长期以来，SFA被认为对心血管健康有害，饮食建议限制其摄入量。尽管总SFA浓度的升高与更高的心血管风险有关，但进一步的研究表明，不同的SFA亚型表现不一，有些与更高的风险相关，而有些则表现出相反的关系[[34]]。虽然SFA和某些MUFA的长期健康影响仍有争议，但PUFA的好处通常得到了更广泛的支持[[35]]LCFA（长链脂肪酸）；LV（左心室）；MUFA（单不饱和脂肪酸）；PUFA（多不饱和脂肪酸）；SFA（饱和脂肪酸）。值得注意的是，在接受空白处理的小鼠中，SFA、MUFA和亚油酸的水平在3小时到24小时之间有所下降，这表明LCFA的吸收高峰主要发生在再灌注的早期阶段，与先前的研究结果一致[[37]]。总之，azapeptide MPE-298能够暂时降低心肌梗死/再灌注（MI/R）小鼠左心室中的LCFA含量，而与脂肪酸的饱和状态无关。先前使用CD36配体EP80317处理的小鼠的研究表明，在MI/R后6小时，外周脂肪分解受到暂时抑制，导致循环中的NEFA水平降低[[14]]。在本研究中，血浆NEFA水平在3小时时略有下降，但并无显著差异，而血浆肌钙蛋白水平保持不变（空白处理组为1.70±0.44 mmol·L^-1，每组3只小鼠）。与我们的早期研究结果一致，脂肪分解的减少与心脏脂肪酸负担的减轻有关，这一发现促使我们评估附睾脂肪中的脂肪分解标志物。azapeptide MPE-298改变了心肌梗死后再灌注期间附睾脂肪组织中与脂肪分解相关基因的表达。
脂肪分解在心肌梗死/再灌注（MI/R）引起的氧化应激和炎症反应中会急性激活[[38]]。转录因子核因子红系衍生2样2（Nfe2l2），也称为Nrf2（但与核呼吸因子2不同），是细胞抗氧化防御机制的关键调节因子，这些机制会在细胞应激（如MI/R损伤期间）被激活[[39]]。当血流恢复时，线粒体电子传输链的突然重新激活成为ROS的主要来源，此外黄嘌呤氧化酶和NADPH氧化酶（NOX）进一步加剧了再灌注引起的氧化应激。然而，早期激活Nfe2l2已被证明会通过增强心脏炎症、促进促炎细胞因子的释放以及使巨噬细胞向促炎M1表型转变而加重MI/R损伤[[40]]。与此一致的是，接受单剂azapeptide MPE-298（3 μmol·kg^-1）处理的小鼠在再灌注后3小时，附睾脂肪组织中的Nfe2l2基因表达暂时减少（图3A），其下游目标基因（包括CCAAT/增强子结合蛋白β（Cebpβ）[[41]]和CD36[[42]]的表达也相应减少（图3B,C）。转录因子C/EBPβ也被发现可以上调CD36的mRNA表达[[43]]。在3T3-L1脂肪细胞中敲低CD36表达会导致脂肪分解活性降低以及关键脂肪分解酶（包括激素敏感性脂肪酶和过氧化脂质蛋白）的磷酸化减少[[44]]。CD36在脂肪组织中的功能重要性还得到了CD36抑制剂sulfo-n-succinimidyl oleate处理后脂肪分解减少的支持[[44]]。值得注意的是，在24小时时，空白处理组小鼠的Nfe2l2表达相比3小时时没有显著变化，而其下游目标基因在空白处理组中有所下降，但在处理后保持不变（图3A–C）。使用线性azapeptide CP-3(iv)（0.3 μmol·kg^-1）进行的14天预处理在再灌注后6小时使附睾脂肪中的Nfe2l2、Cebpβ和CD36表达短暂增加[[30]]。与本研究中使用的单次给药不同，这种延长暴露可能会解释不同的转录反应。然而，除了给药时间和方案外，采样时间以及给药剂量也可能导致这些观察结果。图3（在图形查看器中打开）
azapeptide MPE-298的处理减少了心肌梗死/再灌注后参与代谢和炎症途径的基因表达。小鼠在再灌注前10分钟通过静脉注射接受0.9% NaCl或MPE-298（3 μmol·kg^-1）处理，并在再灌注后3小时和24小时进行监测。条形图显示了脂肪组织中的相对mRNA水平：(A) Nfe2l2，(B) Cebpβ和(C) Cd36，以及左心室中的(D) Pparα，(E) Pparδ，(F) Pparγ，(G) Alox5，(H) Alox12和(I) Alox15。数据以5-8只小鼠的平均值±SEM表示。统计分析使用双向ANOVA进行，以处理和时间作为独立变量，随后进行了Fisher的事后检验。使用Grubbs检验识别异常值（红点）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。MI/R表示心肌梗死/再灌注。LCFA是过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）亚类的内源性配体，其中PPARα在心脏中的表达最为丰富[[45]]。PPARα在调节线粒体脂肪酸β-氧化中起关键作用，同时降低心肌细胞中的葡萄糖利用[[45]]。我们的结果与MI/R触发早期炎症和心肌ROS，从而导致心肌中PPARα表达增加的序列相符。在再灌注的早期阶段暂时降低PPARα（以及可能的PPARδ）表达可能是有利的，因为过早增强β-氧化可能会损害心脏功能。然而，在后期阶段，PPARα信号通路有助于代谢恢复。相比之下，据报道PPARγ激动剂在MI/R模型中具有心脏保护作用，支持PPARγ作为调节抗氧化和抗炎反应的关键转录因子的作用，同时改善心肌能量代谢[[46, 47]]。MPE-298的处理显示PPARγ表达增加（图3F），表明可能对炎症缓解和心脏保护具有潜在益处。动物模型研究表明，心肌梗死/再灌注会导致心肌中白三烯的产生增加[[48]]。越来越多的证据表明，来自5-脂氧合酶（5-LO）途径的代谢物对心肌功能恢复有负面影响[[49]]。先前发现，使用EP80317预处理可以选择性地下调Alox5基因表达并降低短暂骨骼缺血-再灌注小鼠肺中的白三烯B4（LTB4）水平，表明其具有调节炎症反应的潜力[[49]]。注意到在再灌注后3小时，左心室中的LCFA（花生四烯酸）水平暂时下降（图2H），我们研究了azapeptide MPE-298对MI/R后Alox5 mRNA水平的影响。azapeptide处理导致小鼠左心室中Alox5 mRNA表达暂时减少（图3G），但对Alox12（图3H）和Alox15（图3I）的mRNA水平没有显著影响。在MI/R的早期响应中，Alox5的代谢物可能会起到一些作用，但这些作用在azapeptide处理后被暂时抑制。先前研究表明，LTB4是一种炎症的脂质介质，是PPARα的内源性配体[[50]]。再灌注后3小时Alox5表达的减少可能会暂时抑制PPARα的激活。ALOX5、CD36和PPARα之间的机制联系需要在MI/R损伤的背景下进一步研究。
在缺血后的再灌注早期阶段，我们观察到接受MPE-298处理的小鼠左心室中的LCFA水平明显降低（图2）。先前研究表明，再灌注后心脏的能量代谢趋向于更多地依赖葡萄糖[[37]]，并且某些氨基酸可能会发生回补作用[[51]]。除了在MI/R损伤中作为代谢底物外，某些氨基酸还可能发挥更广泛的作用，例如调节细胞对压力的反应。研究了azapeptide MPE-298对MI/R小鼠左心室中氨基酸和三羧酸（TCA）循环中间体水平的影响（热图图4A,B）。在TCA代谢物中，血浆中的2-羟基戊二酸、延胡索酸和苹果酸水平与心血管风险增加有关[[52]]；值得注意的是，这些中间体在MPE-298处理组中的相对水平趋于下降（图4B）。谷氨酸（图4D）和脯氨酸（图4E）可以通过转氨作用转化为α-酮戊二酸，从而为TCA循环提供燃料[[53]]。谷氨酸（图4D）和脯氨酸（图4E）也可以促进α-酮戊二酸的生成[[55]]。谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸是谷胱甘肽合成的成分，谷胱甘肽是一种强效的细胞内抗氧化剂[[56]]。在再灌注后3小时接受azapeptide MPE-298处理的小鼠左心室中，谷氨酸和半胱氨酸水平暂时下降，谷氨酸、脯氨酸和甘氨酸均显示出轻微的下降趋势（图4E–G）。此外，在MPE-298处理组中，芳香族氨基酸酪氨酸（图4H）和苯丙氨酸（图4I）在3小时和24小时时也有所下降。尽管酪氨酸和苯丙氨酸通过芳香环羟基化途径代谢可能导致TCA中间体延胡索酸的形成[[57]]，但后者的水平没有显著变化（图4B）。氨基酸除了参与能量代谢外，还参与蛋白质合成、生化反应中的辅因子以及信号传导中间体[[58]]。例如，观察到左心室中丙氨酸水平有所下降（图4J）。丙氨酸通过转氨作用生成丙酮酸[[51]]，但在MPE-298处理组和空白处理组之间，丙酮酸（图4K）和乳酸（图4L）的水平没有显著差异，表明在再灌注早期这一代谢途径几乎没有受到干扰。需要进一步的研究来确定这些轻微变化在不同时间点对MPE-298反应的贡献。图4（在图形查看器中打开）
单剂azapeptide MPE-298（3 μmol·kg^-1）在再灌注前给药，在接受30分钟暂时左冠状动脉结扎（LCAL）处理的小鼠中，导致再灌注后3小时和24小时左心室中特定氨基酸含量暂时降低。热图显示了相对于对照组的倍数变化：(A) 氨基酸和(B) 三羧酸（TCA）中间体在再灌注后3小时和24小时的左心室中的变化。条形图表示特定氨基酸和代谢物的相对含量：(C) 谷氨酸，(D) 谷氨酰胺，(E) 脯氨酸，(F) 半胱氨酸 (G) 甘氨酸 (H) 酪氨酸，(I) 苯丙氨酸，(J) 丙氨酸，(K) 丙酮酸，(L) 乳酸，(M) 亮氨酸和(N) 异亮氨酸。数据以4-5只小鼠的平均值±SEM表示。统计分析使用双向ANOVA进行，以处理和时间作为独立变量，随后进行了Fisher的事后检验。使用Grubbs检验识别异常值（红点）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。αKG表示α-酮戊二酸。支链氨基酸（BCAA）亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸是必需的，必须通过饮食获得。它们对正常心脏能量产生的贡献很小，但MI/R会损害它们的分解代谢，导致BCAA积累，扰乱心脏代谢平衡和应激[[59, 60]]。尽管在再灌注后3小时，空白处理组和MPE-298组之间BCAA含量没有显著差异（图4M,N），但到24小时时，亮氨酸和异亮氨酸的水平均下降，表明它们在关键的早期再灌注时期可能在心肌代谢中起作用。本研究的局限性在于仅检查了再灌注后的两个时间点，且仅使用了雄性动物。尽管如此，在再灌注前给予单剂azapeptide MPE-298后仍观察到了心脏保护效果。研究表明，azapeptide治疗对心肌代谢有早期有益影响，特别是减少了MI/R后的LCFA。对心肌代谢的有益效果与早期使用CD36配体处理的研究结果一致，后者分别降低了循环中的NEFA水平和脂联素水平，并增加了脂肪组织中的脂联素表达[[11, 30]]。选择性针对CD36的治疗显示出额外的治疗效益[[30]]。总之，我们的发现表明MPE-298可能通过调节心脏底物代谢和炎症信号通路来介导MI/R后的心脏保护作用。具体而言，靶向FAMES分析显示左心室中LCFA的积累暂时且早期减少，这与促进FAO的PPARα/PPARδ表达的暂时下降趋势相符。相比之下，PPARγ在左心室中的表达暂时增加，与其在抑制促炎途径和改善心肌能量代谢中的作用一致。此外，我们还观察到Alox5表达的减少，进一步支持了MPE-298的抗炎作用。我们的研究首次描述了MPE-298处理小鼠在再灌注期间的氨基酸变化，揭示了包括参与能量生产和抗氧化防御的氨基酸在内的轻微但显著的改变。在24小时时，左心室中BCAA水平的相对降低可能代表了未来研究中值得探索的次要代谢效应。
单剂azapeptide MPE-298（3 μmol·kg^-1）在再灌注前给药，在接受短暂左冠状动脉结扎（LCAL）30分钟的小鼠中，导致再灌注后3小时和24小时左心室中特定氨基酸含量暂时减少。热图显示了与相应对照组相比的变化倍数：(A) 氨基酸和(B) 三羧酸（TCA）中间体在再灌注后3小时和24小时的左心室中的变化。条形图表示特定氨基酸和代谢物的相对含量：(C) 谷氨酸，(D) 谷氨酰胺，(E) 脯氨酸，(F) 半胱氨酸 (G) 甘氨酸 (H) 酪氨酸，(I) 苯丙氨酸，(J) 丙氨酸，(K) 丙酮酸，(L) 乳酸，(M) 亮氨酸和(N) 异亮氨酸。数据以4-5只小鼠的平均值±SEM表示。统计分析使用双向ANOVA进行，以处理和时间作为独立变量，随后进行了Fisher的事后检验。使用Grubbs检验识别异常值（红点）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。αKG表示α-酮戊二酸。支链氨基酸（BCAA）亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸是必需的，必须通过饮食获得。它们对正常心脏能量产生的贡献很小，但MI/R会损害它们的分解代谢，导致BCAA积累，扰乱心脏代谢平衡和应激 [[59, 60]]。尽管在再灌注后3小时，空白处理组和MPE-298组之间BCAA含量没有显著差异（图4M,N），但到24小时时，亮氨酸和异亮氨酸的水平均下降，表明它们在关键的早期再灌注时期可能在心肌代谢中起作用。本研究的局限性在于仅检查了再灌注后的两个时间点，且仅使用了雄性动物。尽管如此，在再灌注前给予单剂azapeptide MPE-298后仍观察到了心脏保护效果。研究表明，azapeptide治疗对心肌代谢有早期有益影响，特别是减少了MI/R后的LCFA。这些有益效果与先前使用CD36配体处理的研究结果一致，后者分别降低了循环中的NEFA水平和脂联素水平，并增加了脂肪组织中的脂联素表达[[11, 30]]。选择性靶向CD36显示出额外的治疗效益[[30]]。总之，我们的发现表明MPE-298可能通过调节心脏底物代谢和炎症信号通路来介导MI/R后的心脏保护作用。具体来说，靶向FAMES分析显示左心室中LCFA的积累暂时且早期减少，这与促进FAO的PPARα/PPARδ表达的暂时下降趋势相符。相比之下，PPARγ在左心室中的表达暂时增加，与其在抑制促炎途径和改善心肌能量代谢中的作用一致。此外，我们还观察到Alox5表达的减少，进一步支持了MPE-298的抗炎作用。我们的研究首次描述了MPE-298处理小鼠在再灌注期间的氨基酸变化，揭示了包括参与能量生产和抗氧化防御的氨基酸在内的轻微但显著的改变。在24小时时，左心室中BCAA水平的相对降低可能代表了未来研究中值得探索的次要代谢效应。总的来说，这些结果表明MPE-298可能通过暂时调节再灌注早期的代谢和炎症通路来保护心肌。
本研究得到了加拿大卫生研究院（PJT-178227）、加拿大心脏和中风基金会（G-18-0022167）、Mperia Therapeutics Inc.的教育资助、加拿大自然科学与工程研究委员会的发现基金（编号：04079、04423和06647）以及魁北克研究与技术中心（FRQNT-2020-RS4-265155-CCVC）的支持。JG获得了魁北克研究基金（FRQS）的奖学金。作者声明没有利益冲突。作者贡献
SM构思并设计了实验。S-PG、SM和HO监督了整个研究过程。WDL和AA提供了所需资源。JG、NR、LM、MV和DNH负责执行实验并分析数据。CD和MR进行了气相色谱-质谱（GC–MS）分析，并提供了相应的结果。S-PG、SM和WDL共同撰写了手稿。WDL对手稿进行了编辑工作。ACC、HO、DNH、LM、NR和JG参与了手稿的修订。S.M.和S.-P.G.担任该论文的共同资深作者。本文的同行评审信息可访问以下网址：https://www.webofscience.com/api/gateway/wos/peer-review/10.1002/2211-5463.70265。
数据可访问性
如需获取本手稿中报告的所有实验数据，可联系相应作者，在合理请求的情况下获取相关数据。
