免疫调节在各种疾病的发病机制和治疗中都至关重要。植物源细胞外囊泡样颗粒 (PDEVLPs)，特别是来自草药的PDEVLPs，因其固有的生物活性成分，正成为具有前景的、用于免疫调节的跨物种纳米治疗载体。与传统小分子药物相比，这些天然纳米载体在哺乳动物系统中具有更优越的药代动力学特性，包括增强的靶向能力、更高的渗透效率以及更长的循环时间。由于其生物源性结构和低免疫原性，大多数PDEVLPs通常表现出良好的生物相容性，并在特定情况下具有显著优势。然而，与脂质体等成熟平台相比，其在人体内的免疫学特征，特别是异源植物蛋白的免疫原性风险，尚需进一步研究。多种活性成分赋予PDEVLPs有效调节多种免疫细胞的能力，它们有助于维持机体稳态，并为治疗多因素炎症和免疫相关疾病提供了显著潜力。本综述审视了疾病特异性的免疫微环境，为选择基于PDEVLP的疗法提供理论基础。同时评估了旨在增强这些跨界介导物的靶向递送和治疗效果的工程策略。通过总结最新进展，本综述旨在指导开发针对特定微环境量身定制的下一代免疫调控载体。
引言
细胞外囊泡 (EVs) 是细胞自然释放到胞外空间的脂质双层纳米囊泡。尽管EVs缺乏功能性细胞核且不能进行有丝分裂，但它们在细胞间通讯、物质交换、遗传物质传递和蛋白质运输中起着关键作用。因此，EVs参与了许多生理和病理过程。EVs的3个主要亚型是外泌体、微囊泡和凋亡小体。这些囊泡在治疗一系列疾病方面显示出相当大的治疗潜力，包括心血管、神经、肝脏、肾脏疾病以及各种癌症。最近，来自天然草药的EVs因其具有前景的免疫调节特性而受到显著关注。
天然药物是加工最少的药用植物，保留了其化学成分，其生物活性化合物浓度高于干草药。新鲜草药的化学成分通常比加工后的草药更丰富、更强效，这突出了这些植物的治疗价值。然而，保存草药材料完整性的挑战限制了其临床应用。冷冻干燥、真空加工和草药制剂等保存技术的进步正在逐渐克服这些障碍，使得草药疗法在临床应用中更具可行性。研究表明，从草药中提取的囊泡具有多种功能。例如，人参来源的EV样颗粒 (PGN-DEVLPs) 被发现可诱导巨噬细胞从M2样亚型向M1样亚型极化，从而抑制肿瘤进展。其他植物来源的EV样颗粒 (PDEVLPs) 具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤和调节胰岛素抵抗的作用。这些囊泡具有高吸收性，并表现出显著的生物安全性，在多种疾病中具有广泛的治疗潜力。此外，许多草药来源的EV仍有待探索，为未来的治疗开发提供了巨大的未开发资源。
PDEVLPs的分离、提取、纯化和表征
PDEVLPs是脂质双层纳米囊泡，直径通常在30至200 nm之间。与哺乳动物来源的EVs相似，PDEVLPs的制备通常涉及样品预处理、粗分离、精细纯化和多维表征。然而，由于植物细胞壁的复杂结构以及存在丰富的多糖和次级代谢物，尚未建立完全标准化的PDEVLP分离技术流程。
样品预处理和组织破碎
在分离PDEVLPs之前，新鲜植物材料（如根、茎、叶或压榨汁液）必须进行机械破碎或匀浆，以释放细胞内含物，同时尽量减少可能产生人工囊泡样结构的过度破碎。常用方法包括液氮研磨、机械匀浆或手动研磨。这些步骤通常伴随用冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤，以减少污染杂质。对于根茎或富含多糖的组织，如黄精和麦冬，可使用纤维素酶和/或果胶酶进行酶预处理以促进囊泡释放。随后的低速离心用于去除大碎片和未破裂的组织片段。
低速和差速离心粗分离
匀浆后，常用差速离心法顺序去除大颗粒和细胞碎片。典型方案包括：（a）低速离心去除碎片：500至5,000g10至30分钟，以消除细胞碎片、细胞核和大颗粒；（b）中速离心去除大囊泡：10,000至20,000g20至40分钟，以排除大囊泡和微囊泡；（c）超速离心沉淀PDEVLPs：≥100,000g≥60分钟，以沉淀尺寸在30至200 nm范围内的囊泡。这种差速超速离心步骤代表了初步富集植物来源EV的核心程序，并被广泛用作基线分离方法。然而，它可能导致非囊泡颗粒的共沉淀，且纯度相对较低。
密度梯度超速离心纯化
为了进一步提高PDEVLPs的纯度，经常使用密度梯度超速离心 (DGU)。该方法根据囊泡在密度介质中浮力密度和沉降行为的差异进行分离。常用介质包括蔗糖和碘克沙醇梯度。制备逐步或连续梯度，并在约100,000g下离心2至4小时。离心后，可观察到不同的密度条带，PDEVLPs通常在特定密度范围内富集。与单独的差速离心相比，DGU显著提高了囊泡的纯度和结构完整性。然而，该方法耗时、技术要求高，且产量较低。因此，它特别适用于需要高纯度的下游应用，如功能验证或组学分析。
尺寸排阻色谱和其他辅助纯化方法
作为超速离心和DGU的补充方法，尺寸排阻色谱 (SEC) 可用于进一步去除蛋白质聚集体和非囊泡污染物，从而提高PDEVLPs的最终纯度。SEC根据尺寸差异导致的洗脱时间差异分离颗粒，被认为是一种温和的方法，能更好地保持囊泡的结构完整性。SEC与超速离心或密度梯度纯化相结合已被证明可显著改善纯化效果。此外，一些研究使用聚合物沉淀法，如聚乙二醇沉淀，用于囊泡富集。这些方法简单，适合处理大量样品，但通常纯度较低，因此常与其他纯化策略结合使用。
表征和质量控制
分离后，应使用多种分析技术对PDEVLPs进行全面表征以确保提取质量：（a）纳米颗粒跟踪分析：用于确定粒径分布和浓度，同时确认PDEVLPs的预期尺寸范围和稳定性；（b）透射电子显微镜或冷冻电子显微镜：能够观察囊泡形态，包括脂质双层结构和特征性的杯状外观，是成功分离的关键证据；（c）蛋白质分析和标志物检测：使用蛋白质印迹或蛋白质组学分析检测典型的EV相关蛋白，如热休克蛋白70 (HSP70) 和甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以及植物EV相关标志物，如TET8和PEN1，以验证囊泡身份；（d）核酸和脂质货物分析：使用RNA测序和液相色谱-质谱等技术表征其RNA和脂质谱，从而评估PDEVLPs内的内源性功能货物。
PDEVLPs与免疫调节
PDEVLPs通过协同机制调节免疫细胞，包括调节免疫细胞功能和改变细胞极化。这些囊泡在体内与各种类型的免疫细胞相互作用，启动多方面的免疫反应，有助于恢复免疫平衡。例如，PGN-DEVLPs通过核因子κB (NF-κB) 通路激活树突状细胞 (DCs)，促进T淋巴细胞增殖，并增强自然杀伤 (NK) 细胞的细胞毒性活性，从而影响肿瘤微环境 (TME)。PDEVLPs的功能多样性突出了它们作为免疫治疗有希望的候选者的潜力。
巨噬细胞的调节
巨噬细胞是先天免疫的关键参与者，执行吞噬、病原体清除和炎症反应调节等功能。大多数PDEVLPs已被证明可以调节巨噬细胞极化，特别是向抗炎的M2样表型，减少炎症因子的分泌，增加抗炎细胞因子的产生，从而减轻炎症。PDEVLPs通过递送草药中的生物活性成分（如多糖、类黄酮和生物碱）来实现这一点，这些成分影响巨噬细胞的可塑性。例如，蛹虫草来源的EV样颗粒 (CM-DEVLPs) 通过增强巨噬细胞吞噬作用和增加外周血免疫细胞计数，保护小鼠免受环磷酰胺诱导的免疫抑制。CM-DEVLPs还通过激活丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信号通路促进M0和M2样巨噬细胞向M1样表型极化。值得注意的是，CM-DEVLPs通过重编程肿瘤相关巨噬细胞和激活肿瘤浸润T淋巴细胞来抑制肿瘤生长，且在荷瘤小鼠中不引起毒性。姜黄来源的EV样颗粒 (T-DEVLPs) 降低了脂多糖刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞中炎症细胞因子的表达，并促进M2样巨噬细胞分化，减轻炎症。PGN-DEVLPs通过将M2样巨噬细胞转变为M1样表型、增加活性氧 (ROS) 产生和黑色素瘤细胞凋亡、以及增强肿瘤组织中M1样巨噬细胞浸润来调节肿瘤免疫抑制微环境。这种M1样极化是通过Toll样受体4 (TLR4) 和髓样分化因子88 (MyD88) 信号通路介导的，PGN-DEVLPs中的神经酰胺脂质和蛋白质发挥了显著作用。此外，PGN-DEVLPs可以穿过血脑屏障 (BBB) 并在胶质瘤模型中调节TME。它们增加CD8+T淋巴细胞浸润，减少CD4+T淋巴细胞和调节性T细胞 (Tregs)，并促进M1样巨噬细胞浸润，有助于抗胶质瘤免疫反应。姜根茎来源的EV样颗粒 (GRE-DEVLPs) 也通过上调白细胞介素-10 (IL-10) 和血红素加氧酶-1 (HO-1) 的表达来调节巨噬细胞活性。核因子E2相关因子2 (Nrf2) 转录因子的激活在这种抗炎作用中起着关键作用，GRE-DEVLPs增强了THP-1来源的人巨噬细胞中Nrf2的核转位。GRE-DEVLPs通过增加IL-10水平同时诱导IL-6产生，帮助维持肠道免疫稳态。长春花来源的EV样颗粒 (CR-DEVLPs) 增强肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 分泌并激活NF-κB通路。CR-DEVLPs还上调造血相关转录因子PU.1，促进巨噬细胞吞噬作用和淋巴细胞增殖。当腹腔给药时，CR-DEVLPs优先定位于免疫器官，在那里被造血干细胞摄取，进一步激活免疫反应。大蒜来源的EV样颗粒 (ASM-DEVLPs) 通过调节miR-396e，重编程巨噬细胞代谢，调节PFKFB3表达，减轻肥胖小鼠巨噬细胞-脂肪细胞串扰期间的脂肪细胞炎症。兴安升麻来源的EV样颗粒通过TLR4–MyD88–TAK1–NF-κB通路将M2样巨噬细胞重新极化为M1样表型，从而增强骨髓瘤细胞的凋亡。梅子来源的EV样颗粒 (PM-DEVLPs) 通过特异性积聚在发炎的结肠组织中减轻实验性结肠炎。巨噬细胞主要摄取PM-DEVLPs，消耗研究证实了它们在介导抗结肠炎作用中的关键作用。PM-DEVLPs抑制NOD样受体家族pyrin结构域包含蛋白3 (NLRP3) 炎症小体的激活，选择性抑制caspase-1的自剪切和IL-1β的分泌。RNA测序确定PM-DEVLPs内的miR-159是介导这些作用的关键成分，抑制NLRP3炎症小体激活，有助于抗结肠炎反应。
树突状细胞的调节
树突状细胞 (DCs) 是激活T淋巴细胞和调节免疫反应的关键抗原呈递细胞。PDEVLPs可以促进DCs的成熟，增强其抗原呈递能力，刺激T淋巴细胞的活化，并抑制肿瘤生长。例如，蜂斗菜来源的EV样颗粒 (PJ-DEVLPs) 通过上调CD80/86和主要组织相容性复合物I/II类 (MHC-I/II) 等表面标志物来增强DC成熟，从而通过MAPK和NF-κB信号通路促进1型T辅助细胞 (Th1) 极化细胞因子如TNF-α的产生，这导致Th1极化和CD8+T细胞的激活，促进抗癌免疫。
自然杀伤细胞的调节
自然杀伤 (NK) 细胞是先天免疫系统的重要组成部分。它们对肿瘤细胞和病毒感染细胞表现出直接的细胞毒性。PDEVLPs可以增强NK细胞介导的抗肿瘤免疫，这与巨噬细胞、T淋巴细胞和DCs的调节间接相关。例如，黄芩来源的EV样颗粒和半枝莲来源的EV样颗粒都可以激活NK细胞以抑制肿瘤细胞。
T淋巴细胞的调节
T淋巴细胞是适应性免疫的核心，在消除感染或恶性细胞中起关键作用。PDEVLPs调节T淋巴细胞的活化、分化和增殖。例如，芹菜来源的EV样颗粒通过调节T细胞和外周血单个核细胞的免疫活性来影响T细胞反应。此外，PGN-DEVLPs与抗程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1) 单克隆抗体 (mAb) 的联合应用通过重塑免疫抑制性TME来增强抗肿瘤免疫。PGN-DEVLPs通过增加CD8+T细胞向肿瘤部位的募集，促进肿瘤浸润T淋巴细胞的活化并重编程肿瘤相关巨噬细胞。这种与PD-1 mAb疗法的协同方法提高了抗肿瘤疗效，且无全身毒性。此外，PGN-DEVLPs通过雷帕霉素机制靶点 (mTOR)–T-bet轴调节巨噬细胞功能，减轻TME中的T细胞耗竭。
B淋巴细胞的调节
B淋巴细胞通过产生抗体来介导体液免疫。PDEVLPs调节B淋巴细胞的活化和抗体的分泌，优化体液免疫反应。例如，GRE-DEVLPs中的miRNA和其他生物活性成分调节B淋巴细胞分化和抗体产生，改善机体对病原体的免疫反应。GRE-DEVLPs中的小分子化合物，如6-姜酚，也有助于其抗炎和免疫调节作用。
炎症因子和趋化因子的调节
来自大蒜和葱的PDEVLPs在体外表现出促角质形成细胞分化和抗炎作用，且无明显细胞毒性。这些颗粒抑制NF-κB激活，并通过激活NRF2通路减少TNF-α和IL-6等炎症细胞因子的释放。NRF2激活上调HMOX1和NQO1等抗氧化基因，增强细胞抗氧化能力并促进ROS清除。此外，NRF2抑制IL-17信号通路，下调IL-17靶基因并抑制NF-κB介导的炎症。NRF2敲低验证了该机制的特异性。动物研究也表明，桔梗来源的EV样颗粒 (PG-DEVLPs) 改善了LPS诱导的肺部炎症并减少了促炎因子。它们促进抗炎介质的产生，同时调节巨噬细胞极化。CR-DEVLPs诱导TNF-α分泌。它们激活NF-κB通路，在体外和体内模型中上调造血相关转录因子PU.1。相比之下，地黄来源的EV样颗粒 (RR-DEVLPs)，特别是miR-7972成分，通过下调促炎细胞因子、促进M2样巨噬细胞极化以及调节Hedgehog通路以恢复肠道微生物群平衡，保护免受LPS诱导的肺部炎症。GRE-DEVLPs的高通量测序显示，其RNA含量调节炎症和癌症相关通路。这些颗粒被肠道细胞内化，下调NF-κB和IL-6、IL-8、TNF-α等促炎细胞因子，减轻LPS诱导的炎症。此外，GRE-DEVLPs抑制NLRP3炎症小体激活，抑制caspase-1自剪切和IL-1β/IL-18分泌。ASM-DEVLPs降低了炎症细胞因子水平，并抑制了急性肝衰竭小鼠中cleaved caspase-9和p53等凋亡相关蛋白的表达。ASM-DEVLPs还抑制NF-κB p65表达，阻碍单核细胞迁移，减少巨噬细胞浸润，这与NLRP3激活减少和IL-18释放有关。接触龙葵来源的EV样颗粒显著降低了LPS刺激的RAW264.7细胞中促炎细胞因子IL-6的基因和蛋白表达，IL-6蛋白水平降低高达97.28%，这表明龙葵来源的EV样颗粒通过抑制IL-6产生表现出抗炎活性。同样，韭菜来源的EV样颗粒有效降低了LPS诱导的BV-2和MG-6小胶质细胞中一氧化氮 (NO) 和炎症细胞因子水平。韭菜来源的EV样颗粒显著上调HO-1 mRNA表达，同时下调BV-2细胞中诱导型一氧化氮合酶和炎症细胞因子表达，表明其对小胶质细胞炎症具有保护作用。此外，这些颗粒在体外通过减少HepG2细胞中的促炎因子表现出抗炎作用。
肠道屏障微生物群平衡的调节
肠道微生物群通过肠-器官免疫轴，通过与宿主的双向相互作用调节先天性和适应性免疫的发育、成熟和稳态。它不仅介导肠道的局部免疫反应，还介导远端部位的系统性免疫反应，从而形成宿主免疫网络功能调节的基础。作为该轴的核心驱动因素，肠道微生物群与宿主免疫系统之间的双向串扰自无菌动物模型发展以来已得到充分确立。PDEVLPs由于其固有的生物相容性和靶向能力，已被证明可以精确干预这一调节回路。通过调节肠道微生物群的组成和功能，PDEVLPs有助于维持肠道免疫稳态并协调远端器官的系统性免疫调节。
PDEVLPs对肠道微生物群的调节作用是特异且有效的。多项研究表明，它们通过重塑微生物群落结构、促进有益细菌增殖和增强微生物代谢产物产生来赋予肠道保护。例如，GRE-DEVLPs优先被乳杆菌属物种内化。它们所含的miRNA可以靶向鼠李糖乳杆菌中的特定基因，从而促进色氨酸代谢产物吲哚-3-甲醛的产生。作为芳香烃受体 (AhR) 的配体，吲哚-3-甲醛诱导IL-22的表达，维持肠道屏障的完整性，并最终减轻小鼠结肠炎。低毒性的PGN-DEVLPs在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎模型中也显示出治疗潜力。它们同时调节肠道微生物群和肠道免疫微环境，抑制TNF-α和IL-6等促炎细胞因子的分泌，改善结肠组织病理学，并加强肠道屏障。值得注意的是，PG-DEVLPs降低了厚壁菌门/拟杆菌门的比例，为炎症性肠病 (IBD) 治疗提供了新策略。此外，T-DEVLPs和柑橘皮来源的EV样颗粒通过调节促炎细胞因子和抗氧化基因的表达，在小鼠结肠炎中发挥保护作用。柑橘皮来源的EV样颗粒进一步增加有益厚壁菌门的丰度，同时减少有害细菌。茶叶来源的EV样颗粒 (TL-DEVLPs) 通过促进IL-10的分泌和改善结肠屏障的完整性来显示抗炎作用，同时还增强微生物多样性，从而预防IBD和结肠炎相关结直肠癌。韭菜来源的EV样颗粒通过增加微生物α多样性、调节色氨酸代谢和抑制Th17信号通路，增强溃疡性结肠炎的治疗效果。
重要的是，PDEVLP诱导的肠道微生物群重塑并不仅限于肠道。它可以通过肠-器官免疫轴扩展到远端器官的系统性免疫和代谢调节，这一机制近年来得到越来越多高影响力研究的支持。金银花来源的EV样颗粒 (H-DEVLPs) 不仅通过重塑肠道微生物群改善IBD，还通过肠-肝轴改善代谢功能障碍相关脂肪肝病。重编程的微生物群产生短链脂肪酸等代谢物，介导肠道微生物与肝脏免疫细胞之间的信号传导，从而减轻肝脏炎症和脂质代谢紊乱。艾叶来源的EV样颗粒通过调节肠道微生物群缓解溃疡性结肠炎。新出现的证据进一步表明它们参与了肠-脑轴，其中微生物群衍生的短链脂肪酸进入体循环并作用于大脑驻留免疫细胞（如小胶质细胞）以抑制过度的神经炎症。葛根来源的EV样颗粒 (LKR-DEVLPs) 促进骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 的成骨分化，并改善去卵巢骨质疏松大鼠模型的骨密度和微结构。值得注意的是，PEG-DEVLPs也重塑了肠道微生物群组成，减少了有害细菌的丰度，并改变了氧化三甲胺等微生物代谢物，表明其骨保护作用可能涉及“微生物群-肠-骨轴”的调节。类似地，地黄来源的EV样颗粒 (RG-DEVLPs) 含有rgl-miR-7972，对LPS诱导的急性肺部炎症具有很强的保护作用。在RAW264.7巨噬细胞中，这种miRNA下调G蛋白偶联受体161 (GPR161) 以激活Hedgehog信号，同时还通过靶向毒力基因sxt2抑制大肠杆菌生物膜形成。这些多重作用减轻了急性肺部炎症，同时调节了肠道微生物群，突出了其在调节肠-肺轴中的潜在作用。
进一步的研究表明，来自肠道微生物群的关键代谢物，包括短链脂肪酸和吲哚衍生物，是介导远端器官免疫调节的关键信号分子。短链脂肪酸——主要是乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐——是膳食纤维的主要发酵产物。它们调节免疫细胞功能，促进Treg的分化，增强上皮屏障的完整性，并通过激活GPR41、GPR43和GPR109A等G蛋白偶联受体来抑制促炎细胞因子的表达。同时，微生物中色氨酸代谢产生的吲哚衍生物，如吲哚-3-甲醛，充当AhR的内源性配体。AhR信号激活抑制氧化应激并抑制NLRP3炎症小体激活，从而减少炎症并促进粘膜修复。重要的是，这些代谢物不仅限于局部肠道作用；它们可以进入体循环并调节多个远端器官（包括肝脏、肺和胰腺）的免疫细胞功能。这为理解肠-器官轴如何协调系统性免疫反应提供了关键的分子基础。
总的来说，这些研究表明，PDEVLPs可以通过精确调节肠道微生物群的组成及其代谢谱来系统性调节肠-器官免疫轴。这种双重作用既可减轻局部肠道炎症和恢复屏障完整性，又可调节远端器官的炎症反应和代谢稳态。这些发现为治疗多器官免疫相关疾病提供了一种基于草药的新策略。
PDEVLPs在疾病发病机制和治疗中的作用
草药通常以未加工的天然状态使用，以其高质量和高浓度的活性成分而闻名，这些成分可能与干燥制剂中的不同。研究表明，草药在治疗某些疾病方面可能比其干燥对应物更有效。其中，PDEVLPs通过促进抗原呈递、调节免疫系统和促进细胞因子转运，在管理多种疾病中发挥重要作用。由于其高生物相容性、低细胞毒性和低免疫原性，PDEVLPs对一系列疾病具有巨大的治疗潜力。
