斯坦利·楚克韦吉姆 | 罗蒂米·E·阿卢科
曼尼托巴大学食品与人类营养科学系，温尼伯，曼尼托巴 R3T 2N2，加拿大
**摘要**
本研究探讨了微生物转谷氨酰胺酶处理（5–25 U/g 蛋白质）对白羽扇豆（WLPI）和蓝羽扇豆（BLPI）蛋白分离物在 pH 3、5、7 和 9 下乳化性能的影响。转谷氨酰胺酶通过 ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸交联作用催化形成了高分子量聚合物，这一过程通过 SDS-PAGE 分析得到了证实。FTIR 光谱显示，在 20–25 U/g 的处理浓度下，β-折叠结构含量显著降低（减少了 10–15%），同时 α-螺旋结构和聚集的 β-折叠结构增加。酶处理导致溶解度和表面电荷特性发生物种特异性和 pH 依赖性的变化。在 pH 3 时，转谷氨酰胺酶处理显著提高了乳化能力，使 WLPI 的液滴尺寸从 14 μm 减小到 7–8 μm，并且由于形成了坚固的界面蛋白膜，乳液稳定性得到增强。在 pH 9 时，强烈的静电排斥作用（-20 至 -30 mV）成为主要的稳定机制，使得酶处理的效果减弱。共聚焦显微镜和絮凝/聚集指数进一步验证了这些 pH 依赖性的微观结构变化。这些发现表明，要成功应用转谷氨酰胺酶修饰的羽扇豆蛋白，需要仔细优化酶浓度和 pH 值，以平衡结构改变与食品乳液系统中的功能表现。
**1. 引言**
羽扇豆（Lupinus spp.）是一种未被充分利用的豆类，具有独特的营养价值，其蛋白质含量约为 35–45%，可与大豆媲美，同时还具有固氮作用和适应贫瘠土壤的能力（Chukwuejim 等，2023）。在商业上重要的品种中，白羽扇豆（L. albus）和蓝羽扇豆（L. angustifolius）因其均衡的氨基酸组成、低生物碱含量以及在地中海、欧洲和澳大利亚地区的广泛种植而受到越来越多的关注（Vogelsang-O’Dwyer 等，2020）。羽扇豆种子中的储存蛋白主要是 11S 类豆球蛋白（α-凝集素）和 7S 类豆球蛋白（β-凝集素），占总蛋白的约 85%，这些蛋白影响其在食品中的应用，如乳化剂和发泡剂的开发（Berghout 等，2014；Devkota 等，2023）。开发基于豆类的乳化食品需要具有优异界面特性的蛋白，以在加工和储存过程中稳定油水界面（Grasberger 等，2024）。乳化能力还取决于多种蛋白特性，如分子柔韧性、表面疏水性、电荷分布以及快速吸附于空气-水界面的能力并形成粘弹性膜的能力（Guldiken 等，2023）。由于豆类蛋白的紧凑构象、有限的分子柔韧性和在中性 pH 下易于聚集的特性，其乳化性能通常不如乳制品蛋白（Cabrita 等，2023）。在需要长期稳定性、耐热处理和适应不同离子强度的复杂食品体系中，这些限制尤为明显（Östbring 等，2021）。对清洁标签、可持续食品成分的需求增加，使得通过定向修饰来增强植物蛋白功能性的兴趣日益浓厚，而不是依赖合成乳化剂或动物源蛋白（Nivala 等，2021）。认识到羽扇豆蛋白的技术功能局限性，人们对其改性策略进行了广泛研究，以改善其感官属性、功能性和加工性能。物理处理方法（包括高压处理、超声波处理、超临界二氧化碳处理和可控热处理）在提高溶解度和减少非共价相互作用及构象变化方面取得了一定成功（Lo 等，2024；Xia 等，2019；Domínguez-Valencia 等，2025；Yaver & Bilgiçli，2023）。生物加工方法也是一个有前景的替代方案，发芽可以增加蛋白水解活性，生成具有更好功能的肽（Guzmán-Ortiz 等，2024；Navarro-Vozmediano 等，2025），而用选定微生物进行发酵可以减少抗营养因子并改变风味（Schlegel 等，2019）。化学修饰方法（如乙酰化、磷酸化和美拉德糖基化）也显示出增强乳化性能的潜力，但处理强度和法规接受度限制了其商业应用。在酶处理方法中，蛋白水解已被广泛研究，可以生成溶解度提高的肽，但由于会产生苦味肽，感官品质往往较差（Opazo-Navarrete 等，2022；Pasarin 等，2023）。这些不同的改性策略突显了在保持蛋白结构完整性和清洁标签要求的同时同时改善多种功能特性的持续挑战。
转谷氨酰胺酶（蛋白-谷氨酰胺 γ-谷氨酰转移酶，EC 2.3.2.13）催化蛋白分子之间的共价 ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸交联，提供了一种无需大量水解或苛刻化学处理的定向改性方法（Nivala 等，2021）。该酶能够形成分子内和分子间的异肽键，已被成功用于多种豆类蛋白的改性，研究表明可提高凝胶强度、乳液稳定性和膜形成性能（Huang 等，2022；Kang 等，2024；Santoso 等，2024）。在豆蛋白中，转谷氨酰胺酶处理通过可控聚合增加了乳化活性指数，增强了界面膜强度，而不影响蛋白结构完整性（Huang 等，2022）。对豌豆和蚕豆蛋白的研究表明，适度的交联可以平衡分子量增加与表面活性的提高，而过度处理会导致由于形成大量交联聚集体而降低功能（Nivala 等，2021；Yaputri 等，2023）。该酶对谷氨酰胺和赖氨酸残基的特异性使其特别适合用于羽扇豆蛋白的改性。转谷氨酰胺酶诱导的交联可以通过多种途径增强乳化性能，例如通过增加分子量来提高空间稳定性，通过选择性交联疏水区和亲水区来创建两亲结构，以及通过形成共价网络来增强界面膜（Zhan 等，2022）。尽管对酶修饰植物蛋白的兴趣日益增长，但关于不同羽扇豆物种的转谷氨酰胺酶处理的关键知识仍存在空白。交联程度与羽扇豆蛋白乳化性能之间的关系尚不明确，缺乏系统研究酶浓度对界面行为、液滴稳定机制和乳液微观结构的影响。此外，任何改进的分子基础（包括蛋白构象变化、表面特性和聚集行为）都需要阐明，以便合理优化处理条件。尽管白羽扇豆和蓝羽扇豆蛋白在氨基酸组成和结构组织上存在差异，但尚未探索转谷氨酰胺酶处理在这两种蛋白之间的比较效果，尽管这对商业应用具有潜在意义。
本工作的创新之处在于：（1）首次系统比较了转谷氨酰胺酶处理对白羽扇豆和蓝羽扇豆蛋白分离物乳化性能的影响；（2）在广泛的 pH 范围（pH 3、5、7 和 9）内进行了全面评估，揭示了具有实际应用价值的 pH 依赖性响应；（3）整合了多种分析方法（SDS-PAGE、FTIR、ζ 电位、CLSM、絮凝/聚集指数）来建立交联程度、二级结构变化和乳化性能之间的结构-功能关系；（4）确定了最佳改性条件（10–15 U/g 酶浓度），在保持溶解度和功能性的同时平衡交联优势。这些发现通过展示如何战略性地应用转谷氨酰胺酶修饰来改善羽扇豆蛋白，特别是在酸性乳化系统中，填补了关键的研究空白。
我们假设，不同物种之间的氨基酸组成差异和转谷氨酰胺酶浓度的变化会导致不同的结构和功能特性，这突显了选择合适物种在开发定制功能性成分中的作用。因此，本研究的目的是探讨转谷氨酰胺酶处理对白羽扇豆和蓝羽扇豆种子蛋白分离物乳化性能的影响。预期结果将建立转谷氨酰胺酶介导的羽扇豆蛋白增强与其乳化性能之间的结构-功能关系，从而有助于开发改进的植物基食品成分。
**2. 材料与方法**
2.1. 材料
白羽扇豆（Lupinus albus 'Dieta'）和蓝羽扇豆（Lupinus angustifolius 'Boregine'）种子由 The Lupin Platform Inc.（加拿大阿尔伯塔省卡尔加里）提供。微生物转谷氨酰胺酶（EC 2.3.2.13）购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。乳液制备使用了 Pure Valley 100% 菜籽油。十二烷基硫酸钠（SDS）、β-巯基乙醇、Coomassie Brilliant Blue R-250、8-氨基-1-萘磺酸（ANS）、Tris-HCl 和氯化钠也来自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。Precision Plus Protein Dual Xtra 标准品购自 Bio-Rad Laboratories（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）。本研究使用的所有其他化学品和试剂均为分析级纯度，购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）或 Fisher Scientific Company（加拿大安大略省奥克维尔）。超纯水来自 Milli-Q 水纯化系统（Millipore Corporation，美国马萨诸塞州贝德福德），用于所有溶液制备。
2.2. 方法
2.2.1. 实验设计
实验设计旨在评估蛋白来源、酶处理和 pH 对羽扇豆蛋白分离物的结构、界面和乳化性能的影响。研究了两种蛋白类型（白羽扇豆蛋白分离物 WLPI 和蓝羽扇豆蛋白分离物 BLPI）。实验变量包括转谷氨酰胺酶浓度（5、10、15、20 和 25 U/g 蛋白质）和 pH（3、5、7 和 9）。首先在较宽的 pH 范围内评估了蛋白溶解度，以表征整体 pH 依赖性行为（pH 3–9），然后在选定的 pH 值下进行了详细的结构（ζ 电位、SDS-PAGE、FTIR）和功能（乳化、微观结构、絮凝和聚集）分析。测量的响应变量包括溶解度、表面电荷、分子量分布、二级结构组成、液滴尺寸、乳液微观结构和稳定性指数。
2.2.2. 样品制备
羽扇豆蛋白分离物按照先前描述的方法（Chukwuejim & Aluko，2025）通过等电点沉淀法制备。将微生物转谷氨酰胺酶（TG）溶解在含有 150 mM NaCl 的 20 mM Tris-HCl 缓冲液中（pH 8.0）以制备酶储备液。酶促聚合按照之前的方法（Nivala 等，2021）进行，但稍作修改：用不同浓度的酶（5、10、15、20 和 25 U/g 蛋白质）处理蛋白分离物。酶促交联在 40 °C 下孵育 2 小时并轻轻搅拌。孵育后，通过 95 °C 热处理 5 分钟终止酶活性。混合物用冰冷却后冷冻干燥成干粉，并储存在 -20 °C。对照样品经过相同的处理条件，但不添加酶。
2.2.3. 游离氨基的测定
使用 o-苯二醛（OPA）测定法测定对照和转谷氨酰胺酶处理蛋白分离物中的游离初级氨基含量，方法略有修改（Boachie 等，2022）。简要来说，首先用 80 mL Milli-Q 水溶解 3.81 g 硼酸盐制备硼酸盐缓冲液，然后加入 0.088 g 二硫苏糖醇和 0.1 g 十二烷基硫酸钠。新鲜制备 OPA 试剂，将 80 mg OPA 溶解在 2 mL 乙醇中，再加入硼酸盐缓冲液中并稀释至 100 mL。试剂混合后避光保存直至使用。对照和 TG 处理的蛋白样品用 Milli-Q 水稀释至相同的蛋白浓度（1 mg/mL），以确保直接比较，并在分析前将所有样品平衡至室温。在微孔板孔中，将 200 µL OPA 试剂与 50 µL 蛋白样品混合，OPA 试剂与样品的比例为 4:1（v/v）。反应混合物在室温下轻轻混合并孵育 2 分钟，然后用微孔板读数仪（Biotek Synergy H4，美国佛蒙特州）在 340 nm 处测量吸光度。使用 L-丝氨酸（0–1.0 mM）溶解在 Milli-Q 水中制备的校准曲线进行定量，结果以每克蛋白的丝氨酸当量毫摩尔表示。
2.2.4. ζ 电位
TG 交联羽扇豆蛋白分离物的表面电荷特性测定按照 Chukwuejim 等（2025）的方法进行。使用 Zetasizer Nano-Z（Malvern Instruments Ltd., 英国）在 pH 3、5、7 和 9 下测定 ζ 电位。蛋白分散液（0.1% w/v）在各种缓冲系统中制备：醋酸缓冲液（pH 3 和 5）、磷酸盐缓冲液（pH 7）和 Tris-HCl 缓冲液（pH 9）。样品在 4 °C 下连续搅拌过夜平衡。测量前，将分散液平衡至室温并通过离心（2000 × g，10 分钟）去除不溶性物质。ζ 电位测量采用自动电压选择模式，计算值时应用 Smoluchowski 近似公式，仪器参数设定为折射率 1.45 和吸收系数 0.001。SDS-PAGE：使用Mini-PROTEAN TGX预制的4–15%梯度凝胶（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）在还原条件下对TG聚合的羽扇豆蛋白分离物进行了电泳表征，方法基于Laemmli（1970）的改良程序。蛋白样品被稀释至10 mg/mL，置于含有62.5 mM Tris-HCl（pH 6.8）、2%（w/v）SDS、25%（v/v）甘油、10%（v/v）巯基乙醇和0.01%（w/v）溴酚蓝的样品缓冲液中。混合物在95 °C下加热5分钟，然后冷却并离心。每个泳道加载10 μL的蛋白样品以及一个分子量标记物（10–250 kDa）。电泳在150 V的恒定电压下进行约70分钟，使用Tris-甘氨酸-SDS运行缓冲液（25 mM Tris、0.192 mM甘氨酸、0.1% SDS，pH 8.3），直到染料前沿到达凝胶底部。电泳后，凝胶用Coomassie Brilliant Blue R-250（0.1%在40%甲醇、10%醋酸中）染色2小时并轻轻搅拌，然后用50%甲醇：10%醋酸：40% DDW溶液脱色，直到背景清晰。蛋白条带通过凝胶成像系统（UMAX，Dallas，TX，USA）进行可视化并记录。
2.2.6. FTIR二级结构分析：使用傅里叶变换红外光谱（Bruker Invenio S，Bruker Optics，Germany）根据Hewage等人（2024）描述的方法进行了蛋白二级结构分析。将大约2–3 mg的每种TG聚合羽扇豆蛋白分离物直接放置在钻石ATR晶体上，并使用压力施加器确保均匀接触。光谱采集参数设置为：分辨率4 cm⁻¹，扫描范围4000–400 cm⁻¹，每个光谱平均120次扫描。在每次样品测量前使用相同的参数收集1分钟的背景光谱并自动减去。分析酰胺I区域（1700–1600 cm⁻¹）以确定二级结构。光谱数据使用Origin软件（OriginLab Corporation，USA）导出和处理。处理包括基线校正、平滑和计算二阶导数以分离重叠峰。通过Origin的峰分析工具使用高斯曲线拟合进行峰解卷积。二级结构分配基于特征吸收带：β-折叠（1627–1640 cm⁻¹和1670–1680 cm⁻¹）、α-螺旋（1650–1660 cm⁻¹）、β-转角（1680–1690 cm⁻¹）、聚集的A1片层（1615–1625 cm⁻¹）、聚集的A2片层（1695–1600 cm⁻¹）和随机卷曲（1640–1650 cm⁻¹）。每种结构的相对比例是根据分配峰的积分面积使用Origin软件计算得出的。
2.2.7. 蛋白溶解度：根据Chukwuejim和Aluko（2024）的方法获得了TG聚合羽扇豆蛋白分离物的溶解度曲线。对于每个条件（pH 3–9），将50 mg TG聚合蛋白分离物（或对照）分散在5 mL适当的缓冲液中。样品彻底涡旋30秒并在室温下平衡60分钟以确保完全水合。通过离心（5600 × g，30分钟，25 °C）去除不溶性物质，然后用改良的Lowry测定法（Markwell等人，1978）分析上清液中的蛋白含量。为了确定总蛋白含量，还将在1 M NaOH中溶解的平行样品。蛋白溶解度（PS，%）计算如下：(1) PS(%) = 上清液中的蛋白含量 / 样品中的总蛋白含量 × 100
2.2.8. 乳化能力和乳液稳定性：根据Asen和Aluko（2023）的改良方案制备了油包水乳液。根据蛋白含量制备了10 mg/mL的蛋白分散液，在不同的0.1 M缓冲系统中达到不同的pH条件：醋酸盐（pH 3）、磷酸盐（pH 5和7）和Tris（pH 9）。为了形成乳液，将1 mL精炼菜籽油（Pure Valley 100%菜籽油，Montreal，QC）与5 mL每种蛋白分散液混合。使用Polytron PT 10-35均质机（Kinematica AG，Lucerne，Switzerland）以20,000 rpm的速度均质化60秒，配备12毫米分散器以实现均匀的液滴分散。通过Mastersizer 3000（Malvern Panalytical Ltd., Malvern，UK）使用激光衍射技术表征粒径分布。使用Hydro 3000小体积分散单元进行测量，连续相为Milli-Q水。将乳液样品在连续搅拌下加入大约100 mL水中，直到达到最佳浑浊度。表面加权平均直径（d₃,₂）通过三次测量确定，并用作乳化能力的指标。短期乳液稳定性通过比较初始液滴大小与室温下储存30分钟后的液滴大小来评估。需要注意的是，此测量反映的是短期物理稳定性而非长期货架稳定性。短期乳液稳定性使用以下公式计算：(2) 乳液稳定性(%) = 0分钟时的平均油滴大小 / 30分钟时的平均油滴大小 × 100。值为100%表示液滴大小没有变化，表明短期稳定性良好。低于100%的值表示30分钟内液滴大小增加，表明由于聚集或絮凝而发生不稳定。偶尔出现的超过100%的值可能是由于测量变异性或轻微的重新分布效应，不应解释为稳定性提高。
2.2.9. 乳液微观结构表征：使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）根据Tian等人（2020）的改良方案分析了乳液微观结构。成像使用配备Zeiss Imager M2显微镜的Zeiss LSM 700共聚焦系统（Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）进行。通过用Nile Red（1 mg/mL在乙醇中）染色脂质相，同时用荧光素异硫氰酸酯（FITC，1 mg/mL在乙醇中）标记蛋白成分来实现双荧光标记。荧光检测在Nile Red染色的油滴的激发/发射波长561 nm和FITC标记的蛋白的488 nm下进行。
2.2.10. 聚集和絮凝指数：使用Chukwuejim和Aluko（2024）建立的方案在新鲜制备的乳液上确定了絮凝指数（FI）。新鲜乳液样品使用两种不同的介质稀释：蒸馏去离子水（DDW）和10 mg/mL十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。在两个时间点测量分散油滴的体积加权平均直径（d₄,₃）：制备后立即（0 h）和储存24小时后。使用Mastersizer 3000（Malvern Panalytical Ltd., Malvern，UK）进行粒径分析。FI（%）使用以下公式计算：(3) FI(%) = [(d₄,₃在水中) / (d₄,₃在10 mg/mL SDS中) − 1] × 100 CI在4 °C储存24小时后如下确定：(4) CI(%) = [(d₄,₃在24小时) / (d₄,₃在0小时) − 1] × 100，其中d₄,₃（0 h）和d₄,₃（24 h）分别是使用10 mg/mL SDS作为稀释剂时乳液中的d₄,₃值。
2.2.11. 统计分析：所有实验均重复三次，结果以平均值±标准差表示。使用IBM SPSS统计软件版本28（Chicago，IL，USA）进行统计分析。对于WLPI和BLPI分别在不同面板中分析的数据集（游离氨基含量、ζ电位和蛋白溶解度），对每种蛋白分离物在每个pH水平下分别进行单因素ANOVA，以酶处理（0–25 U/g）作为单一因素。对于在同一图中比较两种蛋白分离物的数据集（乳化能力、乳液稳定性、絮凝指数和聚集指数），在每个pH水平下进行单因素ANOVA，以组合的蛋白类型×酶浓度组（WLPI、WT5U、WT10U、WT15U、WT20U、WT25U、BLPI、BT5U、BT10U、BT15U、BT20U、BT25U）作为单一处理因素。本研究未测试物种、酶浓度和pH之间的相互作用。在所有情况下，使用Duncan的多范围检验在p < 0.05的显著性水平下确定均值之间的显著差异。
3. 结果和讨论
3.1. 游离氨基含量：游离氨基含量与酶交联程度相关，可以指示酶活性的强度。通常，WLPI和BLPI中的游离氨基含量随着TG浓度的增加而逐渐减少，证实了成功的交联（图1A和B）。对于WLPI，游离氨基含量从27%（未处理）显著下降到20–25 U/g时的约14%，减少了48%（图1A）。BLPI也显示出类似的趋势，从29%下降到最高酶浓度时的约10%，减少了66%（图1B）。游离氨基含量的减少可以归因于TG催化的谷氨酰胺和赖氨酸残基之间形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键，这消耗了可用的初级胺。值得注意的是，BLPI表现出明显的阈值行为，在5–15 U/g时变化很小，然后在20 U/g时急剧下降，表明需要一个临界酶浓度来克服初始结构障碍。相比之下，WLPI显示出更渐进的动力学，在10 U/g后减少趋于平稳，表明可访问的赖氨酸残基部分饱和，受到空间阻碍。这些差异可能反映了赖氨酸的可访问性、赖氨酸与谷氨酰胺的空间接近度以及不同品种之间的天然蛋白构象的变化。
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图1. TG聚合的白（A）和蓝（B）羽扇豆蛋白分离物的游离氨基含量。在每个pH下，不同字母的条形图具有显著不同的（p < 0.05）平均值，由ANOVA和Duncan的多范围检验确定。
pH和酶浓度对TG聚合的白（C）和蓝（D）羽扇豆蛋白分离物的ζ电位的影响。不同字母的条形图具有显著不同的（p < 0.05）平均值，由ANOVA和Duncan的多范围检验确定。
WLPI-白羽扇豆蛋白分离物；WT5U-白转谷氨酰胺酶5单位；WT10U-白转谷氨酰胺酶10单位；WT15U-白转谷氨酰胺酶15单位；WT20U-白转谷氨酰胺酶20单位；WT25U-白转谷氨酰胺酶25单位；BLPI-蓝羽扇豆蛋白分离物；BT5U-蓝转谷氨酰胺酶5单位；BT10U-蓝转谷氨酰胺酶10单位；BT15U-蓝转谷氨酰胺酶15单位；BT20U-蓝转谷氨酰胺酶20单位；BT25U-蓝转谷氨酰胺酶25单位。
3.2. ζ电位：两种处理过的羽扇豆蛋白分离物的ζ电位曲线显示出特征性的电荷反转模式，从pH 3时的正值（+3至+20 mV）转变为pH 9时的强负值（−15至−30 mV），等电点出现在pH 4–5之间，此时值接近零（图1C和D）。这种两性行为反映了组成氨基酸的离子化状态，组氨酸、赖氨酸和精氨酸残基在酸性pH下质子化，而天冬氨酸和谷氨酸残基在碱性条件下去质子化（Nogueira等人，2019）。未经处理的BLPI和WLPI之间表面电荷的相似幅度表明尽管内部结构可能存在差异，但表面氨基酸组成相似（Chukwuejim等人，2025）。TG处理显著改变了表面电荷特性，最明显的效果出现在极端pH值而不是等电点附近。在pH 3时，WLPI酶处理样品显示出与对照组相似且略有增强的正电荷，所有酶浓度下的值范围为+3至+20 mV。尽管发生了共价修饰，这种正电荷的保持或增强表明TG介导的交联可能通过构象变化暴露了额外的带电基团。或者，交联网络创建了一个更扩展的结构，使得碱性残基的表面积更大（Vijayan等人，2024）。异肽键的形成消耗了赖氨酸残基；然而，保持的正电荷可能表明交联主要涉及不参与表面电荷的埋藏赖氨酸残基，或者酶处理过程中蛋白质的展开暴露了之前隐藏的碱性氨基酸（Nogueira等人，2019）。在碱性pH下，负ζ电位值随酶处理的变化很小，所有修饰水平下的值保持在−15至−30 mV之间。这种一致性表明，负责pH 9时负电荷的酸性残基基本上不受TG的影响，TG主要针对谷氨酰胺和赖氨酸残基（Nivala等人，2021）。碱性pH下的负电荷对乳液稳定性有重要影响，因为足够的静电排斥可以防止交联蛋白系统中的液滴聚集（Kang等人，2024）。无论pH如何变化，ζ电位在pH 5时接近零，尽管在这个pH下观察到了溶解度的变化（表1）。这表明虽然广泛的交联产生了大的不溶性聚集体，但这些结构的表面电荷特性仍然与天然蛋白相似（Nivala等人，2021）。TG修饰后的ζ电位结果表明，处理过的蛋白质保持了它们的聚电解质性质，这对于食品系统中的pH依赖性功能至关重要。pH 7–9下的负电荷表明TG修饰的羽扇豆蛋白可以在中性至碱性乳液中提供静电稳定，而pH 3下的正电荷表明它们适用于酸性食品系统。pH值和酶浓度对转谷氨酰胺酶聚合的羽扇豆蛋白分离物溶解度的影响。pHBLPIBT 5UBT 10UBT 15UBT 20UBT 25U360.97 ± 2.41c67.89 ± 2.06a64.30 ± 3.79b52.76 ± 2.53e55.33 ± 3.54d68.58 ± 1.07a428.28 ± 0.12a25.84 ± 0.89b15.07 ± 0.75c11.57 ± 0.67d9.35 ± 0.79e9.86 ± 0.24e51.74 ± 0.62c8.15 ± 0.91a0.46 ± 0.00c3.79 ± 0.55b00633.62 ± 3.41a26.35 ± 0.41b18.92 ± 1.99c17.38 ± 0.91c15.93 ± 0.20d13.53 ± 0.55d764.99 ± 3.02c73.45 ± 0.67a62.34 ± 1.67d69.35 ± 3.14b62.85 ± 0.32d68.23 ± 1.39b890.86 ± 0.12b95.31 ± 0.59a89.31 ± 3.66b86.64 ± 0.98c90.75 ± 0.96b86.64 ± 1.47c994.55 ± 1.54b97.05 ± 1.05a86.52 ± 1.36d90.77 ± 1.08c90.94 ± 1.59c87.51 ± 0.75dpHWLPIWT 5UWT 10UWT 15UWT 20UWT 25U344.99 ± 2.61c51.74 ± 0.55a45.76 ± 0.31c43.11 ± 0.12d47.55 ± 1.98b45.24 ± 0.84c410.71 ± 0.20b16.01 ± 0.67a8.66 ± 0.20c10.20 ± 0.2b9.94 ± 0.20bc8.92 ± 0.55c54.05 ± 0.51b6.27 ± 1.67a5.76 ± 1.69ab4.22 ± 0.73b2.07 ± 0.72c2.51 ± 0.20c644.30 ± 4.20a44.13 ± 1.39a43.11 ± 0.24a36.61 ± 0.36c40.63 ± 0.31b38.75 ± 2.14c755.58 ± 2.72a52.42 ± 1.58b51.05 ± 1.15c47.29 ± 0.24d55.07 ± 0.20a52.94 ± 0.79b890.64 ± 0.49b93.08 ± 3.83a85.53 ± 0.54c83.11 ± 2.20d89.97 ± 1.57b88.64 ± 0.87c991.21 ± 0.59a91.68 ± 1.31a89.76 ± 1.92b82.23 ± 0.68c91.23 ± 1.32a88.31 ± 1.52b数值代表平均值 ± 标准差。同一行中具有不同上标的数值通过ANOVA和Duncan多重范围测试显著不同（p < 0.05）。WLPI-白色羽扇豆蛋白分离物；WT5U-白色转谷氨酰胺酶5单位；WT10U-白色转谷氨酰胺酶10单位；WT15U-白色转谷氨酰胺酶15单位；WT20U-白色转谷氨酰胺酶20单位；WT25U-白色转谷氨酰胺酶25单位；BLPI-蓝色羽扇豆蛋白分离物；BT5U-蓝色转谷氨酰胺酶5单位；BT10U-蓝色转谷氨酰胺酶10单位；BT15U-蓝色转谷氨酰胺酶15单位；BT20U-蓝色转谷氨酰胺酶20单位；BT25U-蓝色转谷氨酰胺酶25单位。3.3. 凝胶电泳电泳图谱显示，随着TG浓度的增加，高分子量聚合物逐渐形成，证明了白色和蓝色羽扇豆蛋白分离物的成功酶促交联（图2A和B）。天然蛋白质（WLPI，泳道7；BLPI，泳道15）显示出15–75 kDa之间的特征性条带模式，代表大约50–60 kDa的α-凝集素（类似豆科植物的）亚基和20–45 kDa的β-凝集素（类似vicilin）成分，这与之前对羽扇豆储存蛋白的表征一致（Duranti等人，2008年）。TG处理诱导了剂量依赖性的聚合，表现为天然分子量条带的强度降低以及同时出现滞留在凝胶界面或作为大于250 kDa的扩散条带迁移的蛋白质。这些高分子量（>250 kDa）聚集体与图1A和B中显示的高浓度TG下自由氨基团的显著减少直接相关。在中等酶浓度（5–10 U/g）下，原始条带模式部分保留，同时出现高分子量物种，表明交联不完全，单体和寡聚体形式与新形成的聚合物共存。这种异质修饰模式表明TG对特定蛋白质组分具有选择性反应性，可能受到不同蛋白质构象中谷氨酰胺和赖氨酸残基的可及性和空间取向的影响（San等人，2025年）。在20–25 U/g时，WLPI形成了大量的聚合物，其中大量蛋白质物质滞留在堆积-分辨凝胶界面，表明形成了超过250 kDa的复合物，无法穿透聚丙烯酰胺基质。这种广泛的交联与pH 5时观察到的完全溶解度丧失相符（表1），证实过度聚合形成了太大而无法保持溶解性的网络。随着酶浓度的增加，20–50 kDa范围内的条带逐渐消失，表明储存蛋白的酸性和碱性多肽都参与了交联反应。中间分子量组分（30–50 kDa）优先被修饰，而较小的肽（15–25 kDa）则较少被修饰，这表明较大的亚基具有更易被酶攻击的反应性残基或更有利的构象（Nivala等人，2021年）。这种选择性反应模式对功能有重要影响，因为特定亚基的完全交联可能会消除它们对乳化的单独贡献，同时形成具有独特界面特性的新聚合物结构（Vijayan等人，2024年）。在中等酶浓度（10–15 U/g）下，未修饰的蛋白质、中等大小的寡聚体和大量聚合物共存，可能产生协同效应：较小的蛋白质快速吸附在界面，中等大小的寡聚体提供空间稳定作用，大分子量聚合物形成厚厚的粘弹性层（Zhan等人，2022年）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图2. 转谷氨酰胺酶聚合的白色（A）和蓝色（B）羽扇豆蛋白分离物的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。1. 蛋白质标准标记物（kDa）；2. WT25U；3. WT20U；4. WT15U；5. WT10U；6. WT5U；7. WLPI；8. 蛋白质标准标记物（kDa）；9. 蛋白质标准标记物（kDa）；10. BT25U；11. BT20U；12. BT15U；13. BT10U；14. BT5U；15. BLPI；16. 蛋白质标准标记物（kDa）。WLPI-白色羽扇豆蛋白分离物；WT5U-白色转谷氨酰胺酶5单位；WT10U-白色转谷氨酰胺酶10单位；WT15U-白色转谷氨酰胺酶15单位；WT20U-白色转谷氨酰胺酶20单位；WT25U-白色转谷氨酰胺酶25单位；BLPI-蓝色羽扇豆蛋白分离物；BT5U-蓝色转谷氨酰胺酶5单位；BT10U-蓝色转谷氨酰胺酶10单位；BT15U-蓝色转谷氨酰胺酶15单位；BT20U-蓝色转谷氨酰胺酶20单位；BT25U-蓝色转谷氨酰胺酶25单位。3.4. 次级结构分析通过FTIR光谱分析酰胺I带（1700–1600 cm⁻¹）可以非破坏性地量化蛋白质的次级结构，因为CO伸缩振动对不同构象状态下的氢键模式敏感（Tintor等人，2024年）。FTIR光谱分析显示，转谷氨酰胺酶处理改变了两种羽扇豆蛋白分离物的次级结构分布，其中主要的β-折叠构象（1615–1625和1627–1640 cm⁻¹）占总结构的约55–60%（图3）。这种β-折叠优势与豆科植物储存蛋白的特征性折叠一致，其中反平行β-折叠形成了vicilin和豆科蛋白的结构核心（Devkota等人，2023年）。天然蛋白质还显示出大量的α-螺旋含量（1650–1660 cm⁻¹，约15–20%）和β-转角区域（1670–1680 cm⁻¹，10–12%），以及少量的随机卷曲（1640–1650 cm⁻¹）和聚集的β-折叠结构（1695–1695 cm⁻¹），这与FTIR光谱对羽扇豆球蛋白的研究一致（Devkota等人，2023年）。逐渐增加的TG处理导致β-折叠含量下降，特别是在20–25 U/g时观察到10–15%的减少。这种结构转变可能是由于酶促交联过程中天然β-折叠氢键网络的破坏，因为异肽键的形成引入了使规则次级结构不稳定的构象约束（Wang等人，2023年）。在中等酶浓度（5–15 U/g）下，α-螺旋含量的增加表明β-折叠向α-螺旋的转变，可能是由交联过程中的局部展开和重折叠事件引起的（Mattice & Marangoni，2021年）。在高酶浓度（WT20-WT25U/g）下，聚集的β-折叠结构的出现与SDS-PAGE分析中观察到的广泛聚合相对应，提供了分子水平的证据。这些聚集的β-折叠的形成也可能解释了pH 4–6时溶解度的降低，因为聚集的β-折叠结构通过共价交联和非共价相互作用形成了扩展的网络（Devkota等人，2023年）。在中等酶浓度（10–15 U/g）下，未修饰的蛋白质、中等大小的寡聚体和大量聚合物的共存可能提供协同效应：较小的蛋白质快速吸附在界面，中等大小的寡聚体提供空间稳定作用，大分子量聚合物形成厚厚的粘弹性层（Zhan等人，2022年）。下载：下载高分辨率图像（404KB）下载：下载全尺寸图像图3. 转谷氨酰胺酶聚合的白色（A）和蓝色（B）羽扇豆蛋白分离物的FTIR光谱次级结构分析。WLPI-白色羽扇豆蛋白分离物；WT5U-白色转谷氨酰胺酶5单位；WT10U-白色转谷氨酰胺酶10单位；WT15U-白色转谷氨酰胺酶15单位；WT20U-白色转谷氨酰胺酶20单位；WT25U-白色转谷氨酰胺酶25单位；BLPI-蓝色羽扇豆蛋白分离物；BT5U-蓝色转谷氨酰胺酶5单位；BT10U-蓝色转谷氨酰胺酶10单位；BT15U-蓝色转谷氨酰胺酶15单位；BT20U-蓝色转谷氨酰胺酶20单位；BT25U-蓝色转谷氨酰胺酶25单位。3.5. 蛋白质溶解度TG修饰的羽扇豆蛋白分离物的pH依赖性溶解度曲线显示BLPI和WLPI羽扇豆物种之间存在明显差异，酶浓度显著影响整个pH范围内的蛋白质溶解行为（表1）。处理和未处理的蛋白质都表现出特征性的U形溶解度曲线，在pH 4–5附近溶解度最低，对应于它们的等电点，此时净电荷接近零，蛋白质-蛋白质相互作用占主导地位（Opazo-Navarrete等人，2022年）。这种行为与之前的羽扇豆蛋白报告一致，这些蛋白质的等电点通常在pH 4–5之间，因为它们的初级结构中酸性氨基酸（如天冬氨酸和谷氨酸）占主导（Chukwuejim & Aluko，2025年）。TG处理在pH 5时导致溶解度显著降低，BLPI在20–25 U/g时完全不溶，而处理过的WLPI在pH 5时并未完全不溶。重要的是，这种溶解度的损失主要是由TG诱导的网络形成和蛋白质聚集引起的，而不是仅由表面电荷效应引起的，因为在等电点时两种样品的zeta电位接近零。这种不同的反应可能反映了物种之间的结构差异，特别是谷氨酰胺和赖氨酸残基对交联的可及性（Nivala等人，2021年）。通过ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸键形成的高分子量聚合物减少了蛋白质-水相互作用，并促进了网络的形成，将水分子困在刚性结构中，从而降低了表观溶解度（Zhan等人，2022年）。在BLPI中观察到的显著天然样次级结构的保留具有重要的功能意义。部分保留的β-折叠结构保持了蛋白质的稳定性，而引入的交联提供了额外的结构强化，可能产生了具有增强界面特性的蛋白质。增加的α-螺旋含量可能改善了两亲性，因为α-螺旋通常具有不同的疏水性和亲水性面，有助于在油-水界面定向（Mattice & Marangoni，2021年）。这些结构修饰，加上交联导致的分子量增加，表明中等修饰的蛋白质（10–15 U/g）可能在结构完整性和乳化应用的功能增强之间提供最佳平衡。下载：下载高分辨率图像（404KB）下载：下载全尺寸图像图3. 转谷氨酰胺酶聚合的白色（A）和蓝色（B）羽扇豆蛋白分离物的FTIR光谱次级结构分析。WLPI-白色羽扇豆蛋白分离物；WT5U-白色转谷氨酰胺酶5单位；WT10U-白色转谷氨酰胺酶10单位；WT15U-白色转谷氨酰胺酶15单位；WT20U-白色转谷氨酰胺酶20单位；WT25U-白色转谷氨酰胺酶25单位；BLPI-蓝色羽扇豆蛋白分离物；BT5U-蓝色转谷氨酰胺酶5单位；BT10U-蓝色转谷氨酰胺酶10单位；BT15U-蓝色转谷氨酰胺酶15单位；BT20U-蓝色转谷氨酰胺酶20单位；BT25U-蓝色转谷氨酰胺酶25单位。3.6. 乳化能力和乳液稳定性油滴大小分布（d3,2）和乳液稳定性曲线显示了TG处理的pH依赖性反应，酸性和碱性条件之间存在显著差异（图4A和B）。乳液稳定性在两个互补的时间尺度上进行讨论。短期稳定性是指蛋白质在均质化后立即快速吸附在油-水界面并抵抗滴液增长的能力，通过30分钟内测量的滴液大小变化来反映。相比之下，长期物理稳定性与乳液在储存过程中抵抗滴液聚集和融合的能力相关，使用24小时后的絮凝和聚结指数进行评估。在pH 3时，逐渐增加的TG处理导致滴液大小显著减小，从WLPI的约14 μm减小到20–25 U/g时的7–8 μm。在酸性条件下乳化能力的增加似乎有些反直觉，考虑到SDS-PAGE分析中观察到的广泛交联；然而，这可能归因于形成了具有改进界面吸附效率的柔性聚合物结构。酶促聚合可以暴露隐藏的疏水域并增加分子灵活性，促进蛋白质分子在油-水界面的更快迁移和重新排列（Glusac等人，2020年）。然而，尽管更快的吸附动力学可能有助于改善乳化效果，但在当前研究中并未直接测量这一点；在pH 3时性能的提升与交联聚合物提供的界面膜增强和空间稳定作用一致。pH 3下的乳化能力可能反映了TG修饰蛋白质在酸性条件下的独特界面行为。交联蛋白质由于在酶修饰过程中暴露出疏水区域，可能会表现出更高的表面活性，这一点从FTIR分析观察到的结构重组中可以得到证实。此外，尽管发生了广泛的交联，但在pH 3时仍能保持溶解性，确保了足够的蛋白质可用于界面覆盖，而较大的分子量在吸附后提供了更有效的空间稳定作用（Damodaran & Agyare, 2013）。处理过的蓝色羽扇豆蛋白分离物的相应乳液稳定性数据也与形成坚固的蛋白质界面膜相符。其他研究也获得了类似的酸性pH结果，例如大豆（Kang et al., 2024）和酪蛋白（Nogueira et al., 2019）稳定的乳液。虽然许多食品乳液是在pH 4–6范围内配制的，但pH 3附近的酸性条件对于酸化饮料、水果基饮料和发酵产品来说非常相关。此外，pH 3代表了蛋白质功能性的一个临界应力条件，在此条件下静电稳定作用受到挑战。在这一pH值下观察到的强乳化性能表明，转谷氨酰胺酶修饰可以有效地扩展羽扇豆蛋白质的功能pH范围。另外，在pH 5（接近等电点）时，TG处理对两种蛋白质类型产生了不同的影响。对于WLPI，酶修饰提高了乳化性能，使液滴大小从大约18 μm（天然蛋白质稳定的乳液）减小到9–12 μm，提高了35–50%。相比之下，BLPI在TG处理后的性能下降，液滴大小从天然蛋白质的较小尺寸（10 μm）增加到所有测试酶浓度下的较大尺寸（10–14 μm）。这种在pH 5时的物种特异性差异直接与其不同的溶解性结果相关（表1），BLPI在较高酶浓度下完全不溶解，而WLPI则保持部分溶解性。TG修饰蛋白质在pH 5下的有限效果主要是由蛋白质本身的溶解性限制的，而不是由于酶交联不足。SDS-PAGE分析（图2）证实了在修饰步骤中TG催化了交联；然而，当这些交联蛋白质在pH 5下分散时，高分子量聚集体在等电点附近表现出较差的溶解性，导致沉淀并减少了油水界面的蛋白质可用性。等电点处的最小静电排斥作用（图1）消除了基于电荷的稳定作用，使得更多依赖于空间效应和蛋白质在界面处的可用性。对于BLPI，严重的聚集和沉淀限制了蛋白质在界面处的覆盖能力，而聚合的WLPI则保持了部分溶解性，从而继续具有较低的乳化能力（Jiang et al., 2019）。在pH 7时，两种天然蛋白质都表现出良好的乳化能力，产生了小液滴（约5 μm），而TG处理则产生了相反的效果。WLPI的液滴大小从大约5 μm（天然状态）增加到所有酶浓度下的8–12 μm，液滴直径增加了60–140%。尽管液滴大小增加，乳液稳定性仍然很高，这表明虽然初始液滴形成受到干扰，但乳化后的油滴在30分钟后仍然稳定。同样在pH 7时，BLPI对酶修饰具有耐受性，仅从约5 μm（天然状态）略微增加到约6 μm（所有酶浓度下）。WLPI在pH 7时液滴形成能力的下降，尽管溶解性适中，表明交联可能降低了蛋白质吸附速率或均质化过程中所需的界面重排（Nivala et al., 2021）。在pH 9时，TG处理对乳化性能的影响很小，所有样品（无论是天然还是修饰的）都产生了均匀的小液滴，尺寸在4–6 μm范围内。这种在所有条件下的一致性，无论蛋白质类型或酶浓度如何，表明pH 9时的强负电荷（-20至-30 mV，图1）可能主导了乳化机制。高静电排斥作用使得在均质化过程中液滴能够有效破裂，并防止了聚集。这种高溶解性（表1）也确保了足够的蛋白质可用性以快速覆盖界面。结果表明，在pH 9时，乳化性能主要由强静电排斥作用控制，而不是酶修饰，因为天然和TG处理的蛋白质都产生了相对较小的液滴（San et al., 2025）。这些发现表明，TG修饰可以显著增强羽扇豆蛋白质的乳化性能，但成功需要仔细控制酶浓度和系统pH值，以平衡交联的好处与溶解性限制。
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图4. pH值和酶浓度对转谷氨酰胺酶聚合羽扇豆蛋白分离物的乳化能力（A）和乳液稳定性（B）的影响。同一pH值内带有不同上标的值通过单因素方差分析和Duncan多重范围测试显著不同（p < 0.05）。WLPI-白色羽扇豆蛋白分离物；WT5U-白色转谷氨酰胺酶5单位；WT10U-白色转谷氨酰胺酶10单位；WT15U-白色转谷氨酰胺酶15单位；WT20U-白色转谷氨酰胺酶20单位；WT25U-白色转谷氨酰胺酶25单位；BLPI-蓝色羽扇豆蛋白分离物；BT5U-蓝色转谷氨酰胺酶5单位；BT10U-蓝色转谷氨酰胺酶10单位；BT15U-蓝色转谷氨酰胺酶15单位；BT20U-蓝色转谷氨酰胺酶20单位；BT25U-蓝色转谷氨酰胺酶25单位。
3.7. 乳液的微观结构
CLSM图像提供了TG处理在整个pH范围内引起的乳液微观结构变化的直接视觉证据，通过双荧光标记可以观察到明显的蛋白质-油界面排列（图5）。在pH 3时，两种天然蛋白质（WLPI和BLPI）都表现出不均匀的液滴大小分布，特征是许多大液滴（黄色/橙色荧光表示油）。相比之下，WT5U和BT5U显示出明显改善的均匀性，液滴较小且分布均匀。这一视觉确认与pH 3时观察到的液滴大小定量减少一致（图4A）。这一结果与TG修饰通过改善界面稳定性来增强均质化过程中的液滴破裂并限制聚集一致（Kamiya et al., 2009）。围绕油滴的绿色荧光代表FITC标记的蛋白质，在酶处理样品中显得更强烈且连续，表明交联后在油水界面形成了更厚、更紧密的蛋白质膜（Kamiya et al., 2009）。在pH 5时，结果揭示了不同蛋白质类型之间的差异，这与它们的乳化行为一致。WLPI样品即使在酶处理后（WT5U）也保持了相对分散的液滴结构，油滴周围有可见的蛋白质覆盖（绿色），与定量测量的液滴大小改善一致。相比之下，BLPI和BT5U表现出广泛的液滴聚集和聚集，形成了大的不规则油域，蛋白质覆盖不完全，视觉上证实了在等电点处的乳化性能较差（Tang, 2017）。BT5U样品中绿色荧光强度的降低表明由于溶解性研究中观察到的广泛沉淀，界面处的蛋白质可用性有限（表1），导致油滴无法充分防止聚集（Tang, 2017）。pH 7的图像揭示了进一步解释定量结果的微观结构特征。尽管WLPI在处理后显示出液滴大小增加（图4A），但WT5U样品在整个连续相和液滴界面显示出广泛的蛋白质覆盖（亮绿色荧光）。这表明虽然交联可能损害了初始乳化过程（导致液滴变大），但它创建了蛋白质网络，可以通过在液滴之间形成凝胶状基质来提供长期稳定性（Kamiya et al., 2009）。BLPI样品在pH 7时保持了更离散的液滴结构，天然和处理后的样品中都有清晰的蛋白质层围绕单个油滴，支持图4A中观察到的最小尺寸变化。在pH 9时，所有样品都表现出均匀的微观结构，特征是小的、分离良好的液滴，具有明显的蛋白质界面层，无论TG处理如何。整个水相中的亮绿色连续荧光表明蛋白质溶解性高，即使在高度交联的样品中也能确保足够的材料用于界面覆盖。CLSM分析显示，TG修饰不仅影响液滴大小，还改变了乳液中的蛋白质组织。在电荷足够的pH值（pH 3和9）下，酶处理增强了界面膜的厚度，而不影响液滴分散。然而，在接近等电点（pH 5）时，物种特异性的聚集行为变得明显，BLPI显示出聚集，而WLPI保持了轻微的功能性。
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图5. 羽扇豆蛋白分离物和转谷氨酰胺酶聚合羽扇豆蛋白分离物的共聚焦激光扫描显微镜图像。图中的刻度条代表40 μm的长度。WLPI-白色羽扇豆蛋白分离物；WT5U-白色转谷氨酰胺酶5单位；BLPI-蓝色羽扇豆蛋白分离物；BT5U-蓝色转谷氨酰胺酶5单位。
3.8. 凝聚和聚集指数
凝聚表示液滴可逆地聚集成团簇，而聚集涉及液滴的不可逆融合和随后的相分离。这两个过程都强烈依赖于pH值，聚集稳定性取决于界面蛋白质膜的强度和完整性。凝聚（FI）和聚集指数（CI）揭示了与表面电荷和酶交联效应直接相关的乳液不稳定机制（图6）。在pH 3时，天然蛋白质（WLPI和BLPI）主要显示负的FI值，表明由于带正电的蛋白质表面的强静电排斥作用，液滴聚集受到限制。然而，TG处理的样品显示出显著增加的FI值，表明酶交联促进了液滴之间的桥接凝聚。这一现象与乳清蛋白系统中的观察结果相似，其中TG处理通过形成蛋白质网络增强了液滴之间的相互作用，形成了物理连接的凝胶状结构，从而防止了起泡（Palazolo et al., 2005）。重要的是，在pH 3时，所有样品的CI值都保持较低，表明尽管液滴可能通过凝聚聚集，但坚固的交联界面膜有效地防止了不可逆的聚集，这是乳液稳定性的关键参数。在pH 5时，两种蛋白质类型都显示出升高的FI和CI值，BLPI表现出不稳定性。接近等电点时，接近零的净表面电荷消除了静电排斥作用，使得液滴快速聚集并随后聚集。pH 5时FI和CI的同时增加表明了一个两阶段的不稳定过程：最初由静电排斥的消除驱动的凝聚，随后由于吸引性的范德华力超过减弱的空间障碍而发生聚集（Tran & Rousseau, 2013）。对豌豆蛋白乳液的研究也显示了类似的pH依赖性行为，最大不稳定性发生在pI附近，此时蛋白质聚集损害了界面保护（Opazo-Navarrete et al., 2022）。pH 7的结果揭示了物种特异性差异。BLPI保持了相对较低的FI和CI值，表明在中性pH下具有稳定的分散性，这与足够的静电排斥作用一致。然而，WT5U显示出升高的FI和较低的CI值，表明有控制的凝聚而没有聚集，可能代表了形成稳定的凝聚网络。对猪肌纤维蛋白的研究表明，中性pH下的TG处理通过创建交联蛋白质网络提高了乳液稳定性，尽管有可见的凝聚，但仍能防止起泡（Chukwuejim & Aluko, 2024）。这些发现表明，当界面膜保持完整时，凝聚并不一定表示不稳定性（Chukwuejim & Aluko, 2024）。某些样品在pH 7时CI的增加可能反映了界面完整性的受损，其中交联损害了蛋白质的灵活性，这是有效界面稳定所需的。在pH 9时，FI值在所有样品中在正负值之间波动，而CI值表现出显著变化。高负表面电荷（-20至-30 mV）提供了强的静电稳定作用，即使在发生中等程度凝聚的情况下也防止了聚集。对蚕豆TG修饰蛋白质的研究表明，在pH 6.5及以上时，交联效率提高，乳液稳定性增强，这与当前观察结果一致，即pH 9下的酶处理尽管有凝聚，但仍能保持低聚集（Nivala et al., 2021）。这些发现表明，乳液稳定性取决于凝聚倾向和聚集抵抗之间的平衡，pH值调节了静电和空间稳定机制。在TG处理样品中观察到的聚集减少，特别是在静电排斥适中的pH值时，这与交联增强了界面蛋白质网络一致；然而，在等电点附近，其有效性受到限制，因为基本的电荷稳定性缺失。
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图6. pH值和酶浓度对转谷氨酰胺酶聚合羽扇豆蛋白分离物的A：凝聚指数和B：聚集指数的影响。在同一pH值范围内，具有不同上标的数值通过单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重范围检验被确定为显著不同（p < 0.05）。WLPI：白色羽扇豆蛋白分离物；WT5U：白色转谷氨酰胺酶5单位；WT10U：白色转谷氨酰胺酶10单位；WT15U：白色转谷氨酰胺酶15单位；WT20U：白色转谷氨酰胺酶20单位；WT25U：白色转谷氨酰胺酶25单位；BLPI：蓝色羽扇豆蛋白分离物；BT5U：蓝色转谷氨酰胺酶5单位；BT10U：蓝色转谷氨酰胺酶10单位；BT15U：蓝色转谷氨酰胺酶15单位；BT20U：蓝色转谷氨酰胺酶20单位；BT25U：蓝色转谷氨酰胺酶25单位。
4. 结论
本研究证实，转谷氨酰胺（TG）修饰是一种可行的酶法方法，可以增强羽扇豆蛋白分离物的乳化性能，但其效果严重依赖于物种选择、酶浓度和pH条件。共价ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸交联的形成成功生成了高分子量聚合物，这些聚合物的二级结构发生了变化，在中等酶浓度下，从主要以β-折叠构象转变为α-螺旋含量增加。然而，在较高酶浓度（20–25 U/g）下，广泛的交联会导致β-折叠结构的聚集，从而降低溶解性和功能性，尤其是在等电点附近。TG修饰蛋白在pH 3时的表现更为优异，表现为液滴尺寸显著减小和稳定性提高，这表明它们特别适合用于酸性乳化食品系统，如沙拉酱、酸化饮料和发酵乳制品替代品。在pH 9时，静电稳定机制占主导地位，使得酶修饰的作用变得相对次要，尽管蛋白质的溶解性和可用性仍然很好。微观结构分析显示，TG处理改变了蛋白质在乳液中的排列方式，增加了界面膜的厚度，并形成了连续相网络，提供了互补的稳定机制。在某些pH值下，絮凝与聚集的分离表明，通过蛋白质网络形成控制液滴聚集并不一定会影响乳液的稳定性，前提是界面膜保持完整。然而，需要注意的是，TG修饰的羽扇豆蛋白在等电区域（pH 4–6）附近存在显著限制，此时溶解性降低和交联聚集物的沉淀会损害其乳化功能；因此，不建议在这一pH范围内使用。最有效的物种-酶组合取决于pH值，物种选择应基于目标食品应用的pH值。这些发现为优化TG处理条件提供了合理的框架，表明中等酶浓度（10–15 U/g）应用于羽扇豆蛋白分离物是开发在酸性或碱性pH下具有高性能的植物基乳化剂的最有前景的方法。未来的研究应探讨这些修饰蛋白制成的食品产品的长期储存稳定性、热加工抗性以及感官特性，以促进其在可持续植物基食品系统中的商业化应用。
伦理声明
本研究未涉及人类参与者、实验动物或需要伦理批准的程序。
作者贡献声明
Stanley Chukwuejim：撰写——原始草稿、验证、方法学、实验设计、数据分析。
Rotimi E. Aluko：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资源管理、项目协调、方法学、资金获取、概念构思。
