原始淀粉降解淀粉酶针对玉米淀粉颗粒进行底物靶向水解的机制

钟玲莉|常文明|杨凯|姜松辰|林瑾|舒一飞|钟玉坤|唐泽豪|叶先锋|季晏玲|张磊|黄燕|崔中丽|李中秋

中国农业部农业环境微生物学重点实验室，南京农业大学生命科学学院，南京，210095，中国

摘要

在我们之前的研究中，通过 truncation CBM20 功能域，原始淀粉降解酶 AmyM 的底物偏好从直链淀粉转变为支链淀粉的双螺旋区域，显著增强了玉米淀粉颗粒的水解作用。在本研究中，正常玉米淀粉被 AmyM 及其截短后的变体 AmyM-TR2 分别在相同的水解程度（DH 15%、25% 和 45%）下进行水解。AmyM 使直链淀粉含量从 39.8% 降至 35.8%，然后又升至 41.1%；而 AmyM-TR2 则表现出相反的趋势，在 T-25 条件下直链淀粉含量最高达到 44.0%。AmyM 广泛水解支链淀粉 B1 链，并将快速消化淀粉含量从 56.4% 降低到 45.1–46.8%，从而促进了链的重排和部分有序结构的恢复。相比之下，AmyM-TR2 优先切割与双螺旋结构相关的长 A 链和短 B1 链，使得缓慢消化淀粉含量在 T-25 条件下降至 19.3%，并导致持续的结构破坏。这两种不同的作用机制导致了不同的糊化及回生行为。尽管如此，这两种酶对玉米淀粉颗粒的修饰都遵循一个两阶段渐进式修改模式，其中主要调控机制从早期的表面成分重塑转变为后期的分子组成和内部结构的协同调控，这为酶修饰淀粉中成分、结构和功能的耦合演化提供了见解。

引言

酶修饰为克服天然淀粉在工业应用中的固有局限性提供了一种选择性和可控的策略，最小化了不必要的副产品，同时满足了清洁标签和可持续加工的需求（Miao & BeMiller, 2023）。与传统糊化淀粉的修饰方法相比，酶修饰可以避免耗能高的糊化过程以及粘稠糊状物的处理问题，尽管由于酶的作用受限，这种方法更具挑战性（Liu et al., 2020; Roy et al., 2021）。原始淀粉降解酶（RSDEs）因其能够直接作用于未糊化的淀粉颗粒而成为酶修饰的重要工具（Sun et al., 2010）。已有多种酶被报道具有对淀粉颗粒的水解活性，并能促进多孔淀粉的形成，包括 α-淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、分支酶、环麦芽寡糖葡聚糖转移酶和麦芽生成淀粉酶（Benavent-Gil & Rosell, 2017a; Keeratiburana et al., 2020）。在许多情况下，水解反应从颗粒表面开始，随着孔洞的加深和扩大而逐渐向内部扩展（Chen & Zhang, 2012; Guo et al., 2020）。这种可控的表面和内部侵蚀过程形成了多孔结构，同时保留了颗粒的框架（Yamada et al., 1995），从而扩展了其在食品、制药、化工和化妆品行业的应用（Choi et al., 2022; Jiang et al., 2014; Li, Chen et al., 2025; Wang et al., 2022）。例如，在食品领域，多孔淀粉作为风味物质、油脂、生物活性食品成分和益生菌的吸附/包载载体具有重要意义，其高负载能力、保留稳定性和控制释放性能尤为关键（Benavent-Gil et al., 2018; Ubeyitogullari et al., 2022）。在制药应用中，多孔淀粉可作为难溶性药物或靶向结肠药物的生物降解载体，其中药物装载效率、加工/储存过程中的保护作用以及释放行为是关键性能指标（Li, Xin, et al., 2025; Zhao et al., 2022）。

与糊化淀粉系统相比，酶修饰对淀粉分子结构的影响较小，但仍能显著改善其功能特性，如增强吸附能力、改善凝胶性能、延缓回生以及提高冻融稳定性（Pawitra et al., 2025; Zhong et al., 2022）。此外，由于淀粉颗粒具有复杂的多尺度结构，不同的水解策略（如改变酶剂量或延长水解时间）即使使用相同的酶也可能导致不同的结构和功能结果（Zhang, Bai, et al., 2025）。因此，酶修饰淀粉的功能特性受更复杂的机制调控。然而，目前关于多孔淀粉的研究主要集中在孔隙形态、吸附性能以及产品的相关应用特性上。同时，由于淀粉颗粒内部链的构象复杂性，不同 RSDE 对淀粉颗粒的微观分子作用机制仍不明确（Tian et al., 2023）。因此，不同 RSDE 的作用模式、淀粉组成/结构重塑及其产生的功能特性之间的联系仍大多未知，这限制了酶修饰淀粉的应用研发和精确的功能调控。

玉米淀粉是最丰富且成本效益最高的淀粉来源之一，因其良好的颗粒结构和广泛的工业应用性而被广泛用于多孔淀粉的制备（Sujka & Wiącek, 2024）。在我们之前的研究中，α-淀粉酶 AmyM 能够高效水解原始玉米淀粉并将其转化为多孔淀粉（Zhang et al., 2021）。最近的研究表明，截短 AmyM 的 CBM20 功能域可将其对小麦和玉米淀粉颗粒的水解效率提高30倍以上。结合实验结果表明，截短后的 AmyM-TR2 变体中 CBM20 域的暴露使得底物靶向作用从直链淀粉转向支链淀粉的双螺旋区域（Zhong et al., 2026），而野生型 AmyM 的 CBM20 功能域则倾向于直链淀粉的结合和水解。

鉴于 RSDE 的作用模式对淀粉颗粒的分子特征、层状结构和物理化学性质有重要影响（Punia Bangar et al., 2022），AmyM 和 AmyM-TR2 为研究不同的底物靶向行为如何驱动淀粉的多尺度结构-功能演化提供了合适的模型。因此，本研究中使用正常玉米淀粉作为代表性颗粒底物。系统地研究了 AmyM 和 AmyM-TR2 在不同水解程度下对淀粉颗粒的组成、微观结构、分子有序性、消化性和物理化学性质的影响，以阐明酶修饰淀粉中成分、结构和功能的耦合演化。

部分摘要

材料

正常玉米淀粉购自 Yuanye Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）。α-淀粉酶 AmyM 及其截短突变体 AmyM-TR2 如前所述在 Pichia pastoris GS115 中制备（Zhoukun et al., 2018）。商业用猪胰 α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶和异淀粉酶购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。本研究中使用的所有化学品均来自中国上海的 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.

为了研究...

观察了用 AmyM 或 AmyM-TR2 进行酶处理后的玉米淀粉颗粒的形态。SEM 显示，原生玉米淀粉颗粒通常是多边形，表面光滑并含有少量小孔（图 1）。AmyM 和 AmyM-TR2 都导致了淀粉颗粒形态的渐进性变化（图 1），这些变化与已有研究结果一致（Guo et al., 2020）。然而，当水解程度（DH）增加到 45% 时...

新型多功能酶能够选择性地重塑淀粉的分子组成和结构，从而调节其物理化学性质。尽管在酶修饰的糊化淀粉系统中结构-性质关系已得到广泛研究，但酶特异性水解行为、多尺度结构演化以及颗粒淀粉的功能转化之间的联系仍不清楚（Punia Bangar et al., 2022; Zhong et al., 2022）。在本研究中...

基于我们之前对 AmyM 和 AmyM-TR2 对淀粉颗粒不同底物靶向行为的机制解析，本研究进一步表明，这两种 RSDE 由于界面催化作用的不同，产生了具有不同功能特性的改性玉米淀粉。通过将淀粉的多尺度结构变化与宏观功能特性联系起来，这项研究揭示了尽管水解模式不同，AmyM 和 AmyM-TR2 仍遵循类似的...

钟玲莉：撰写——原始草案，可视化，方法学。常文明：监督，软件，方法学。杨凯：软件，方法学。姜松辰：方法学。林瑾：方法学。舒一飞：方法学。钟玉坤：方法学。唐泽豪：方法学。叶先锋：监督，资源获取。季晏玲：验证，软件。张磊：验证，资金获取。黄燕：监督，研究，资金获取。崔中丽：资源，项目

作者声明本研究在不存在任何可能构成利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。

作者感谢江苏省自然科学基金（L.Z. 获得资助（项目编号：BK20251549）；江苏省优秀博士后人才资助计划（L.Z. 获得资助，项目编号：2025ZB725）。