酶的活性位点在不同物种中具有保守的残基。在某些酶类中，这些残基不仅对酶的活性至关重要，还对酶的稳定性、正确折叠和寡聚化有重要影响[1]。某些多聚体酶的活性位点位于不同亚基的界面。这些界面残基可能同时参与催化作用和亚基间相互作用，从而促进与底物的协同作用，提高酶活性。腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）就是这样一个例子，它在从头合成途径和嘌呤回收途径中都起着关键作用，最终合成核苷酸[2]，[3]。腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL，E.C. 4.3.2.2）属于延胡索酸酶超家族。该家族的成员包括天冬氨酸酶、II类延胡索酸酶、精氨酸琥珀酸裂解酶和δ-晶体蛋白[4]。
在许多原生动物寄生虫中，ADSL被视为潜在的药物靶点，因为这些寄生虫严重依赖人类宿主提供嘌呤，因为它们无法从头合成嘌呤。利什曼病由Leishmania属寄生虫引起，是全球性的健康问题，有超过3.5亿人面临风险[5]。这种疾病的症状从皮肤病变到内脏利什曼病不等[6]。这些寄生虫已经对现有的抗利什曼病药物产生了抗性，而这些药物既有毒性又昂贵[7]，[8]，[9]。因此，寻找更好的药物和确定药物靶点也非常重要。在这种情况下，可以探索宿主和寄生虫之间代谢途径的差异，以发现和鉴定新的药物靶点。嘌呤核苷酸的生物合成是区分利什曼病寄生虫和人类宿主的最显著代谢途径之一[10]，[11]。
在本研究中，我们使用Leishmania donovani的腺苷酸琥珀酸裂解酶（LdADSL）作为模型系统，研究参与活性位点形成和亚基间相互作用的残基的作用。了解腺苷酸琥珀酸裂解酶的结构-功能关系非常重要，因为它在嘌呤代谢中起着核心作用，并对利什曼虫的生存至关重要。寄生虫和宿主ADSL在寡聚化、活性位点结构和亚基间相互作用方面的差异使其成为结构导向的抗利什曼病药物开发的有希望的靶点。LdADSL与AMP结合的晶体结构已经公布（PDB代码：4MX2）。LdADSL是一个同源四聚体，每个活性位点由三个不同亚基共同形成。在这项研究中，我们选择了一个链ID为A/B/E/F的LdADSL四聚体（图1），它有三个稳定的界面：A/B、A/E和A/F（图S1A、B和C）。A/B界面区域比其他界面更大。每个亚基都折叠成三个不同的结构域：N端的D1域、中央的螺旋D2域和C端的D3域（图1B）。D2域（来自三个不同的亚基（此处为A/B/F）和灵活的C3环区域）组织了位于LdADSL界面上的四个活性位点。C3环在底物结合时会发生结构变化（从开放到闭合），这对催化机制至关重要（图1C，闭合形式）。早期对B. subtilis的ADSL进行的亚基互补研究表明，这三个亚基各自向活性位点贡献了一个或多个氨基酸残基[12]，[13]，[14]。不同亚基的活性位点残基与其底物（SAMP）之间的各种相互作用可能稳定并增强对底物的亲和力，从而保证酶的正常功能。我们小组之前的研究确定，位于A/B亚基二聚体界面上的Arg40形成了两个亚基间的盐桥，并且还与AMP相互作用，是维持LdADSL活性和稳定性的关键残基[15]。
在本研究中，我们研究了位于四聚体界面上的三个催化位点残基Glu334、Asn335和Arg370对LdADSL活性和稳定性的影响。这些残基分别被突变为Gln、Tyr和Glu，以破坏亚基间相互作用和活性。随后使用生化、生物物理和计算方法对这些突变体进行了表征，以评估它们对LdADSL活性和稳定性的影响。我们的结果表明，所有三种突变都降低了LdADSL的催化活性、亲和力和稳定性。
