甲烷氧化菌（methanotrophs）主要以甲烷为碳源和能源，但在无甲烷氧化的条件下利用甲醇同化会导致NADH积累引起的氧化还原失衡。本研究以Ⅰ型甲烷氧化菌Methylomonassp. DH-1为对象，发现甲醇诱导的氧化还原胁迫会激活全局性氧化还原感受器RegB/RegA双组分系统（two-component system）。甲醇触发RegB向RegA的磷酸转移级联反应，导致RegA依赖的feo操纵子表达上调并促进亚铁摄取。该铁摄取过程对甲醇生长至关重要，因为它支持含[4Fe-4S]簇的Na+-转运NADH:泛醌还原酶（Na+-NQR）功能，该酶负责NADH氧化。编码Na+-NQR复合体的操纵子在RegA非依赖的情况下被上调。上述结果表明，RegB/RegA系统可感知氧化还原失衡并促进铁摄取，从而通过Na+-NQR介导的NADH再氧化恢复氧化还原稳态，揭示了甲烷氧化菌在甲醇代谢过程中维持氧化还原平衡的关键适应性策略。
本研究发表于《Applied and Environmental Microbiology》，针对甲烷氧化菌在甲醇代谢过程中的氧化还原失衡机制展开系统性探索。甲烷作为廉价且还原性强的工业原料，其生物转化具有温和条件优势，但甲醇代谢因缺少甲烷单加氧酶（methane monooxygenase, MMO）消耗电子的步骤，易导致细胞内NADH过量积累，引发氧化还原胁迫。尽管RegB/RegA双组分系统在多种细菌中已被证实参与氧感知及氧化还原调控，其在甲烷氧化菌中的作用机制此前尚未被阐明。研究人员以Ⅰ型甲烷氧化菌Methylomonassp. DH-1为模型，首次揭示该系统在甲醇代谢中通过调控铁摄取维持氧化还原稳态的分子机制，为工程菌株优化提供了理论基础。
研究中采用的主要技术方法包括：以野生型Methylomonassp. DH-1及系列基因缺失株（ΔregA、ΔregB/A等）为实验材料，构建特定位点突变回补菌株；通过转录组测序（RNA-seq）比较甲烷与甲醇条件下的差异表达基因；利用染色质免疫共沉淀（ChIP）结合定量PCR验证转录因子RegA与靶基因启动子的直接结合；采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定细胞铁含量；使用NAD+/NADH检测试剂盒量化细胞内氧化还原状态。
RegB/A系统调控Methylomonassp. DH-1的甲醇代谢**
序列分析显示Methylomonassp. DH-1的RegB与RegA保留了保守的功能域，包括RegB的泛醌结合域（GGASNPI）、自磷酸化位点（His239）及RegA的磷酸化位点（Asp59）。表型分析表明，ΔregA突变体在甲醇条件下生长严重受损，而在甲烷条件下影响较小。进一步构建信号通路阻断突变体发现，RegB自磷酸化（RegBH239A）与RegA磷酸化（RegAD59A）的失活均导致甲醇生长缺陷，而泛醌结合域缺失（RegBΔUBD）不影响甲醇生长，提示甲醇条件下RegB活性不依赖泛醌抑制的解除，而是维持基础激酶活性以完成磷酸传递。
RegA在甲醇培养中上调铁摄取相关基因
RNA-seq分析筛选到56个受RegA调控的差异表达基因，其中tonB操纵子、TonB依赖性铁载体受体（TBDR）基因及feo操纵子显著上调。qRT-PCR验证了这些基因在ΔregA中表达下降，ChIP实验证实RegA直接结合feo操纵子启动子，而对tonB与tbdr的调控为间接作用。ICP-MS结果显示甲醇培养的细胞铁含量显著高于甲烷培养，表明甲醇代谢增加了细胞对铁的需求。
Feo系统介导的铁摄取对甲醇代谢至关重要
培养基铁源剥夺实验表明，缺乏Fe3+（而非Fe2+）会严重抑制甲醇生长，提示外源Fe3+需被还原为Fe2+后由Feo系统转运至胞内。单独敲除tbdr或tonB未显著影响生长，可能由于基因组中存在同源基因代偿；而feo操纵子敲除尝试失败，暗示其对基本生存必不可少。在ΔregA背景下过表达feo操纵子可恢复甲醇生长缺陷，证明Feo系统是RegA调控甲醇代谢的关键下游效应器。
含[4Fe-4S]簇的Na+-转运NADH:泛醌还原酶对甲醇代谢至关重要
转录组分析发现甲醇条件下Na+-NQR操纵子显著上调，且该上调不依赖RegA。敲除Na+-NQR操纵子导致甲醇完全不能生长，即使在低浓度甲醇下也无法存活，而甲烷条件下仅轻微受损。NAD+/NADH比值测定显示，甲醇培养下ΔregA突变体的NADH积累程度远高于野生型，证实RegA通过促进铁摄取保障Na+-NQR活性，从而缓解NADH过剩引发的氧化还原胁迫。
在讨论部分，研究人员指出，甲烷氧化菌的氧化还原平衡对其代谢至关重要，甲醇代谢因缺乏MMO的电子消耗步骤而易致NADH积累。本研究首次在甲烷氧化菌中发现RegB/A系统响应甲醇诱导的氧化还原胁迫，通过直接激活feo操纵子增强Fe2+摄取，以支持含[4Fe-4S]簇的Na+-NQR介导的NADH再氧化。这一机制与光合细菌中RegB/A的氧感应功能不同，体现了其在不同生理环境下的调控多样性。此外，Methylomonassp. DH-1仅含颗粒状MMO（particulate MMO, pMMO），其电子传递依赖泛醌还原途径，更易受NADH积累影响，因此Na+-NQR作为早期氧化还原缓冲系统尤为重要。研究还发现Na+-NQR广泛存在于含pMMO的甲烷氧化菌中，而在仅含可溶性MMO（soluble MMO, sMMO）的种类中缺失，提示其与pMMO主导的代谢模式相适应。该研究阐明了RegB/A系统协调铁摄取与甲醇代谢的分子联系，为构建高效C1生物转化平台提供了理论依据。
