传统的全细胞生物传感器通常作为“一种分析物，一个传感器”的系统运行，以确保高特异性，这依赖于转录调节蛋白级联来诱导报告基因的表达，从而导致需要开发不同的传感器系统来监测多种目标物质。为了解决这一限制并拓宽分析物检测能力，研究人员开发了一个模块化生物传感平台，该平台将一个关键代谢物响应的生物传感器与各种底物特异性酶耦合，以检测一系列目标分子。研究表明，将通用的过氧化氢（H2O2）响应生物传感器与葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD）、尿酸氧化酶（Uricase）和胆固醇氧化酶（Cholesterol oxidase, COD）集成，能够检测三种临床相关的生物标志物：葡萄糖、尿酸和胆固醇。在底物特异性酶转化后，这三种生物标志物生成H2O2，从而触发H2O2响应生物传感器恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440[pPahpc]中luxCDABE报告基因簇的表达并产生生物发光。该系统已证明对葡萄糖（10–200 µM）、尿酸（5–125 µM）和胆固醇（1.25–100 µM）的灵敏检测。对17份临床尿液标本的验证证实了该系统在定量葡萄糖和尿酸方面的可靠性，从而确立了其潜在的诊断效用。
论文解读：底物特异性酶与过氧化物生物传感器的集成用于检测葡萄糖、尿酸和胆固醇
研究背景与意义
随着生活水平的提高，糖尿病、心血管疾病和高尿酸血症等代谢性疾病的发病率在现代社会中逐渐增加，严重威胁着人们的健康。糖尿病病理生理表现为胰岛素调节异常及随后的高血糖，可升级为多系统并发症；高胆固醇血症是动脉粥样硬化心血管疾病和脑血管事件的关键病因；尿酸（UA）浓度是慢性肾病进展和痛风的临床确证指标。目前，这三种疾病生物标志物（葡萄糖、胆固醇和尿酸）的检测主要依赖血液样本，这是一种侵入性操作且通常需要专门设备。随着全球代谢性疾病负担的持续增加，对能够实现早期临床干预和改善疾病管理的实时、非侵入性监测方法的需求日益增加。
传统的全细胞生物传感器（Whole-cell biosensors）通常作为“一种分析物，一个传感器”的系统运行，以确保高特异性，这依赖于转录调节蛋白级联来诱导报告基因表达，导致需要为不同目标物质开发不同的传感器系统，耗费大量工程努力和资源，限制了实际部署。为了应对这一挑战，研究人员通过将通用信号转duct通路与多种底物特异性氧化酶集成，使得在单一生物传感平台内能够同时量化不同的分子靶标。该研究发表于《应用与环境微生物学》（Applied and Environmental Microbiology），提出了一种创新的多重检测系统，利用H2O2响应的全细胞生物传感器，能够顺序分析葡萄糖、尿酸和胆固醇。该方法利用通过特定底物的酶氧化产生的H2O2作为通用信号分子。通过使用单一生物传感器平台与多个酶系统耦合来检测不同的分析物，可以显著降低传感器设计和验证相关的时间与成本。该平台在临床相关灵敏度上表现出色，检测限（LoD）分别为葡萄糖<20 µM、尿酸<10 µM、胆固醇<5 µM，均超过人类尿液中的病理阈值，响应时间小于30分钟，能够实现家庭和临床环境下的即时检测（POCT）。
主要关键技术方法
研究人员采用了一种模块化生物传感策略，将通用的H2O2响应全细胞生物传感器恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440[pPahpc]（含有Pahpc启动子，可感应H2O2并表达luxCDABE报告基因簇）与三种底物特异性氧化酶——葡萄糖氧化酶（GOD, EC 1.1.3.4）、尿酸氧化酶（Uricase, EC 1.7.3.3）和胆固醇氧化酶（COD, EC 1.1.3.6）——分别耦合，构建了GluBio、UABio和CholBio检测试剂盒。通过优化培养基（采用含20 mM柠檬酸盐的 minimal medium-citrate, MMC）降低背景发光，并确定各氧化酶的最佳工作浓度。研究通过梯度浓度分析物（葡萄糖、尿酸、胆固醇）验证了检测线性范围和LoD。临床验证方面，研究收集了17份来自苏州大学附属第四医院内分泌科的尿液样本（13份来自糖尿病患者，4份来自非糖尿病对照），使用开发的GluBio和UABio试剂盒进行检测，并与市售商业化检测试剂盒进行平行测量比对。
研究结果
检测多种小分子 using an H2O2全细胞生物传感器
研究人员首先评估了KT2440[pPahpc]生物传感器对H2O2的浓度依赖性响应范围和检测限（LoD）。结果显示，在LB培养基中，该生物传感器在5–500 µM范围内对H2O2检测表现出线性响应，标准化测定条件下LoD为10 µM。对照实验表明，含相同报告基因luxCDABE的水杨酸生物传感器ADPWH_salA和野生型恶臭假单胞菌KT2440均不会对H2O2产生发光响应，证实了KT2440[pPahpc]对H2O2的高特异性。随后，研究人员开发了三种酶偶联系统：GOD偶联葡萄糖检测（GluBio）、尿酸氧化酶偶联尿酸检测（UABio）和COD偶联胆固醇检测（CholBio）。为解决LB培养基中基线发光过高的问题，研究人员通过碳源优化策略，确定含20 mM柠檬酸盐的最小培养基（MMC）为标准培养条件，可增强生长并最小化生物发光背景。在MMC中，KT2440[pPahpc]对H2O2的线性检测范围为20–500 µM，诱导30分钟后，对数H2O2浓度与单位光密度发光值（Lum/OD600）间建立线性关系（R² = 0.98），为下游检测奠定了基础。
优化 GluBio, UABio, 和 CholBio 检测试剂盒 用于检测葡萄糖、尿酸和胆固醇
研究人员进行了GOD（0.2, 1, 4, 10 U）、尿酸氧化酶（0.1, 0.2, 0.5, 1 U）和COD（0.1, 0.2, 0.5, 1 U）的剂量-响应实验。对于葡萄糖检测（GluBio），当补充1 U GOD时，在0–200 µM范围内Lum/OD600与对数葡萄糖浓度呈线性相关性（R² = 0.99），LoD为20 µM。对于尿酸检测（UABio），当补充0.2 U尿酸氧化酶时，在0–125 µM范围内Lum/OD600与对数尿酸浓度呈线性拟合（R² = 0.99），LoD为10 µM。对于胆固醇检测（CholBio），当补充0.5 U COD时，生物传感器在2.5–100 µM浓度范围内15分钟内表现出线性响应（R² = 0.98），LoD为5 µM。
使用替代 H2O2检测方法对葡萄糖、尿酸和胆固醇进行定量
为了验证目标底物氧化生成H2O2的动力学，研究人员使用标准化荧光法H2O2检测试剂盒（MAK165-1KT, Sigma-Aldrich）分别对三种酶进行单独测试。剂量-响应分析揭示了荧光强度与底物浓度之间的明显线性关系，检测范围分别为葡萄糖0–2.5 µM（R² = 0.994）、尿酸0–25 µM（R² = 0.972）和胆固醇0–5 µM（R² = 0.986）。这些结果证实了利用该生物传感器通过测量H2O2水平来确定葡萄糖、尿酸和胆固醇浓度的可行性。
使用 GluBio 和 UABio 检测试剂盒半定量尿液中的葡萄糖和尿酸
为评估临床可行性，研究人员使用GluBio检测试剂盒验证了人类尿液标本（n=2名志愿者）。动力学发光分析得出30分钟诱导样本的平均葡萄糖浓度分别为0.84 mM和0.99 mM，均在正常参考区间内。使用UABio检测试剂盒进行尿酸检测，计算得出男性尿液和女性尿液中的尿酸浓度分别约为1.94 mM和4.21 mM。使用市售葡萄糖/尿酸检测试剂盒的验证得出的浓度值分别为男性0.01 mM、女性1.6 mM（尿葡萄糖），以及男性1.82 mM、女性3.79 mM（尿酸），与生物传感器检测所得测量值高度一致，证实了GluBio/UABio试剂盒在人类尿液标本中进行临床级生物标志物定量的能力。
使用 GluBio 和 UABio 检测的临床前试验
研究人员进一步通过分析来自苏州大学附属第四医院的17份临床尿液样本（13份糖尿病患者，4份非糖尿病对照）评估了GluBio和UABio检测试剂盒的临床实用性。对于糖尿病患者尿液样本中的葡萄糖定量，GluBio试剂盒成功确认了部分患者的尿液葡萄糖浓度超过20 mM，且与市售试剂盒结果一致（例如浓度低于2 mM的样本均一致）。对于尿酸浓度检测，市售试剂盒与UABio试剂盒的结果在除1份样本（No. 15）外的所有样本中均一致（94%一致性，16/17）。唯一例外的样本可能因尿液中的干扰物影响了生物传感器的特异性或信号稳定性，导致结果差异。
讨论与结论总结
传统全细胞生物传感器通常为维持分析特异性而设计用于单底物检测，导致针对不同目标物质开发不同生物传感器时耗时耗力。该研究提出的多重检测系统利用H2O2作为通用信号分子，通过特定底物的酶氧化产生，采用单一生物传感器平台耦合多个酶系统检测不同分析物，显著减少了传感器设计和验证的时间与成本。该方法便于甚至对缺乏精确调节系统的化学物质进行快速生物传感，广泛适用于食品安全、环境监测和临床诊断等领域。
尿液因其非侵入性和易获取性，是富含葡萄糖和尿酸等疾病相关代谢物的首选诊断流体。研究人员评估了GluBio和UABio试剂盒对这些尿液生物标志物的定量能力，由于生理状态下尿液中不存在或结晶胆固醇，故未将胆固醇分析纳入尿液测试。该平台表现出临床意义的灵敏度，检测限分别为葡萄糖<20 µM、尿酸<10 µM、胆固醇<5 µM，均超过人类尿液中的病理阈值，且所有靶标的基线灵敏度高出200–1000倍。检测响应时间少于30分钟，支持家庭和临床点of-care测试。尽管医院收集的尿液样本因患者用药而成分复杂，部分甚至呈乳糜浑浊，但该试剂盒仍实现了准确检测，进一步证实了测定的稳健性。由于真实尿液样本的复杂性，GluBio和UABio检测结果更适合家庭环境中的定性评估（如确定葡萄糖和尿酸水平是否在正常范围内），未来可开发简单的尿液预处理试剂或装置以减少样本干扰物，提高检测精度。
该研究利用H2O2基生物传感器检测三种疾病代表了一个概念验证，展示了在医学诊断、食品安全和环境监测等不同领域的更广泛适用性，避免了开发多种传感器的时间和成本。未来有望将该生物传感技术与智能卫生系统集成，通过常规排泄实现实时多参数健康监测，并通过AI驱动决策支持系统分析纵向生理数据，提供个性化干预。
