细菌可采用多种策略抵御外界环境压力。其中，外膜（OM）与S层均为暴露于表面的结构层，功能存在重叠。尽管这两类结构的存在与组成早在数十年前已被阐明，但近期的研究进展使其生物学功能、组织结构及时空动态特征被重新认识。本文综述了关于这些包膜层的最新研究进展，重点关注其生物发生过程中涉及的生物学意义、分子组成、表面结构及时空模式的新见解。通过比较这两类系统，研究人员发现外膜与S层具有显著的共同特征，包括表面对称性及组装过程的时空协调性。本文还讨论了与这两类包膜层相关的未解问题，以及它们之间潜在的相互作用。理解这种相互作用有望揭示细菌细胞包膜组装与组织的基本原理，并为抗菌靶向治疗开辟新的途径。
Introduction
微生物表面是介导细胞存活及对抗菌药物敏感性的重要结构。细菌进化出不同的保护策略，形成了组成与组织各异的包膜结构。单膜细菌（monoderm bacteria）中，肽聚糖（PG）聚合物构成包围细胞质膜的厚细胞壁；双膜细菌（diderm bacteria）中，外膜包围含肽聚糖的周质、内膜与细胞质。对许多细菌而言，其最外层为由蛋白质阵列构成的S层，必须附着于下方的肽聚糖或外膜。S层在古菌中高度普遍，而在细菌中的分布呈斑片状且不连续，甚至在同一属内也存在差异。尽管S层与外膜存在明显差异，二者共享重要特征：均为平面层，组装后锚定至下方亚结构，且无法直接利用细胞能量；其组成蛋白均为丰度最高的蛋白类别之一，但具体作用尚未明确。自20世纪50年代被发现以来，二者的结构与功能一直难以解析。近年来分析方法的进步揭示了外膜结构组织与生物发生的新规律，本文探讨了这些进展对理解细菌S层的意义。
The asymmetric proteolipid outer membrane
S层完全由蛋白质构成，而外膜包含数百种蛋白质与多种脂质。外膜蛋白（OMPs）分为两类：β-桶状外膜蛋白与脂蛋白。脂蛋白经脂修饰后插入外膜的内叶或外叶；在大肠杆菌及其他变形菌中，多数脂蛋白位于内叶并暴露于周质；但许多双膜细菌拥有大量表面暴露的脂蛋白，包括S层蛋白（SLPs）。β-桶状外膜蛋白均含有8条及以上β-链，8链结构的中心孔被封闭，更大的β-桶状蛋白可调控小分子、DNA及蛋白质进入细胞环境，包括介导脂蛋白的穿膜转运。
双膜细菌的外膜可表达数百种不同蛋白，丰度极高。例如大肠杆菌中脂蛋白Lpp是丰度最高的蛋白，OmpA与OmpC/F等β-桶状外膜蛋白每个细胞可达数十万拷贝。高蛋白含量导致外膜的脂质-蛋白比极低。在许多双膜细菌中，磷脂仅存在于外膜内叶，外叶的脂质组分为脂多糖（LPS）。LPS是带有负电荷核心的大分子糖脂，连接6~7条酰基链，常延伸出长多糖区域；二价阳离子（如Mg2+）桥接相邻LPS分子，形成高效屏障，阻止疏水性分子（包括抗菌药物）进入。无LPS的菌种常含有特殊替代脂质，例如海栖热袍菌（Thermotoga maritima）含有跨膜的“恶魔酸”脂质，推测其低流动性可发挥类似LPS的作用，降低通透性并增加膜刚性。
结合磷脂与LPS的相对水平，估计外膜中每1个蛋白对应4个磷脂分子与2个LPS分子。纯化外膜的原子力显微镜（AFM）显示，三聚体β-桶状外膜蛋白形成紧密的六边形晶格，几乎无多余空间容纳脂质；体外显微与模拟显示β-桶状外膜蛋白间存在相互作用，全细胞显微则显示特定β-桶状外膜蛋白聚集为直径100~500 nm的“岛”。早期假说认为β-桶状外膜蛋白间的直接相互作用驱动外膜岛的形成，释放脂质以促进生物发生。但活细胞AFM显示，大肠杆菌表面90%以上被近乎固定的三聚体β-桶状外膜蛋白构成的不完美六边形晶格填充，晶格缺陷由嵌入的其他β-桶状外膜蛋白造成，剩余5%~10%的外膜由分离的LPS斑块占据。
目前认为大肠杆菌外膜是不对称蛋白脂质膜（APLM），而非嵌入蛋白的脂质双分子层。高蛋白质密度与不对称性在细菌界普遍存在：无LPS且与大肠杆菌进化距离遥远的海栖热袍菌中也观察到类似的致密蛋白晶格与脂质斑块排列；且三聚体β-桶状外膜蛋白并非LPS斑块或低扩散特性的必需组分，提示富含β-桶状外膜蛋白、运动受限的APLM及相分离的脂质斑块可能是双膜细菌外膜的近普遍特征。
活细胞AFM支持β-桶状外膜蛋白在APLM中基本固定：单粒子追踪（SPT）估算的二维扩散系数为10−2~10−5μm2s−1，但AFM测得的扩散系数低数个数量级，运动频率低于5 s−1，且高度受限，低于SPT的噪声阈值，解释了为何固定细胞与活细胞的SPT扩散常数无差异。LPS分子被β-桶状外膜蛋白捕获后也趋于固定，因此LPS斑块区域的流动性高于β-桶状外膜蛋白晶格区。β-桶状外膜蛋白晶格与LPS斑块形成的驱动力可能源于LPS在β-桶状外膜蛋白区域的静止性高于斑块区域，足以驱动相分离。
Bacterial S-layer proteins and outer membrane interactions
外膜的基本组分在细菌中高度保守，而细菌S层完全由蛋白质构成，通常由1~2种蛋白重复排列形成阵列，物种间差异极大。S层在细菌中多次丢失与获得，甚至有假说认为外膜本身起源于类似的蛋白层。S层蛋白丰度极高，超过外膜蛋白，占蛋白组的10%以上；通常为模块化多结构域蛋白，在对称性、孔径、翻译后修饰及锚定机制上存在结构多样性，可形成多种对称性的晶格，孔径可达数十纳米，常经专用通路糖基化，可通过非共价结合或脂质插入方式锚定于外膜。
S层组织如何受下方包膜结构影响尚不清楚。为结合双膜细菌的OM或单膜细菌的PG，S层采用多种非共价或膜插入锚定方式，锚定结构域多样，且常在S层蛋白与外膜蛋白间交换。例如单膜细菌的S层蛋白通过S层同源结构域结合细胞壁聚合物，该结构域也存在于双膜异常球菌门（Deinococcota）的丰度高外膜蛋白OmpM（旧称SlpA）中，用于锚定外膜至周质细胞壁。双膜异常球菌门同时拥有S层，其S层蛋白呈六方堆积，如HPI蛋白通过N端脂修饰直接锚定于外叶，无需 bulky α-螺旋即可实现附着。OmpM与HPI似乎以非常相似、紧密关联的六边形阵列排列。此外，双膜细菌新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）的LPS结合S层蛋白RsaA也呈六方堆积。因此，双膜细菌S层倾向于采用六方对称性，可能是静态、富含三聚体的外膜中频繁出现六方堆积的结果，尤其当S层蛋白经脂修饰或结合LPS时，需接触下方脂质。
β-桶状外膜蛋白的堆积是否影响S层对称性仍有待验证，但这可能是实现紧密外膜锚定而不干扰周围膜秩序的便捷途径。对于直接插入静止外膜双分子层的跨膜螺旋锚定S层蛋白或S层脂蛋白，在低扩散环境中的快速组装成为难题。非共价结合的S层蛋白大多彼此结合能力强于与下层表面的结合，允许单体在表面重排直至完成组装，例如RsaA可沿LPS扩散后再组装。
Functions of the outer membrane and S-layer
尽管组成不同，S层与外膜均是细菌与环境的接触界面。外膜是古老且必需的结构，存在于最后细菌共同祖先中；而细菌S层并非必需，进化上出现与丢失更频繁。相应地，外膜具有选择性通透、细胞-环境互作及机械完整性等多重功能；细菌S层功能更特异，通常仅在特定条件下需要。S层的合成代谢成本高，因此必须提供一定的适合度优势，即便外膜已存在。
二者共有的关键功能是形成选择性屏障，限制有害分子流入，同时允许必需分子进入细胞。但APLM与外膜的复杂组成使其选择性远高于S层：外膜的不对称脂质阻止疏水分子扩散至周质，离子、营养物质等必须通过β-桶状外膜蛋白进入细胞，可通过自由扩散或主动运输实现。主动转运主要由TonB依赖转运蛋白（TBDTs）介导，连接内膜与外膜，利用质子动力势转运铁载体、维生素与碳水化合物。有趣的是，新月柄杆菌与铜绿假单胞菌等双膜细菌中鉴定的TBDTs数量远多于大肠杆菌。对于大分子的被动扩散，许多菌种表达丰度的三聚体孔蛋白，仅允许小亲水分子通透；无丰度三聚体孔蛋白的菌种（如铜绿假单胞菌）外膜通透性更低，因而对抗菌药物更耐受，其鉴定出的大量TBDTs可能补偿了营养物扩散的不足。S层提供类似外膜孔蛋白的选择性通透，但其选择性更有限且调控粗糙，大分子量物质如何穿过小孔径S层仍是未解问题。S层孔径占细胞表面积的30%~70%，直径通常为2~8 nm，细胞生理状态的改变可调控S层的组成与结构，进而影响其通透性。
外膜蛋白的第二大功能是调控与邻近细胞的互作：大肠杆菌OmpA、霍乱弧菌OmpU等参与宿主细胞黏附；生物膜形成常依赖自转运蛋白，黄色黏球菌（Myxococcus xanthus）的同类识别需要TraA/B外膜蛋白；噬菌体常以β-桶状外膜蛋白为受体，驱动细菌进化。S层蛋白同样参与细菌-宿主互作与生物膜形成，噬菌体也已进化出以S层蛋白为受体的策略，例如新月柄杆菌的RsaA与艰难梭菌的SlpA。
外膜最重要的功能之一是提供机械完整性，使双膜细菌能在渗透压波动环境中存活。过去认为仅肽聚糖提供结构支撑，现在明确外膜也是主要贡献者：大肠杆菌中Lpp共价连接外膜与肽聚糖，OmpA非共价连接二者，将细胞包膜紧密偶联为统一的机械支架。Lpp仅存在于变形菌门，而丰度的肽聚糖锚定β-桶状外膜蛋白几乎存在于所有双膜细菌中，提示外膜与肽聚糖的偶联对细胞完整性尤为重要。OmpA连接刚性的β-桶状外膜蛋白与肽聚糖的抗拉强度，形成机械强度远高于各部分之和的复合材料。S层对古菌的机械完整性至关重要，但在细菌中对包膜稳定性的贡献所知甚少：研究显示在炭疽芽孢杆菌等单膜细菌中，S层发挥类似外骨骼的结构作用，缺失会导致形态缺陷；推测在肽聚糖层较薄的单膜细菌中，S层的额外支撑具有优势，这一功能可与双膜细菌中外膜的结构支撑作用类比。
Outer membrane and S-layer biogenesis
生长过程中，细菌需在快速扩展包膜的同时不破坏其完整性。外膜与S层的生物发生均需将数千个分子从细胞质转运至表面。β-桶状外膜蛋白与S层蛋白首先通过Sec途径（少数通过Tat途径）跨内膜转运。由于丰度高的自组装蛋白具有潜在毒性，其在周质中的转运需精细调控：SurA是主要的分子伴侣，护送蛋白至β-桶状外膜蛋白组装机器（BAM）复合物；Skp与DegP提供辅助支持，主要处理错误折叠蛋白或促进β-桶状外膜蛋白降解。S层蛋白的自组装常需要钙离子，因此胞内低钙浓度可防止其提前聚集；此外，双膜细菌中I型与II型分泌系统介导S层蛋白的分泌，进一步降低周质中蛋白积累的风险。
外膜生物发生的重要特征是分裂与肽聚糖、β-桶状外膜蛋白及LPS组装的协调。类似地，S层蛋白也在离散的表面位点组装，且依赖于其他包膜组分的延伸。证据表明肽聚糖组装先于上层外膜的蛋白插入及现有S层中的S层蛋白插入，但机制不同：大肠杆菌中新生肽聚糖（富含五肽）插入分裂隔膜与侧壁，未加工的肽聚糖无法结合BAM，允许BAM保持β-桶状外膜蛋白插入酶活性；而极部的旧肽聚糖（富含四肽）结合BAM并抑制其活性，因此β-桶状外膜蛋白插入强烈偏向细胞中部。值得注意的是，外膜生物发生还需要新LPS的组装，与β-桶状外膜蛋白不同，大肠杆菌中LPS插入遍布细胞表面。
对于S层插入，单膜细菌中肽聚糖与S层蛋白插入的共定位可能源于新S层蛋白在肽聚糖下的积累；肽聚糖扩展后暴露新的无覆盖区域，允许局部S层蛋白组装。双膜细菌中S层蛋白如何被导向肽聚糖生物发生位点仍待阐明，鉴于新月柄杆菌的RsaA等S层蛋白通过I型分泌系统分泌，该系统的外膜组分定位可能在S层生物发生定向中发挥作用。
Future directions
将外膜理解为APLM后，几乎静止的β-桶状外膜蛋白晶格带来了外膜功能与生物发生的新问题。首先，在拥挤的β-桶状外膜蛋白晶格环境中，蛋白质折叠与组装难度显著增加：BAM复合物在折叠过程中会重排周围脂质，且LPS是β-桶状外膜蛋白折叠与组装的必需组分，因此游离脂质的存在对蛋白插入至关重要。其次，蛋白质侧向运动是需要运动与分泌（包括部分S层分泌）的过程所必需的，这要求在相对高速下局部重排静止的APLM。针对这些问题，过量脂质聚集为稳定斑块的特性提示膜中可能存在流动性各异的区域：斑块中的流体脂质小储库可能促进蛋白的插入、运动与组装，同时保持膜其余部分的静止。但目前尚无证据表明大肠杆菌细胞长度上存在脂质富集区的差异，尽管蛋白插入位置存在差异；且已知可侧向移动β-桶状外膜蛋白的菌种中是否存在脂质斑块也未得到研究。未来需评估更多菌种中的脂质分离与β-桶状外膜蛋白扩散特性。
细胞生理状态如何影响APLM排列也是重要的未解问题。β-桶状外膜蛋白含量随营养可用性变化，提示脂质与β-桶状外膜蛋白的比例会发生改变：这可能普遍降低β-桶状外膜蛋白富集区的密度，或在维持β-桶状外膜蛋白密度的同时增加纯脂质斑块的体积。这些可能性尚未被验证，但可能意味着营养充足、生长最快、新β-桶状外膜蛋白插入需求最高时，脂质斑块的流动性更强。外膜重排对S层形成的影响取决于S层产生的具体生理条件，例如外膜组分的表面可及性可能决定哪种锚定机制被偏好；当刚性β-桶状外膜蛋白含量较低时，S层提供的机械完整性可能更为重要。
尽管外膜与S层组分的组装受空间调控已逐渐明确，但其分子基础仅在少数系统中被解析，仍需深入研究。近期发现的肽聚糖组装与β-桶状外膜蛋白或S层生物发生的时空协调性强烈提示，细胞伸长尤其是分裂需要这些包膜组分的紧密协调。但在双膜细菌中，LPS与β-桶状外膜蛋白生物发生的空间模式存在差异，表明额外的生理约束塑造了外膜组装。鉴于LPS常作为S层的主要锚定点，而S层蛋白通过β-桶状外膜蛋白分泌，新合成的S层蛋白如何被靶向至细胞表面的特定位点仍是未来研究的重要问题。更广泛地说，我们对OM与S层组织及其功能意义的理解仍存在根本空白：包括这些组分的空间组织如何贡献其功能，尤其是晶格样结构是否增强抗菌耐药性，破坏该结构是否会使细菌对抗菌药物敏感；以及这些系统如何响应环境信号发生重塑等问题仍待探索。解决这些问题有望揭示细菌包膜组织、动态与形态发生的新统一原理。
