耐热型人工烟酰胺辅因子的合成：carba-NAD+与carba-NADP+

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）及其磷酸衍生物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP⁺）等烟酰胺辅因子在氧化还原生物催化中不可或缺，其使氧化还原酶能够介导代谢和工业生物催化中众多至关重要的氧化还原转化。然而，烟酰胺辅因子的高成本和化学不稳定性限制了其在工业生物催化中的应用，使许多过程局限于中等温度条件。虽然已有 numerous strategies 通过辅因子循环来缓解成本相关挑战，但NAD(P)H的热敏性，特别是其在高温工艺条件下的降解倾向，仍是制约氧化还原催化向更高温度拓展的瓶颈。与此同时，酶工程的快速发展使生物催化剂能够接受非经典辅因子，推动了辅因子工程的并行进展，加速了合成辅因子模拟物作为阐明代谢途径和设计下一代生物催化系统有力工具的开发。在此背景下，carba-NAD(P)⁺（cNAD(P)⁺）作为一种合成类似物被引入，其中β-D-核糖环被2,3-二羟基环戊烷部分取代。该结构修饰增强了热稳定性，使辅因子在高温下具有抗水解能力。尽管cNAD(P)⁺的生物化学相关性日益受到认可，但其更广泛应用受到化学合成复杂性和酶法生产方法探索不足的制约。

本研究中，研究人员针对cNAD⁺和cNADP⁺的制备开展了化学合成与酶促合成两种策略的研究。化学合成路线以商业可得的(−)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮（即R-(−)-Vince内酰胺）为起始原料，经八步反应获得cNAD⁺，包括syn-二羟基化、酮缩醛保护、BOC保护、还原性开环、脱保护、Zinke反应、磷酸化及焦磷酸偶联等关键步骤，最终分离产率达61%。在酶促合成方面，研究人员鉴定并表征了参与辅因子组装的关键酶，评估了它们对非天然碳环底物的耐受性，并将组装途径拓展至磷酸化类似物cNADP⁺的生成。

热稳定性研究表明，cNAD⁺表现出显著的热稳定性优势：在50 °C条件下，其半衰期（t_1/2 > 1386 h）远远超过NAD⁺（t_1/2 = 76 h）。功能评价证实，cNAD⁺能够被广泛的氧化还原酶面板接受，保持了作为氧化还原辅因子的功能活性。

该研究建立了获取耐热合成烟酰胺辅因子类似物的模块化工作流程，详细阐述了cNAD⁺和cNADP⁺的合成全景图，为辅因子工程和合成生物催化中的应用开辟了新机遇。论文发表于《RSC Chemical Biology》。

该研究采用的主要关键技术方法包括：以Vince内酰胺为起始原料的八步化学合成路线制备cNAD⁺标准品；通过BLAST搜索从UniProt数据库筛选来源于大肠杆菌、血液链球菌、科泽里氏柠檬酸杆菌和嗜热古菌Pyrococcus horikoshii的烟酰胺核糖激酶（NRK）、烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶（NMN-AT）和NAD⁺激酶（NADK）等酶候选物，利用大肠杆菌异源表达系统获得可溶性重组蛋白；采用偶联光谱光度法测定稳态动力学参数，评估酶对天然底物和碳环类似物的催化性能；运用荧光热位移分析（SYPRO Orange染料法）测定酶的热稳定性，并在pH 4.0–9.0范围内测定酶的pH依赖活性谱；在10 mM HEPES缓冲液（pH 7.5）中进行37 °C条件下的制备规模酶促反应，结合ATP再生系统（磷酸肌酸/肌酸激酶）进行cNAD⁺和cNADP⁺的酶法合成；利用薄层色谱（TLC）、电喷雾电离质谱（LC-ESI-MS）和核磁共振波谱（¹H NMR）进行产物鉴定与结构验证；通过HPLC监测50 °C条件下cNAD⁺与NAD⁺的降解动力学，计算一级降解速率常数和半衰期；选取23种NAD⁺依赖性氧化还原酶筛选cNAD⁺的功能接受性。

化学合成cNAD⁺：研究人员以R-(−)-Vince内酰胺为起始原料，经八步反应完成了cNAD⁺的化学合成。关键步骤包括：OsO₄催化的syn-二羟基化（产率73%）；2,2-二甲氧基丙烷保护邻二醇并引入BOC保护基（两步产率90%）；NaBH₄还原性开环（产率84%）；酸性条件脱保护（产率98%）；Zinke反应制备carba-烟酰胺核糖（cNR，产率76%）；POCl₃/三甲基磷酸磷酸化制备carba-烟酰胺单核苷酸（cNMN，产率88%）；以及腺苷酰转移试剂介导的焦磷酸偶联制备cNAD⁺（分离产率61%）。该路线避免了有毒HF的使用，并通过甲酸型DOWEX 1×8树脂优化了纯化步骤。

酶的鉴定与表征——酶的选择：从相关酶类中每个反应步骤选取两个候选酶，策略上结合大肠杆菌同源物（预期可溶性表达）与系统发育上不同的变体以探索序列-功能多样性。包括：烟酰胺核糖激酶——大肠杆菌EcNRK和血液链球菌SsNRK（序列同一性25%）；烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶——大肠杆菌EcNMN-AT和科泽里氏柠檬酸杆菌CkNMN-AT（序列相似性84.5%）；NAD⁺激酶——大肠杆菌EcNADK和嗜热古菌PyHNADK。

稳态动力学表征：通过偶联光谱光度法测定各酶对天然底物和碳环类似物的稳态动力学参数。NRK方面，EcNRK和SsNRK对天然NR和cNR的K_M值相近（约1–1.7 mM），EcNRK催化周转数（k_cat）更高（NR为3.34 s⁻¹，cNR为1.17 s⁻¹）。NMN-AT方面，CkNMN-AT表现出显著更高的转换数，使用NMN时k_cat（4.4 s⁻¹）约为EcNMN-AT（0.85 s⁻¹）的5倍，使用cNMN时（4.43 vs. 0.47 s⁻¹）约10倍，且K_M值更低。NADK方面，EcNADK对cNAD⁺的k_cat（1.67 s⁻¹）显著高于PyHNADK（0.34 s⁻¹），表明两者对碳环修饰均有一定耐受性。

酶活性温度和pH依赖性：通过SYPRO Orange荧光热位移测定Tm值（47–66 °C），超过典型酶促合成反应温度范围（30–37 °C）。pH活性谱显示最适pH约8.0，EcNRK比SsNRK具有更宽pH活性范围，EcNMN-AT对酸性条件敏感，NADK变体在pH 6.0–9.0保持广泛活性。

酶法合成cNAD⁺：制备规模反应中，EcNRK催化cNR磷酸化为cNMN的分离摩尔产率为56%；CkNMN-AT催化cNMN腺苷酰化为cNAD⁺在10 mM HEPES中产率64%（50 mM HEPES中73%）；EcNADK催化cNAD⁺磷酸化为cNADP⁺的摩尔产率为46%。产率限制因素包括：NRK步骤的催化周转下降、NMN-AT步骤的平衡限制（PPi未去除）、以及NADK步骤的产物抑制和反应条件变化。

分析验证：通过TLC、LC-ESI-MS（cNMN m/z 333.0，cNAD⁺ m/z 662.1，cNADP⁺ m/z 742.1）和¹H NMR验证了所有中间体和终产物的身份与结构完整性，确认了2'-位磷酸化形成NADP⁺型结构。

合成分析比较：化学路线产率较高但需严苛条件（低温控制、湿度敏感试剂、保护基化学）；酶法路线在温和水相条件下操作，避免保护基和活性中间体，下游处理简便（超滤除酶后离子交换层析），且唯一可实现cNADP⁺合成，但产率受酶性能和反应控制敏感影响。

cNAD⁺的热稳定性：50 °C条件下，NAD⁺降解速率常数k_i = 0.0091 mM h⁻¹（t_1/2 = 76 h），而cNAD⁺基本不变（k_i = 0.0005 mM h⁻¹，t_1/2 > 1386 h）。HPLC显示NAD⁺有多种降解产物而cNAD⁺无降解产物，证实碳环取代显著增强辅因子稳定性。

氧化还原酶对cNAD⁺的接受性：对23种常用NAD⁺依赖性氧化还原酶的评估显示，大多数酶对cNAD(H)保持可检测活性，比活性与NAD(H)呈正相关，表明碳环取代不破坏基本氢负离子转移化学，cNAD⁺与多种氧化还原酶类别广泛兼容。

讨论与结论部分的总结：该研究通过化学和酶促互补策略，建立了获取cNAD⁺和cNADP⁺的实用化框架。化学合成提供了可靠的cNAD⁺获取途径；酶法后期转化证明天然NAD⁺生物合成酶能够容纳碳环底物，可实现cNMN、cNAD⁺及cNADP⁺的酶法制备。尽管酶法合成受产物抑制和长时间反应环境稳定性等因素影响，但这些限制可通过优化的辅因子再生和产品去除策略等成熟工艺控制手段加以解决。cNAD⁺相对于NAD⁺表现出显著增强的热稳定性，并能作为有效的氧化还原辅因子被广泛的NAD⁺依赖性氧化还原酶接受。这些发现共同建立了获取稳健非天然烟酰胺辅因子的化学酶法框架，支持其在生物催化、辅因子工程和无细胞合成系统中的应用开发。