小鼠小肠对可渗透的环状肽的吸收作用可增强Fc融合蛋白的吸收

时间：2026年5月21日

来源：Journal of Pharmaceutical Sciences

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千松翔马|坂口康成|佐佐木幸希|大塚純男|伊藤信吾日本熊本大学药学研究生院药学微生物学系摘要可片段结晶的（Fc）融合蛋白是一类通过新生儿Fc受体（FcRn）介导的循环作用而具有较长半衰期的生物制剂。然而，由于其较大的分子尺寸，这些蛋白需要通过静脉或皮下注射进行给药，因为它们无法穿

千松翔马|坂口康成|佐佐木幸希|大塚純男|伊藤信吾

日本熊本大学药学研究生院药学微生物学系

摘要

可片段结晶的（Fc）融合蛋白是一类通过新生儿Fc受体（FcRn）介导的循环作用而具有较长半衰期的生物制剂。然而，由于其较大的分子尺寸，这些蛋白需要通过静脉或皮下注射进行给药，因为它们无法穿透小肠屏障。在这项研究中，我们旨在利用先前发现的能够促进小肠上皮细胞转运的环状肽DNP，来开发一种可穿透小肠的Fc融合蛋白。我们选择了与IgG4 Fc结构域融合的GLP-1类似物度拉糖肽（dulaglutide）作为模型Fc融合蛋白。我们在中国仓鼠卵巢细胞中制备了含有DNP肽的度拉糖肽（dulaglutide-DNP），该肽被连接到每个Fc链的C端。dulaglutide-DNP保持了与未修饰度拉糖肽相当的结构完整性和FcRn结合亲和力。在小鼠实验中，静脉注射dulaglutide-DNP的降糖效果与未修饰度拉糖肽相当，表明DNP肽的融合并未影响其药理活性。肠内给药后，药代动力学分析显示dulaglutide-DNP在10分钟内迅速进入门静脉，并可在全身循环系统中检测到。药效学分析进一步证实，肠内给药后的降糖效果达到了基线的39.0%，其药理利用率相对于静脉给药为15.7%。这些结果表明，DNP肽的融合使得度拉糖肽能够被小肠吸收，同时保留其功能，从而为开发口服给药型的Fc融合疗法提供了潜在的平台。

引言

可片段结晶的（Fc）融合蛋白是一种治疗性蛋白，其药物结构域（如肽、酶或受体配体）通过基因工程连接到人免疫球蛋白G（IgG）的Fc区域。这类生物制剂包括依那西普（TNFR-Fc）、阿巴西普（CTLA-4-Fc）、阿法利普素（VEGFR1/2-Fc）和度拉糖肽（GLP-1受体激动剂-Fc）。¹^,²与IgG Fc区域的融合通过稳定作用和新生儿Fc受体（FcRn）介导的循环作用显著延长了其全身半衰期。^{3, 4, 5}然而，这些Fc融合蛋白通常需要通过静脉输注或皮下注射给药，这两种方法都属于侵入性给药方式。

尽管口服给药是首选的非侵入性途径，但Fc融合蛋白在胃肠道中面临主要障碍，包括快速酶降解和穿过小肠上皮的渗透性有限。虽然蛋白酶抑制剂（如大豆胰蛋白酶抑制剂[STI]）的联合使用可以部分缓解酶降解问题，⁶^,⁷但较差的上皮渗透性仍然是一个主要障碍。为了促进肠道吸收，已经开发了吸收增强剂（如琥珀酸酯钠），但这些剂型主要对小于10 kDa的肽有效，对于超过50 kDa的蛋白质则无效。^{8, 9, 10, 11}此外，可摄入的微装置虽然能够递送大分子，但由于安全考虑，其应用主要限于胃部。^{12, 13, 14}因此，尚未建立一种能够实现Fc融合蛋白高效小肠吸收的非侵入性给药策略。

为克服这些限制，我们选择了一种环状DNP肽（DNPGNET），该肽通过噬菌体展示筛选发现具有促进大分子穿过小肠上皮的能力。¹⁵与传统吸收增强剂不同，这种环状DNP肽能够在不破坏小肠上皮屏障完整性的情况下促进主动跨细胞转运，并且由于其天然的L-氨基酸组成，适合用于重组蛋白的制备。¹⁵^,¹⁶尽管环状DNP肽的L形式可能易受胃肠道蛋白酶降解，但我们的先前研究表明，它在原位封闭循环模型中仍能促进小肠转运¹⁶，并且口服给予与L形式环状DNP肽结合的锌六聚体胰岛素具有与D形式相当的降糖效果。⁷

Fc融合蛋白的分子量通常超过60 kDa，因此其通过小肠上皮的吸收在口服给药中仍是一个重大挑战。基于这些发现，我们假设将环状DNP肽与Fc区域融合可以产生一种兼具小肠转运能力和Fc融合蛋白延长全身半衰期的双功能分子。为了验证这一假设，我们选择度拉糖肽作为模型Fc融合蛋白，原因有二：首先，其IgG4 Fc结构域经过修饰，具有最小的Fcγ介导的效应功能，适合作为治疗载体；^{17, 18, 19, 20}其次，其降糖活性为评估肠道吸收后的全身暴露提供了可靠的药效学指标。²¹在这项研究中，我们旨在CHO细胞中制备环状DNP肽融合的Fc融合蛋白，并在小鼠的原位肠道封闭循环模型中评估其小肠吸收的可行性。

章节片段

动物

实验所用雄性癌症研究所小鼠（年龄：7–10周；体重：约35–45克）由Kyudo有限公司（日本佐贺县）提供，饲养在受控的环境条件下（温度范围：18–24°C，相对湿度：40–70%；12小时光照/黑暗周期）。小鼠可自由摄取标准饲料和水。所有与动物相关的程序均经过熊本大学动物护理和使用委员会的审查和批准（批准编号：A2021-047）。

统计分析

除非另有说明，数据以平均值±标准误差（SEM）的形式呈现。统计分析使用GraphPad Prism 9软件（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行。两组之间的差异采用非配对双尾Student’s t检验进行评估，P值<0.05被视为具有统计学意义。

度拉糖肽-DNP的制备与结构表征

我们通过柔性（G₄S）₃连接子将环状L-DNP肽与度拉糖肽的Fc区域C端进行基因融合（图1）。由于IgG Fc区域是一个对称的重链同源二聚体，这种C端融合每个Fc链产生一个DNP分子，从而实现双价显示。我们在CHO细胞中重组表达了度拉糖肽和dulaglutide-DNP，使用蛋白质A亲和层析法纯化了这些蛋白，并评估了它们的纯度和分子特性。

结论

我们展示了一种概念验证策略，通过将环状DNP肽与度拉糖肽基因融合，实现了Fc融合蛋白的小肠吸收。这种融合促进了蛋白质跨小肠上皮进入全身循环，并在肠内给药后产生了降糖效果。这些结果表明，环状DNP肽融合策略是一种改善肠道递送的潜在方法。

作者贡献

概念设计：S.C.、坂口康成和伊藤信吾；方法学研究：S.C.、坂口康成和伊藤信吾；验证：S.C.、坂口康成和佐佐木幸希；正式数据分析：S.C.和坂口康成；初稿撰写：所有作者；可视化：S.C.、坂口康成和伊藤信吾；项目监督：伊藤信吾；资金获取：S.C.和伊藤信吾。所有作者均已阅读并同意发表的手稿版本。