急性髓系白血病（AML）以髓系造血干/祖细胞分化受阻导致的白血病细胞恶性克隆性增殖失控为特征。致病性融合蛋白AML1-ETO（又称RUNX1-ETO或RUNX1-RUNX1T1）和趋化因子（C-X-C基序）受体4（CXCR4）已被确认为关键效应分子。针对单个靶点的策略已应用于开发新的治疗方法；然而，临床需求仍未满足，且两个因子之间的相互调控关系尚知之甚少。在该研究中，研究人员利用脂质纳米颗粒（LNP）平台装载AML1-ETO siRNA和CXCR4拮抗肽E5（E5-LNP@siAE），以同时耗竭融合蛋白并抑制CXCR4激活，旨在阐明两个因子之间的相互调控关系，并开发一种基于脂质纳米颗粒的新型双功能治疗方法。所得纳米颗粒在高表达CXCR4的难治性AML小鼠模型（AML1-ETO & C-KITD816V ）以及t(8;21)阳性AML细胞系Kasumi-1中进行了研究。研究表明，E5-LNP@siAE能有效实现AML1-ETO的RNA干扰（RNAi）和CXCR4拮抗，从而协同诱导有效的多系分化，增强AML细胞对高三尖杉酯碱（HHT）的分化后凋亡反应，并显著延长难治性AML小鼠的生存期。
急性髓系白血病（AML）是最常见的成人急性白血病，以髓系造血干/祖细胞分化受损伴随白血病细胞恶性克隆性增殖失控为特征。尽管部分年轻患者可通过联合化疗方案获得初始缓解，但AML仍存在高复发率和多药耐药性问题，导致预后极差，5年总生存率仅约32%。老年患者对化疗的耐受性和反应性极低，5年生存率不足10%。
AML与多种染色体异常和基因突变相关。其中，染色体易位t(8;21)(q22;q22)是最常见的易位之一，主要发生于FAB-M2亚型，产生融合蛋白AML1-ETO，在阻断粒系、巨核系和红系等多系分化，以及促进白血病发生、疾病进展和耐药性发展中起关键作用。携带AML1-ETO的患者若合并其他基因突变（如C-KIT），则易进展为难治性白血病，复发率显著增加，生存率降低。RNA干扰（RNAi）是靶向AML1-ETO的最广泛研究策略，前人研究已利用短发夹RNA沉默AML1-ETO增强白血病细胞凋亡、通过电穿孔耗竭AML1-ETO延长异种移植AML小鼠模型中位生存期，以及使用脂质纳米颗粒包裹的化学修饰RNA干扰免疫缺陷小鼠体内的白血病增殖。
C-X-C趋化因子受体4（CXCR4）在多种AML亚型中高度表达，使细胞能够与其特异性配体CXCL12相互作用。CXCL12主要由骨髓和脾脏基质细胞分泌，激活后的CXCR4促进AML细胞向骨髓和脾脏迁移归巢，获得保护并形成对多种治疗（包括RNAi和化疗药物）的耐药性。因此，CXCR4不仅可作为靶向递送的特异性位点，也是AML治疗中有吸引力的治疗靶点。已有多种CXCR4拮抗剂被开发，如小分子AMD3100、化学合成肽LY2510924和生物衍生肽BKT140等。E5是一种CXCR4拮抗肽，对CXCR4具有高亲和力和抑制CXCL12介导的CXCR4激活的拮抗作用，作为单药或装载阿霉素的纳米胶束形式在难治性AML动物模型中显示出抗白血病活性。
然而，抑制单个靶点的治疗效果尚未满足临床需求，且两个靶点之间的相互调控关系虽有迹象表明存在，但尚未被揭示或得到充分研究。为探究AML1-ETO与CXCR4是否存在相互支持关系，并开发更有效的治疗策略，研究人员采用脂质纳米颗粒（LNP）技术，在统一平台上将AML1-ETO的RNAi与CXCR4拮抗相结合，构建E5-LNP@siAML1-ETO。在该双功能脂质纳米颗粒中，肽E5通过DSPE-PEG
2000 偶联于纳米颗粒表面，以干扰CXCR4/CXCL12轴并作为靶向箭头锚定CXCR4高表达的AML细胞；同时，AML1-ETO siRNA与可离子化脂质分子形成复合物以实现基因沉默。所得纳米颗粒在高表达CXCR4的难治性AML小鼠模型（AML1-ETO & C-KIT
D816V ）以及t(8;21)阳性AML细胞系Kasumi-1中进行了研究。研究人员证明，E5-LNP@siAML1-ETO作为单药即可诱导AML细胞有效的多系分化，该效应通过同时下调AML1-ETO和干扰CXCR4/CXCL12轴实现，显著抑制了AML细胞的骨髓定植和髓外浸润。更重要的是，E5-LNP@siAML1-ETO显著增强了三尖杉酯碱（HHT）的抗白血病效应，明显延长了难治性AML小鼠的生存期。
为开展该研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：通过微流控法制备脂质纳米颗粒；在Kasumi-1细胞（源自日本广岛大学Nanao Kamada教授馈赠，经北京擎科生物科技有限公司鉴定和支原体检测）及基于C57BL/6小鼠造血干细胞经MSCV-AML1/ETO-IRES-GFP和MSCV-HyC-KIT
D816V -IRES-GFP病毒转导建立的难治性AML小鼠模型（AML1-ETO & C-KIT
D816V ，已获中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所动物管理与使用委员会批准，编号ACUC-XMSB-2024-094）中进行体外和体内实验评估。纳米颗粒表征采用透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）；细胞摄取分析采用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞术；基因沉默效率通过定量实时PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot）检测；细胞功能评价包括流式细胞术检测分化标志物（CD11b、CD41a、CD235a）、Annexin V凋亡检测、羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）细胞增殖检测、2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）活性氧（ROS）测定及Transwell迁移实验；体内治疗效果评估包括外周血（PB）白血病细胞比例监测、器官重量测定、血常规分析、肝肾功能生化检测、组织苏木精-伊红（H&E）染色和免疫荧光染色；生存分析采用Kaplan-Meier法。
**纳米颗粒制备与表征**
研究人员通过微流控法制备了装载siRNA并修饰E5肽的脂质纳米颗粒。透射电子显微镜（TEM）结果显示，E5-LNP@siNC和LNP@siNC均为均匀球形，平均直径分别为121.8±25.1 nm和71.0±13.7 nm，表明DSPE-PEG-E5的插入使纳米颗粒尺寸有所增加。动态光散射（DLS）测得E5-LNP@siNC和LNP@siNC的平均流体力学直径分别为172.0 nm和139.8 nm，两种LNP在PBS或10%FBS中至少稳定7天。Zeta电位结果表明E5-LNP@siNC比LNP@siNC负电荷更少，因带正电的E5部分中和了负电荷，提示E5展示于LNP表面。与Kasumi-1细胞（高表达CXCR4）孵育后，E5-LNP@FAM-siNC比LNP@FAM-siNC表现出更强的细胞摄取，共聚焦显微镜观察到更强的绿色荧光，流式细胞术进一步验证了这一结果，包括细胞表面吸附和细胞内化部分。两种LNP的siRNA包封效率均为97%，DSPE-PEG-E5不影响siRNA的包封。
**体内外RNAi效应与CXCR4拮抗作用**
在Kasumi-1细胞中，LNP@siAE和E5-LNP@siAE均在24 h和48 h降低了AML1-ETO mRNA水平，E5-LNP@siAE在相同时间点效果略强；蛋白质印迹显示E5-LNP@siAE和LNP@siAE在48 h下调了AML1-ETO蛋白，前者效果更强。
关于AML1-ETO敲低对CXCR4表达的影响：CXCR4为内吞循环受体，配体结合触发快速内化后高效回收至细胞膜。2 h共孵育时，LNP@siNC组CXCR4水平略有下降，随时间延长恢复甚至略高于对照，因纳米颗粒通常触发细胞内吞导致部分CXCR4受体内化；E5-LNP@siNC在2 h共孵育后也导致CXCR4表达轻度下降，随后恢复至对照水平，提示其不能诱导充分且持久的CXCR4拮抗效应。相反，E5-LNP@siAE组在24 h孵育后实现了最强且最持久的抑制效果。
CXCR4/CXCL12轴是驱动AML细胞迁移的核心调控通路，直接介导AML细胞向骨髓微环境归巢。E5-LNP@siAE诱导的CXCR4内化伴随细胞迁移抑制。CXCL12有效诱导细胞迁移，2 h E5-LNP@siNC孵育可在一定程度上抑制CXCL12诱导的迁移，而LNP@siNC不能，归因于E5的CXCR4拮抗效应。但AML1-ETO融合基因可调节迁移相关基因表达并增强细胞迁移能力，因此LNP@siAE和E5-LNP@siAE长期共孵育均产生更强抑制效果，其中E5-LNP@siAE效果最强，因其同时抑制了两个靶点。
此外，LNP@siAE和E5-LNP@siAE均降低了细胞内ROS水平，E5-LNP@siNC无此效应，而E5-LNP@siAE降低程度最大，提示E5修饰增强了LNP@siAE的效果。异常高ROS水平与AML耐药密切相关，因此同时靶向CXCR4和AML1-ETO对难治性AML具有治疗潜力。
**白血病负担减轻作用**
研究人员采用携带AML1-ETO-GFP和C-KIT
D816V -GFP基因的难治性AML小鼠模型，该模型中AML细胞高表达CXCR4。当外周血白血病细胞比例达到约10-30%时开始治疗给药。
E5-LNP@siAE组小鼠脾脏体积明显小于其他各组，脾重和肝重显著降低，表明白血病负担显著减轻。同时，E5-LNP@siAE组白细胞（WBC）降至最低水平，红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）和血小板（PLT）恢复至与对照组相当水平，且血小板计数显著高于LNP@siAE组，强烈提示E5介导的CXCR4拮抗减轻了造血毒性。H&E染色直观显示E5-LNP@siAE显著抑制了AML细胞在骨髓（骨骺和骨干）的定植以及脾脏、肝脏和肺的浸润，正常组织结构明显恢复。E5-LNP@siAE组骨髓中AML细胞明显减少，粉红色区域扩大，出现脂肪空泡；肝脏中正常肝细胞数量增加，呈星状排列；肺泡结构清晰，肺组织恢复疏松形态；脾脏中AML细胞比例降低，红细胞增多。
免疫荧光染色和蛋白质印迹显示，LNP@siAE和E5-LNP@siAE均有效下调了AML小鼠脾脏中AML1-ETO水平，E5-LNP@siAE达到最低表达，表明E5-LNP@siAE能够在体内实现AML1-ETO基因沉默。
**AML细胞分化与凋亡诱导**
E5-LNP@siAE处理后，Kasumi-1细胞中CEBPA、PU.1和GATA1 mRNA水平升高，分别提示粒系、巨核系和红系分化启动。流式细胞术检测CD11b、CD41a和CD235a蛋白水平的结果一致，仅LNP@siAE和E5-LNP@siAE能上调分化标志物，且E5-LNP@siAE诱导更明显的升高。
抗凋亡基因BCL2和细胞周期调控基因CCND2是AML1-ETO的下游基因，促进白血病发生。蛋白质印迹显示E5-LNP@siAE显著下调了Kasumi-1细胞中BCL2和CCND2水平。Annexin V检测显示E5-LNP@siAE增加了细胞凋亡，CFSE检测表明细胞增殖受到抑制，因细胞分裂受抑导致荧光强度增加。总体而言，E5-LNP@siAE能够通过调控AML1-ETO下游转录驱动髓系多方向分化、促进凋亡并抑制增殖。
**化疗增敏作用**
HHT是广为人知的抗AML化疗药物，但因毒性高而治疗窗窄。研究人员探究E5-LNP@siAE能否增敏AML细胞，因AML1-ETO和CXCR4均在化疗耐药中起重要作用。首先，在LNP制剂组中，仅E5-LNP@siAE延长了AML小鼠生存。随后，E5-LNP@siAE与HHT联用：与HHT单药相比，联合方案显著延长生存，降低外周血、脾脏、肝脏和肺中AML细胞比例；H&E染色显示联合方案抑制骨髓（骨骺和骨干）、脾脏、肝脏和肺的AML细胞浸润并恢复组织结构，骨髓出现脂肪空泡提示恢复，脾脏组织整体染色变浅呈粉红色提示红细胞比例增加，肝脏星状排列的正常肝细胞增多，肺泡结构清晰可见。
联合方案组脾重和肝重较HHT单药显著降低，确认E5-LNP@siAE的增敏效应。肝肾功能指标下降，表明白血病引起的肝脏浸润缓解，肝肾功能恢复。ALT、ALP、TBIL、TBA和BUN水平在联合方案组较对照和HHT组降低。联合方案显著降低WBC，RBC和PLT无显著变化。
体外实验中，E5-LNP@siAE联合HHT增加CD11b、CD41a和CD235a表达及细胞凋亡率。已知化疗药物通常升高AML细胞CXCR4水平，与耐药发展相关。HHT处理后Kasumi-1细胞表面CXCR4表达升高，而E5-LNP@siAE处理可降低这种上调，提示其在抑制HHT耐药发展中的潜在作用。体内实验进一步证明联合方案在脾脏诱导显著多方向分化，CD11b、CD41a和Ter119水平升高，表明AML细胞向粒系、巨核系和红系方向分化。
**体内安全性评估**
健康C57BL/6小鼠接受LNP@siNC或E5-LNP@siNC给药后，第2天和第4天血常规参数（WBC、RBC、PLT、HGB）与对照组相比无显著变化，各组体重无明显变化。第6天血清肝肾功能标志物（ALT、ALP、TBIL、TBA、BUN）亦无显著异常，提示可忽略的全身毒性。
**讨论与结论**
AML是一种侵袭性血液系统恶性肿瘤，以骨髓中无功能原始髓系细胞的失控快速增殖为特征，源于正常髓系前体细胞分化阻滞，且高度发生耐药和复发。融合蛋白AML1-ETO在抑制多系分化以及促进耐药、白血病发生和疾病进展中起关键作用。
核酸药物治疗被认为是克服化疗耐药和无法纠正遗传缺陷等传统治疗局限的有前景途径，直接针对致病遗传因素而非仅治疗症状。同时，CXCR4/CXCL12轴与AML耐药和复发密切相关，促进白血病细胞与基质细胞相互作用，导致骨髓微小残留病。文献报道了AML1-ETO与CXCR4相互调控的潜在证据：AML1抑制可导致CXCR4下调和迁移活性受损；CXCR4表达可通过AML1调控耐药性。但其在临床应用的探索有限。
该研究中，研究人员构建了新型脂质纳米颗粒平台E5-LNP@siAE，同时利用AML1-ETO RNAi和CXCR4拮抗技术，旨在探究联合效应并开发同时耗竭AML1-ETO融合蛋白和干扰CXCR4/CXCL12轴治疗难治性AML的新策略。结果表明E5-LNP@siAE能诱导最强分化效应。分化诱导治疗是理想策略，可使白血病细胞恢复分化程序，摆脱不成熟状态的无限增殖，并对化疗更敏感。AML1-ETO敲低对解除转录抑制至关重要。研究显示，白血病细胞分化为成熟样细胞后对HHT诱导的凋亡更敏感，联合方案延长了动物生存并诱导最高凋亡率。
CXCR4拮抗有助于在体内外达到显著更好的分化诱导效果。E5作为CXCR4拮抗肽可克服基质介导的白血病细胞保护，驱动白血病细胞离开骨髓和脾脏，使其可能对AML1-ETO的RNAi更敏感。此外，展示于LNP表面的E5使LNP特异性结合CXCR4高表达的AML细胞，增强靶向能力。细胞实验中，E5修饰在LNP@siAE与E5-LNP@siAE之间的AML1-ETO沉默效率优势未充分体现，可能原因是体外两种LNP的摄取差异不如预期大，且部分内化的LNP被困于溶酶体未能充分释放至细胞质，尽管E5修饰增加了内化。因此，递送系统有待进一步优化。体内研究中，E5修饰对AML1-ETO敲低、分化和生存的影响显示出显著优势。
白血病细胞通常处于氧化应激状态，异常高ROS水平帮助细胞发展耐药性。CXCR4拮抗可增强AML1-ETO RNAi功能以显著降低ROS水平，有利于增敏化疗。HHT是从三尖杉属植物中分离的细胞毒性生物碱，作为蛋白质翻译抑制剂，在复发/难治性AML联合治疗中显示优先抗白血病活性。但其治疗窗窄，增加剂量虽可轻微提高效率，却伴随严重副作用，临床应用受剂量相关毒性和耐药性发展的限制。该研究选择相对较低剂量探究E5-LNP@siAE能否改善HHT治疗，结果表明E5-LNP@siAE可提高HHT疗效，延长AML小鼠生存，提示E5-LNP@siAE联合低剂量HHT方案具有临床转化潜力。
总之，该工作构建了脂质纳米颗粒平台E5-LNP@siAE，利用RNAi耗竭AML1-ETO融合蛋白和拮抗阻断CXCR4/CXCL12轴，在Kasumi-1细胞和难治性AML小鼠模型中实现了成功的联合治疗效果。作为单药，E5-LNP@siAE显著降低白血病负担；与化疗药物HHT联合时，显著增强HHT抗白血病疗效。因此，E5-LNP@siAE为难治性AML的治疗提供了一种有前景的靶向治疗策略。
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