副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)重组OmpC和TrxA-OmpC的免疫原性及免疫保护潜力

时间:2026年5月21日
来源:Microbial Pathogenesis

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冯家琪|李文|朱文涛|袁世|王琦|冯浩|潘赛坤|王文斌|史蒂文·苏里亚奥普拉博沃中国江苏省连云港市江苏海洋大学海洋生物资源与环境重点实验室摘要关于外膜蛋白C(OmpC)作为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)疫苗候选物和诊断抗原潜力的研究仍然有限。在本研

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冯家琪|李文|朱文涛|袁世|王琦|冯浩|潘赛坤|王文斌|史蒂文·苏里亚奥普拉博沃
中国江苏省连云港市江苏海洋大学海洋生物资源与环境重点实验室

摘要

关于外膜蛋白C(OmpC)作为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)疫苗候选物和诊断抗原潜力的研究仍然有限。在本研究中,原生态OmpC及其与硫氧还蛋白融合的形式(TrxA-OmpC)在原核系统中成功表达,并对其表面暴露性和免疫原性进行了评估。利用针对多糖缺陷突变株产生的抗血清,研究了OmpC在细菌表面多糖存在下的可及性。通过免疫测定、Western blotting和血清杀菌试验评估了这两种重组蛋白诱导的免疫反应。结果表明,尽管表面多糖部分掩盖了OmpC的表位,但OmpC仍可被细菌表面识别。OmpC和TrxA-OmpC均诱导出了高滴度(27K–729K)的强烈抗体反应,并且与副溶血性弧菌及其他两种弧菌物种存在交叉反应。此外,在1:8的血清稀释度下,TrxA-OmpC抗血清表现出比OmpC抗血清更强的抗体依赖性杀菌活性。这些发现表明OmpC是一种具有良好体外杀菌活性的免疫原性表面抗原,但其体内保护效果仍需进一步研究。

引言

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阴性嗜盐细菌,如海水、海底沉积物和各种海产品中[1]。作为一种典型的食源性病原体,它对人类健康构成严重威胁。特别是食用受污染或未煮熟的海产品(如虾、蟹和贝类)可能导致急性胃肠炎,症状包括剧烈腹痛、频繁腹泻、恶心和发热[2]。在严重情况下,还可能引发伤口感染,尤其在免疫系统受损的人群中更为常见,并可能发展为危及生命的败血症[3]。随着全球海产品消费量的增加和水产养殖业的迅速扩张,食品安全问题日益突出[4,5]。因此,监测和控制副溶血性弧菌至关重要。
副溶血性弧菌拥有复杂的毒力机制和调控系统,能够促进其在宿主体内的定植和组织损伤,包括热稳定的直接溶血素(TDH)、TDH相关溶血素(TRH)以及III型分泌系统(T3SS1和T3SS2),这些系统可释放效应蛋白(TDH、TRH、VopV等),从而引发细胞毒性、肠毒性和全身扩散[6],[7],[8]。由于关键的毒力活性(如黏附、定植、膜完整性和运输)与暴露在表面的成分(OMPs)密切相关,因此OMPs(如OmpU、OmpK和OmpA)在水生动物弧菌病疫苗开发中备受关注[9,10]。OMPs位于细胞最外层,同时也是高度免疫原性的细菌成分[5]。其中一些孔蛋白表达量较高,有助于小分子亲水物质的扩散,并参与病原体与宿主的相互作用[11],[12],[13]。
先前的研究表明,OmpC是亚单位疫苗开发和诊断应用的理想候选物。结合反向疫苗学和表面蛋白质组学的综合方法已确定OmpC为副溶血性弧菌中19种相对特异的外膜蛋白之一[14]。此外,来自Litopenaeus vannamei的血蓝蛋白能够识别副溶血性弧菌的OmpC,这表明其在宿主免疫识别中的作用[15]。还有报道指出,Salmonella Typhimurium的OmpC可通过TLR介导的信号通路刺激抗原呈递细胞,从而触发先天免疫反应并促进长期存在的孔蛋白特异性杀菌抗体的产生以及细胞介导的免疫[16]。
尽管有这些发现,但关于OmpC作为副溶血性弧菌亚单位疫苗候选物和诊断抗原的免疫原性和免疫保护潜力的研究仍然有限。本研究旨在进一步评估其表面暴露性和免疫原性。构建了重组OmpC和硫氧还蛋白(TrxA)-OmpC,并在Escherichia coli BL21中表达。通过检测针对不同多糖突变株产生的抗血清与OmpC的结合情况来评估其表面暴露性。用OmpC蛋白免疫BALB/c小鼠后,通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western blotting和免疫荧光试验评估了血清与弧菌物种和非弧菌分离株的交叉反应性。使用血清杀菌试验(SBA)评估了OmpC血清的保护效果。

章节片段

细菌菌株和生长条件

本研究中使用的细菌菌株列于表S1中。同源突变株ΔLPS(敲除waaE基因)和ΔCPS(敲除包括kpsD、kpsM、kpsTkpsE基因在内的CPS合成簇)是在我们的实验室中使用CICC VP 21618作为亲本菌株构建的。Vibrio spp菌株在添加了3%(w/v)NaCl的Luria-Bertani(LB)培养基中于37°C培养16小时,而其他所有菌株则在标准LB培养基中培养

重组质粒的构建与验证

使用BLAST对Vibrio parahaemolyticus蛋白(登录号:WP_005459338.1)与整个Vibrio属进行了同源性分析。结果显示其与V. alginolyticusV. campbellii具有高序列一致性(70–95%),而与其他Vibrio物种则无显著同源性(图S2A)。对于非Vibrio属,仅与Escherichia coli存在序列同源性(30–60%)。系统发育分析表明目标蛋白与其他V.

讨论

pET-28a-OmpC和pET-32a-OmpC主要产生了OmpC包涵体,而通过尿素梯度重折叠获得了可溶性OmpC和TrxA-OmpC,其构象变化很小。来自可溶性TrxA-OmpC和OmpC的免疫血清显示出高度一致的抗体滴度和交叉反应模式;TrxA-OmpC血清表现出更高的杀菌活性,这可能归因于TrxA的增溶和构象稳定作用。TrxA是一种普遍存在的氧化还原

CRediT作者贡献声明

冯家琪:数据整理、研究、验证、撰写——初稿。李文:验证。朱文涛:研究。袁世:验证。王琦:研究。冯浩:验证。潘赛坤:资源提供、监督。王文斌:概念构思、资金获取、资源提供、监督、撰写——审阅与编辑。史蒂文·苏里亚奥普拉博沃:概念构思、正式分析、撰写——审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系:
王文斌拥有待授权的专利,该专利的优先权和所有权属于江苏海洋大学。本文的通讯作者王文斌和第一作者冯家琪均为该专利的发明人。如果没有其他作者,他们声明没有已知的利益冲突或个人关系

致谢

本工作得到了国家自然科学基金(资助编号:32172284)、江苏省博士后研究计划资金(2021K316C)和连云港市博士后研究资助计划(LYG20210001)的支持。

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