实时荧光定量PCR（RT-qPCR）是基因表达分析的强有力手段，但其准确性高度依赖于用于归一化的稳定参考基因的选择。在海绵（多孔动物门）等非模式生物中，由于生物变异性高、季节性波动大以及分子资源有限，该任务面临严峻挑战。本研究首先在钙质海绵Leucosolenia corallorrhiza中鉴定并验证了候选参考基因。研究人员基于可用的转录组和基因组数据，选取了7种常用看家基因（ACT1、GAPDH、RPL13A、HPRT1、RPS3A、TBP、LMN1），并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder算法，在生理状态及组织再生过程中评估了其表达稳定性。结果显示，RPL13A、ACT1和GAPDH是L. corallorrhiza中最稳定的参考基因。为评估这些基因是否具有更广泛的适用性，研究人员将分析扩展到三个系统发育和生态学上差异显著的物种：Halisarca dujardinii（海洋寻常海绵）、Ephydatia fluviatilis（淡水寻常海绵）和Lycopodina hypogea（食肉海洋寻常海绵）。采用相同分析方法对所有物种的候选基因进行评估。尽管相似的基因子集（包括RPL13A、ACT1和GAPDH）始终位列最稳定候选基因之列，但没有单个基因在所有物种中表现出普遍的稳定性。配对变异分析表明，使用两个参考基因足以实现准确归一化，而以三个排名最高的基因的几何平均值作为归一化因子，可进一步提高重现性并降低假阳性风险，这一点在对RHOA基因进行归一化时得到了证实。总体而言，研究结果表明，海绵中的参考基因稳定性具有物种特异性，不能仅凭生态或系统发育分组可靠预测。同时，研究人员定义了一组稳健的候选参考基因组合，可作为多孔动物门RT-qPCR研究的起点，前提是进行物种和条件特异性的验证。本研究还强调，在未来的研究设计中，必须仔细考虑非模式生物研究中固有的技术挑战。
研究背景与意义
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）凭借高灵敏度、特异性和动态范围成为基因表达测量的核心工具，其准确性极度依赖内参基因对表达数据的归一化校正。然而在多孔动物门（Porifera，俗称海绵）这一早期分支的后生动物类群中，由于缺乏标准化的已验证参考基因面板，加之其组织高度可塑、再生能力强、受季节与环境波动影响大，且分子生物学特征（如基因家族组成独特、骨骼成分干扰RNA提取）与双侧对称动物差异显著，导致现有研究常直接沿用脊椎动物模型中的看家基因而未经验证，使得表达数据的可靠性存疑。为解决这一方法学瓶颈，研究人员开展了针对海绵的系统性参考基因评估研究，成果发表于《PLOS One》。
主要技术方法
研究分为两阶段：第一阶段以钙质海绵Leucosolenia corallorrhiza为对象，利用其再生模型（完整组织IT、再生膜生长阶段CR、再生膜闭合阶段RM）设置实验分组；第二阶段扩展至三个演化与生态背景各异的海绵物种（海洋寻常海绵Halisarca dujardinii、淡水寻常海绵Ephydatia fluviatilis、食肉海洋寻常海绵Lycopodina hypogea）进行跨物种验证。关键技术包括：基于转录组和基因组数据通过互搜BLAST与结构域分析鉴定目标序列；设计特异性引物并进行PCR效率校准；采用CFX96或DTprime系统开展SYBR Green法RT-qPCR；利用geNorm、NormFinder、BestKeeper及RefFinder四种算法综合评估基因表达稳定性；以再生相关基因RHOA为靶标验证不同归一化策略的效果。
研究结果
目标序列鉴定
除LMN1需借助最大似然法系统发育树区分核纤层蛋白与其他中间丝外，其余基因（GAPDH、TBP、RPS3A、RPL13A、HPRT1、RHOA、ACT1）均通过单一拷贝鉴定与结构域验证确认。免疫染色进一步证实了所选ACT1序列编码细胞质肌动蛋白。
Leucosolenia corallorrhiza中候选参考基因的表达变异与稳定性评估
对7个候选基因在14个样本中的循环阈值（Ct）分析显示，ACT1表达量最高，TBP表达量最低。RPL13A和RPS3A表达居中且稳定，HPRT1和TBP变异较大。geNorm分析将RPL13A、RPS3A和GAPDH列为最稳定基因，配对变异系数V2/3值均低于0.15阈值，表明仅需两个参考基因即可实现可靠归一化。NormFinder将ACT1列为最稳定基因。BestKeeper则将GAPDH、RPL13A和ACT1列为最稳定基因。综合三种算法，RPL13A、ACT1和GAPDH表现最优。
参考基因稳定性的跨物种评估
在H. dujardinii中，RPS3A、RPL13A和HPRT1最稳定。在E. fluviatilis中，ACT1、RPS3A和GAPDH最稳定。在L. hypogea中，GAPDH、RPL13A、RPS3A和ACT1最稳定。尽管RPL13A、ACT1和GAPDH常位列前茅，但无单一基因在所有物种中普遍稳定。研究还发现共识工具RefFinder可能产生与独立算法相悖的生物学上不合理排名。
单基因与多基因归一化对RHOA表达的影响
使用单个参考基因归一化会导致RHOA表达量出现显著差异甚至矛盾结果，变异幅度可达1.5倍。而采用RPL13A、ACT1和GAPDH几何平均值计算的综合归一化因子（NF）所得结果更为一致、适中，显著降低了标准偏差，提高了数据重现性。
讨论与结论总结
研究人员强调，在非模式生物中选择参考基因时，必须结合进化信息（如互搜BLAST、结构域预测、系统发育分析）进行严格的序列验证，以避免因序列错误导致的假象。虽然RPL13A、ACT1和GAPDH在特定条件下表现良好，但参考基因稳定性具有物种特异性，无法跨物种通用，也不受生态或系统发育分组的可靠预测。因此，不建议直接套用本研究的基因列表，而应将其作为候选面板，在具体物种和实验条件下重新验证。此外，常用的RefFinder工具可能因未考虑PCR扩增效率而产生误导性排名，建议优先采用多种独立算法综合评估。研究最终证实，采用多个验证过的参考基因（推荐两个，最佳为三个）进行几何平均归一化，能有效遵循MIQE指南，大幅提升海绵基因表达研究的准确性与可靠性，为环境胁迫下的海绵生理学研究提供了坚实的方法学框架。
