量化复杂基质中的食物过敏原受到热加工过程的阻碍，尤其在用于口服食物激发试验（OFCs）的烘焙产品中，关于热加工对临床相关过敏原影响的现有数据十分有限。为解决这一问题，研究人员制备了添加已知过敏原的饼干模型，并使用多重免疫分析阵列或酶联免疫吸附测定法（ELISA）对12种过敏原进行了定量分析。饼干面团中分别添加了来自鸡蛋、牛奶、花生、杏仁、腰果、榛子、核桃、芝麻和大 soy 的致敏原料，总蛋白浓度为1,000 ppm。将40 g面团在185°C或210°C下烘焙15分钟。未加工生面团、完整饼干及其中心与边缘部分使用优化缓冲液在60°C下提取15分钟。与未烘焙生面团相比，烘焙显著降低了可测量过敏原水平，其中降幅最大的是Gal d 1、Gal d 2（鸡蛋）和Bos d 5（牛奶）（86%–98%）。Ara h 3（花生）、Jug r 1（核桃）和Bos d 11（牛奶）受影响最小，降幅为22%–26%。所有过敏原均表现出显著的饼干内部变异，饼干边缘的过敏原水平低于中心。Gal d 1、Gal d 2和Bos d 5受影响最为显著，中心测量值可高达边缘的450倍。这些发现表明热加工对复杂基质中的过敏原定量检测具有差异性影响。这种降低机制可能归因于天然构象表位（conformational epitope）的丢失、表位遮蔽或裂解，或热诱导溶解度降低（包括聚集），这些因素可能影响体内反应性。理解加工效应可能有助于提高OFC材料的安全性和有效性。
烘焙食品作为食物过敏诊断和治疗中常用的过敏原递送载体，其过敏原含量的准确测定对于保障口服食物激发试验（OFC）和口服免疫治疗（OIT）食物阶梯的安全性至关重要。然而，热加工过程会对过敏原的检测产生显著影响，这一问题日益受到关注。现有研究表明，烘焙过程中的温度和条件可导致蛋白质结构发生物理化学变化，包括变性、多肽链裂解和氨基酸修饰，进而造成表位丢失或遮蔽，并形成不溶性蛋白质及聚集体。尽管"总过敏原ELISA"试剂盒已被广泛用于证明热加工后测量过敏原含量的下降，但关于特定临床相关分子蛋白（即能够引发IgE反应的过敏原组分）如何受烘焙影响的研究仍然有限。在此背景下，研究人员开展了本项研究，旨在探究不同烘焙温度及饼干内部取样位置对过敏原免疫分析检测的影响，论文发表于《Frontiers in Allergy》。
研究人员选用无麸质大米粉作为基础基质，这是因为大米粉被指定为OFC/OIT制备中上述小麦粉的替代基质，适用于必须回避小麦的患者。研究制备了添加明确水平主要过敏原来源的模型饼干面团，过敏原来源材料包括鸡蛋、牛奶、花生、 soy、腰果、核桃、杏仁、榛子和芝麻，通过凯氏定氮法测定蛋白质含量后，以总致敏蛋白1,000 ppm的水平进行添加。面团经4°C冷藏处理后，取40 g portions搓成球形，分别在185°C（模拟标准烘焙条件，对应轻度金黄、质地坚实的成品，与已发表OFC食谱或过敏原再引入阶梯的烘焙条件相当）和210°C（模拟过度烘焙及偏离指导条件的情况）下预热火炉中烘焙15分钟。烘焙后获得完整饼干及其边缘与中心 sub-samples，经均质化处理后进行提取分析。过敏原提取采用两种针对饼干基质优化过的缓冲液体系：0.05 M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液（含10%鱼明胶，pH 9.6）用于Bos d 11分析；PBS缓冲液（含2% Tween-20、1 M NaCl、10%鱼明胶、1% PVP，pH 7.4）用于其余过敏原分析，提取条件为60°C、175 rpm振荡15分钟。
研究人员采用两种免疫分析技术进行过敏原定量：对于Cor a 9、Gly m 5和Gal d 1，使用商业化ELISA 2.0试剂盒（InBio, Charlottesville, VA）进行检测；对于Gal d 2、Ara h 3、Ara h 6、Bos d 5、Bos d 11、Pru du 6、Ana o 3、Jug r 1和Ses i 1，则采用基于xMAP平台的多重免疫分析（MARIA for Foods custom kit, InBio, Charlottesville, VA）。这些免疫分析方法均采用过敏原特异性单克隆或多克隆抗体对的夹心免疫分析模式，并以纯化特异性过敏原蛋白进行校准。
研究结果部分包含以下主要内容：
**烘焙对过敏原检测的影响**
研究人员评估了185°C和210°C烘焙15分钟对过敏原回收率的影响。与未烘焙饼干面团相比，185°C烘焙后所有 investigated 过敏原的可测量水平均显著降低，且在210°C时进一步显著下降（P ≤ 0.05）。受影响最为严重的是牛奶和鸡蛋过敏原：Bos d 5在185°C时降低7.3倍，210°C时降低达43倍；Gal d 2在185°C时降低约30倍，210°C时降低超过450倍；Gal d 1在185°C和210°C时分别降低39倍和56倍。相比之下，Bos d 11表现出较高的热稳定性，185°C时仅降低1.3倍，210°C时降低4.5倍。花生过敏原Ara h 3和Ara h 6、树坚果过敏原（Pru du 6、Ana o 3、Jug r 1、Cor a 9）、芝麻过敏原Ses i 1以及 soy 过敏原Gly m 5也呈现不同程度的降低，且在210°C时所有过敏原水平均低于185°C时的一半。值得注意的是，树坚果、花生和芝麻过敏原在185°C烘焙饼干中保留了约50%以上的可检测过敏原含量（约2倍降低），显示出相对较高的热加工抗性。
**烘焙饼干内部特定过敏原水平的变异**
研究人员对185°C烘焙饼干的均质化中心、完整饼干和均质化边缘进行了比较分析。结果显示，饼干中心与边缘之间存在显著的过敏原水平差异。动物源性过敏原表现出最大的内部变异：Gal d 2变异8.9倍，Bos d 5变异达17倍；非动物源性过敏原中Gly m 5变异最大（5倍）。花生过敏原Ara h 3和Ara h 6变异较小（分别为2.8倍和2.5倍）。树坚果和芝麻过敏原的内部变异为2.2至4.3倍。当比较完整均质化饼干与中心的过敏原水平时，仅Ara h 3、Ara h 6、Bos d 11、Ana o 3和Jug r 1无显著差异（P > 0.05），表明即使经过均质化处理，烘焙食品内部仍存在过敏原分布的不均匀性。
以未烘焙饼干面团为基准计算百分比回收率发现，除Bos d 11外，牛奶和鸡蛋的动物源性过敏原对热处理的敏感性最高：Gal d 1和Gal d 2在所有烘焙样品中的回收率均不超过16%；Bos d 5完整饼干的回收率降至14%，而Bos d 11仍保持74%的高水平。185°C烘焙饼干边缘的过敏原回收率范围为1%–41%，210°C过度烘焙时进一步降至0%–15%。
在讨论部分，研究人员首先强调了烘焙食品在过敏诊断和治疗中的广泛应用背景，指出利用烘焙降低某些过敏原（如牛奶和鸡蛋）的致敏性可促进更安全的早期激发/治疗阶段，但强调需要关注到组分过敏原层面的差异性，如Bos d 11的高度热稳定性可能解释部分对牛奶过敏患者的反应。本研究结果与Hindley等人在牛奶松饼中的发现一致，证实了Bos d 11对烘焙的抵抗性和Bos d 5的高度敏感性，同时扩展了对鸡蛋（Gal d 1、Gal d 2）及其他多种食物来源临床相关过敏原的研究。研究人员指出，210°C过度烘焙条件下过敏原水平的进一步降低提示家庭制备OFC食品时可能存在的操作变异性问题，呼吁考虑标准化挑战餐食的重要性。
研究人员还探讨了过敏原降低的可能机制：Gal d 1、Gal d 2和Bos d 5已被证实在研究采用的烘焙温度以下即可发生变性，导致构象表位丢失或形成不溶性聚集体；对于其他稳定保留检测活性的过敏原，则可能维持了天然且易于提取的结构。研究人员同时指出了本研究的局限性：基于murine IgG的免疫分析所识别的表位是否与IgE反应性相关、这些表位属于线性还是构象表位，尚不明确；检测到的过敏原降低可能源于变性、热解裂解、氨基酸修饰（如美拉德反应）导致的表位丢失，或是由于聚集沉淀造成蛋白溶解度下降而非真正降解。质谱技术（MS）可用于确定目标蛋白是否仍存在于溶液中。研究人员展望了未来研究方向，包括利用源自食物过敏患者的人IgE单克隆抗体（hIgE mAb）更深入地研究烘焙对实际IgE表位的影响，以及采用INFOGEST消化方案模拟消化过程以评估过敏原的生物可利用性。
