甾体药物是现代医药领域中不可或缺的组成部分，具有广泛的生物活性，涵盖抗炎、抗感染、抗肿瘤及生殖调节等多种药理作用。当前，甾体化合物的生产已从传统的直接提取和化学半合成转向微生物生物转化，其中利用低成本植物甾醇（phytosterol）制备关键甾体中间体已成为工业生产的金标准。新金色分枝杆菌（Mycolicibacterium neoaurum）因其高效的甾体分解代谢能力而成为首选的工业宿主菌株。尽管甾体母核的降解途径已有较详尽的文献记载，但C17侧链断裂的分子机制仍未完全阐明，这限制了通过精确代谢工程优化工业产量的能力。5 至Δ4 ）及末端C27羧基化，随后侧链经历类似β-氧化的循环逐步缩短至关键中间体22-羟基-3-氧代-胆甾-4-烯-24-羧基-辅酶A（22-OH-BNC-CoA, 1a）。该分子作为重要的代谢分支点，既可继续经β-氧化完全分解为4-雄烯二酮（4-AD），也可进入C22甾体分支（Branch I），经醛缩酶和还原酶催化反应生成20-羟甲基孕烯-4-烯-3-酮（4-HBC）。近期研究表明，敲除下游3-氧代-4-孕烯-20-羧基-辅酶A（OPC-CoA, 2a）脱氢酶（ChsE1-E2）和3-氧代-4,17-孕二烯-20-羧基-辅酶A水合酶（ChsH1-H2）可导致C22甾体甲酯——即OPC甲酯（OPCM, 3）和OPDC甲酯（OPDCM, 4）的积累，这两种甲酯均为合成孕激素类药物的关键中间体。虽然羧甲基转移酶（OPC_MTs）可催化该甲基化反应，但其活性提示存在第二C22甾体分支（Branch II）。在此推测途径中，酰基辅酶A硫酯酶（Acyl-CoA Thioesterases, TEs）被认为发挥关键作用，通过水解释放游离酸底物以供进一步的酶促转化。酰基辅酶A硫酯酶是一类普遍存在的酶家族，具有多样的生理功能，涵盖哺乳动物胆汁酸水解至分枝杆菌潜在药物靶点等多个方面。然而， specifically参与甾体酰基辅酶A水解的硫酯酶迄今研究甚少。
该研究发表于《Green Synthesis and Catalysis》，旨在系统阐明酰基辅酶A硫酯酶在新金色分枝杆菌植物甾醇侧链降解中的作用机制，并构建高效的甾体中间体生物催化平台。
研究人员首先面临的核心科学问题在于：尽管已知羧甲基转移酶能够催化C22甾体甲酯的形成，但Branch II途径中游离羧酸的来源尚未明确，这成为理解该代谢分支完整机制的关键瓶颈。工业层面，传统化学合成甾体药物面临多步骤复杂工艺及显著环境污染问题，而现有微生物转化途径中甲酯与游离酸产率仍有待提升，亟需通过代谢工程精准调控代谢流量以实现高效、绿色的甾体中间体生产。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：基因组生物信息学分析（基于已知酰基辅酶A硫酯酶序列进行全基因组搜索与系统发育分析）；重组蛋白异源表达与纯化技术（在大肠杆菌BL21(DE3)中表达N端6×His标签融合蛋白）；超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）及气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行代谢物定性与定量分析；基于DTNB显色法的酶动力学参数测定（k
cat 、K
m 、K
i ）；AlphaFold蛋白质三维结构预测与分子对接分析；以及在新金色分枝杆菌工程菌株mJTU3（ΔchsE1-E2/ΔchsH1-H2/ΔkstD）中的基因过表达与发酵验证。其中，菌株来源为新金色分枝霉菌CCTCC AB 2019054。
研究结果部分，研究人员首先通过基因组学鉴定了17个候选酰基辅酶A硫酯酶。基于已表征的分枝杆菌硫酯酶结构信息（PDB: 3U0A的热狗折叠蛋白及PDB: 6FW5的α/β-水解酶）作为查询序列，对M. neoaurum（CCTCC AB 2019054）进行全基因组搜索，获得17个推定基因mnTE1–mnTE17。值得注意的是，前期在高产9-OH-AD途径中鉴定的teB与MnTE3具有96.53%的序列同一性，而与其余16个酶的同一性低于35%。系统发育分析纳入ThYme数据库中跨动物、植物、真菌和细菌20个属的代表性序列，通过MAFFT多序列比对构建了这些候选酶的进化关系图谱。
在体外生化特性分析方面，研究人员合成了OPC-CoA（2a）底物，并对纯化的可溶性酶进行活性评估。UPLC-MS分析结果显示，16个可溶性候选酶中（MnTE1–16），14个MnTE对2a表现出可检测的水解活性，而MnTE15和MnTE16在测试条件下无活性。其中7个酶（MnTE2、MnTE4、MnTE5、MnTE9、MnTE10、MnTE11和MnTE12）在5分钟内转化超过50%底物，MnTE4、MnTE5、MnTE9、MnTE10和MnTE11活性最高，转化率超过80%。研究还检测到去磷酸化副产物OPC-dP-CoA，该产物可能源于2a的自发水解，但不影响酶学测定，因为MnTE同样能有效水解OPC-dP-CoA生成目标产物OPC（2b）。
酶动力学特性分析揭示，选取的5个高活性酶进行详细动力学研究。通过DTNB显色法监测游离辅酶A（CoA-SH）释放，数据拟合Michaelis-Menten模型。结果显示MnTE9、MnTE10和MnTE11具有较高催化效率，其中MnTE9的k
cat /K
m 值最高（379.03 L·mmol
-1 ·min
-1 ）。而MnTE4和MnTE5表现出显著的底物抑制现象，抑制常数K
i 分别为0.16 mmol/L和0.12 mmol/L。
底物特异性谱分析表明，研究人员对7个高活性MnTE进行了7种结构多样性酰基辅酶A的筛选，包括甾体衍生物（1a、2a、5a）、短链脂肪酸酰基辅酶A（6a）、支链酰基辅酶A（7a）及芳香族酰基辅酶A（8a、9a）。结果呈现出不同的催化特征谱：（1）MnTE4和MnTE5对甾体底物（1a和2a）具有强偏好性，但MnTE4对含不饱和侧链双键的22(23)-烯-BNC-CoA（5a）活性显著降低，提示其对侧链双键的位阻敏感性；（2）MnTE2和MnTE12偏好芳香族（8a）及大位阻甾体底物，但MnTE12对羟基化1a的活性较弱；（3）MnTE9–MnTE11表现出显著的催化灵活性，在所有测试底物中均保持高活性，表明这些酶具有高度可适应的底物特异性。
蛋白质结构基础分析方面，通过AlphaFold预测三维结构发现，MnTE1–15呈现特征性的热狗折叠（hotdog-fold），具有中心α-螺旋环绕β-折叠的结构特征，而MnTE16为α/β-水解酶。MnTE4/5与大肠杆菌硫酯酶（PDB: 1C8U）类似，形成同源二聚体，具有紧凑、疏水的单亚基活性位点，有利于甾体底物结合。相反，MnTE9–11与红球菌硫酯酶（PDB: 2OV9）及人源硫酯酶hTHEM4（PDB: 4GAH）类似，在二聚体界面处具有更灵活、开放的活性位点，从而能够容纳更多样化的底物。分子对接结果进一步证实：MnTE4的催化三联体（D183、T207、Q257）深埋于结合口袋中心α-螺旋内，T207与2a形成氢键，使甾体辅酶A底物锚定于疏水内部；而较小底物7a和8a在该刚性催化腔中结合较浅。MnTE9的对接位点位于亚基界面，催化口袋靠近外围柔性环区，催化残基D133位于蛋白表面，这些结构特征赋予其增强的水解活性和更大的底物宽容性。
体内代谢验证与工程应用方面，研究人员选择MnTE9、MnTE10和MnTE11进行体内验证，将其克隆至整合型质粒pMV307并转化入工程菌株mJTU3（ΔchsE1-E2/ΔchsH1-H2/ΔkstD）。为简化中间体生产，将MnTE与甲基转移酶MnMT4共表达以促进末端羧基甲基化。发酵分析显示，MnTE9共表达菌株实现了最显著的代谢重定向：在1 g/L植物甾醇补料条件下，生物转化产生194.72 mg/L 3-OPC、284.06 mg/L 3-OPDC和282.98 mg/L 3-OPDCM，总摩尔转化率达92%。相对于对照菌株，3-OPC、3-OPDC和3-OPDCM的产量分别提高95%、88%和59%。对照色谱图中的微小峰对应发酵背景，不干扰目标C22甾体代谢物的鉴定。这些发现证实鉴定的MnTEs能够有效水解体内甾体-辅酶A中间体，成功克服既往代谢瓶颈。
在讨论与结论部分，研究人员总结了以下核心要点：传统甾体药物的化学合成常受复杂多步工艺和显著环境足迹的制约，而甾醇的微生物生物转化提供了更高效、可持续且"绿色"的替代方案。该研究系统阐明了酰基辅酶A硫酯酶在M. neoaurum植物甾醇侧链降解途径中的作用，鉴定并表征了在先前未被识别的C22甾体代谢分支（Branch II）中运作的酰基辅酶A硫酯酶家族（MnTE1–14）。研究发现MnTEs对 bulky甾体酰基辅酶A中间体表现出广泛的底物耐受性和高催化效率。AlphaFold结构建模为此特异性提供了分子基础，凸显了主导酶的多聚体组织和灵活的活性位点结构。通过在工程化M. neoaurum菌株中过表达这些MnTEs，研究人员成功实现了代谢流量的重新布线。该项工作不仅填补了甾醇分解代谢理解中的关键空白，同时也为甾体中间体的可持续生产建立了高性能的生物催化平台。
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