细菌生物膜在临床环境中十分普遍，可导致与医疗器械相关的持续性感染。阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）可在非生命表面上形成生物膜，导致难以治疗的耐药性和复发性感染。包括阴沟肠杆菌在内的肠杆菌属（Enterobacter）物种的生物膜发育经历五个阶段：可逆附着、不可逆附着、微菌落形成、成熟和分散。初始附着由黏附素介导，包括菌毛和脂多糖，它们与表面相互作用。随后分泌由多糖、胞外DNA（extracellular DNA, eDNA）和蛋白质组成的胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）基质，提供稳定性和保护。本研究旨在建立标准化的体外0.5%结晶紫（crystal violet）染色法，以量化阴沟肠杆菌分离株的生物膜产量，并根据生物膜形成能力对分离株进行分类。生物膜通过570–600 nm的光密度（optical density, OD）进行量化。一项96孔微孔板测定法量化了2021年7月至2023年4月期间收集的40株阴沟肠杆菌菌株的生物膜形成情况。研究人员优化了生长条件，包括培养基、固定技术和葡萄糖及氯化钠的添加剂浓度。脑心浸液（brain heart infusion, BHI）肉汤为最适培养基，热固定优于化学固定；葡萄糖无影响，而1%–2%氯化钠增强了生物膜产量。这些发现增进了对跨生境生物膜形成的环境调控及微生物持久性的理解。
本文解读的论文《Species-Specific Optimisation and Environmental Regulation of Biofilm Formation in Enterobacter cloacae: Inhibitory Role of Glucose in Biofilm Development》发表在《Environmental Microbiology Reports》。该研究围绕临床和环境中的重要机会致病菌——阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae，简称E. cloacae）的生物膜形成机制展开。
研究背景方面，细菌生物膜（Biofilm）是附着在生物或非生物表面并被自我产生的胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substance, EPS）基质包裹的微生物群落。在临床环境中，E. cloacae 常在导管、假体等医疗器械上形成生物膜，引发血流感染、肺炎、尿路感染、伤口感染等机会性感染。生物膜内的细菌对抗生素和宿主免疫反应的耐受力是浮游状态细菌的10–1000倍，约80%的人类细菌感染与生物膜有关。目前，不同环境因子（如营养可用性、渗透压、温度等）如何调控E. cloacae 的生物膜形成，尚缺乏系统标准化的体外研究，且不同菌株间的异质性较大，这限制了对其生态适应和临床防控策略的理解。
为探究此问题，研究人员开展了一系列体外标准化实验。研究人员收集了40株于2021年7月至2023年4月间从临床标本（血液、脓液、尿液、痰液、体液及粪便）中分离的阴沟肠杆菌，利用物种特异性PCR引物（EC-F和EC-R，靶向氨基酰化酶基因）进行了分子鉴定。随后，研究人员建立并优化了基于96孔微孔板的结晶紫（Crystal Violet, CV）染色定量方法，系统评估了不同培养条件——包括培养基类型（如BHI）、固定方式（热固定与化学固定）、孵育时间（24、48、72小时）以及环境添加剂（葡萄糖 0.5%–4%、氯化钠 0.5%–4%）——对生物膜形成能力和活菌计数（Colony Forming Unit, CFU）的影响，并根据OD值 cutoff对菌株的生物膜形成能力进行了弱、中等、强三个等级的分类。
主要技术方法包括：从临床样本中分离40株阴沟肠杆菌分离株，使用物种特异性PCR（引物EC-F/EC-R）进行分子鉴定；采用96孔微孔板法，在脑心浸液（BHI）肉汤中培养生物膜，设置不同浓度的葡萄糖（0.5%–4%）和NaCl（0.5%–4%）作为环境胁迫因子，比较热固定（65°C，15分钟）与化学固定（2%乙酸钠，37°C，30分钟）的效果，并在24、48、72小时三个时间点进行评估；使用0.5%结晶紫染色，乙醇洗脱后于OD570 nm读数以量化生物膜生物量；同时通过标准平板计数法（CFU）评估不同处理下的活菌数量。
研究结果如下：
1 细菌分离株的鉴定
研究人员利用物种特异性引物EC-F和EC-R对40株肠杆菌属分离株进行PCR鉴定，均在约397 bp处出现特异条带，确认所有分离株均为阴沟肠杆菌（E. cloacae）。
2 40株阴沟肠杆菌分离株的生物膜形成
以仅含BHI肉汤的阴性对照平均OD值（0.108 ± 0.0098）设定OD截断值（OD cut-off, ODC）为0.137。根据OD值，40株菌中15%为非生物膜形成者（OD ≤ 0.137），20%为弱生物膜形成者（0.137 < OD ≤ 0.274），50%为中等生物膜形成者（0.274 < OD ≤ 0.548），15%为强生物膜形成者（OD > 0.548）。分离株主要来源于尿液（45%）和脓液（37.5%）。
3 孵育时间的影响
在24至72小时的孵育期内，24小时孵育对生物膜发育无显著影响；72小时孵育后观察到最高的生物膜生物量，尤其是在轻度盐胁迫条件下。
4 固定条件
研究人员比较了热固定（65°C，15分钟）和化学固定（2%乙酸钠）。两者在72小时、轻度盐胁迫下均能促进生物膜形成，但热固定在NaCl富集肉汤中经72小时孵育后，能最有效地可视化和量化生物膜形成。
5 糖（葡萄糖）的影响
在培养基中添加葡萄糖（0.5%–4%）显著影响了E. cloacae 的生物膜形成能力。与阳性对照（不添加补充剂的肉汤）相比，添加葡萄糖后吸光度（OD）显著降低，表明葡萄糖抑制了生物膜形成。在热固定条件下，0.5%葡萄糖浓度时活细胞计数增加1个对数（log），而在1%–3%葡萄糖浓度时活细胞计数减少4个对数。
6 盐（NaCl）胁迫的影响
添加NaCl显著增强了生物膜形成，且在1%–2% NaCl浓度时生物膜形成显著增加；一旦超过阈值（>2%），无论其他变量如何，这种能力迅速下降。在热固定条件下，1%–2% NaCl浓度孵育72小时后活菌计数增加1个log，而化学固定步骤中未观察到活菌计数增加；在3%–4% NaCl浓度下，72小时内细菌计数下降，且在24至48小时孵育期间最终未见到活菌计数增加。
7 不同处理顺序下通过标准CFU计数评估活细胞计数
7.1 阴沟肠杆菌在不同氯化钠浓度下的活细胞计数
NaCl浓度（0.5%–4%）显著影响E. cloacae 的生物膜形成能力。比较不同NaCl浓度下的固定条件和孵育时间，在轻度盐胁迫下孵育72小时后观察到最有效的生物膜。热固定条件下1%–2% NaCl浓度活菌计数增加1个log，化学固定中无增加；3%–4% NaCl浓度下72小时内细菌计数下降，24至48小时孵育期间无活菌计数增加。
7.2 阴沟肠杆菌在不同葡萄糖浓度下的活细胞计数
不同浓度葡萄糖（0.5%–4%）用于标准化E. cloacae 的生物膜。添加葡萄糖抑制了E. cloacae 的生物膜形成能力。热固定条件下0.5%葡萄糖浓度活细胞计数增加1个log，而1%–3%葡萄糖浓度下活细胞计数减少4个log。
讨论与结论总结：
研究人员在讨论中指出，生物膜是结构化的微生物群落，其基质主要由EPS、胞外多糖、纤维状蛋白和eDNA组成，为微生物群体提供结构完整性和保护。E. cloacae 在塑料等表面形成生物膜的能力在医疗和工业环境中均构成问题。本研究证实E. cloacae 在实验室条件下形成可重复的生物膜，BHI提供了合适的富营养环境。环境条件，尤其是孵育时间，是生物膜发育的主要决定因素；72小时孵育后观察到最大生物膜生物量，表明长时间孵育有助于生物膜架构的成熟和稳定。
关于固定方法，热固定（65°C，15分钟）优于乙酸钠化学固定，因为它能有效降低细菌活力、简化后续操作、稳定EPS并增强生物膜基质对底物的粘附，减少清洗和染色过程中的生物量损失，从而保留生物膜结构完整性并改善结晶紫滞留。
值得注意的是，葡萄糖补充显著抑制了E. cloacae 的生物膜形成，表明碳源可用性的增加抑制了定居群落的发展。这可能与细菌偏好利用葡萄糖作为易得碳源，使代谢转向浮游生长而非EPS生产和表面附着有关；葡萄糖也可能通过分解代谢物阻遏（catabolite repression）途径抑制生物膜相关基因表达和EPS合成。而从环境角度看，这种葡萄糖依赖的抑制表明富营养环境可能降低生物膜形成的选择压力，而营养限制可能促进作为生存策略的定居适应。相反，1%–2% NaCl补充增强了生物膜形成，但较高盐浓度下这种刺激效应减弱。轻度渗透胁迫可能刺激EPS合成、增强细胞表面疏水性并上调与粘附和 biofilm 基质生产相关的基因，从而促进表面定殖；但过度的渗透胁迫可能超出细菌生理耐受极限，导致活力降低和生物膜形成受损。
结论部分指出，E. cloacae 作为一种机会致病菌，常引起医院获得性感染（如败血症、肺炎、尿路感染等）。BHI和TSB（胰蛋白胨大豆肉汤）均适用于培养其生物膜，但温度和孵育时间显著影响生物膜形成。医院内肠杆菌感染在经济和患者预期寿命上负担沉重，因此需要新的感染控制策略。E. cloacae 形成生物膜（尤其在医疗器械上）的能力及其与抗生素耐药性获得的关联，应提高对该病原体在医院环境中风险的认识。生物膜生长模式使细菌对抗生素治疗的耐受性提高达1000倍，这与其内部缓慢的生长速率有关，而非仅仅因生物膜基质限制药物分子穿透。未来需探索 virulence因子及控制机制，研究物理、化学或生物技术手段（如源自天然产物的抗生物膜剂或群体感应（Quorum Sensing, QS）干扰策略）以破坏生物膜群落。此外，了解营养和盐度梯度作为微生物表面定殖的生态决定因素，有助于研究E. cloacae 在环境储库、废水系统、生物污损群落和宿主相关微生物组中的持久性。
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