肿瘤边界的术中精准界定仍然是一项重大的临床挑战，因为传统荧光成像会受到探针浓度、组织异质性以及成像条件的显著影响。研究人员在此报道了一种可经肾清除的肿瘤靶向分子探针NY-07，用于借助近红外二区（NIR-II）荧光寿命（FLT）成像对肿瘤边界进行定量界定。NY-07通过将一种基于花菁（cyanine）的荧光团与培美曲塞（pemetrexed）这一主动靶向配体偶联构建而成，从而获得了具有良好临床相容性的探针，并表现出优异的溶解性、高光学稳定性以及高效的肾清除特性。NY-07在NIR-II窗口中表现出尾部发射，其稳定荧光寿命为480 ± 0.6 ps；在相同浓度下，其NIR-II亮度约为吲哚菁绿（ICG）的2倍，同时在储存7 d后仍可保留约70%的NIR-II信号。体内成像表明，NY-07可快速经肾排泄，注射后数秒内即可在肾脏和膀胱观察到强信号，而肝脏蓄积极少。借助细胞模型、荷瘤小鼠以及患者来源组织，研究人员证明NY-07能够实现靶标特异性的NIR-II FLT成像，并基于不同的寿命特征对肿瘤、炎症与正常组织进行定量区分，从而在不依赖探针浓度和成像参数的情况下实现肿瘤边界的精确可视化。与传统NIR-II荧光强度（FLI）成像相比，FLT成像可显著减少假阳性信号，并改善复杂生物环境中的边界定义。本研究建立了一种可临床转化的策略，将肾清除、肿瘤主动靶向与寿命分辨成像加以整合，用于肿瘤边界的功能性界定，并为提升手术精度及推动下一代肿瘤图像引导外科发展提供了稳健平台。
该文发表于《Materials Today Bio》，围绕肿瘤切除过程中“如何更准确地识别肿瘤边界”这一核心临床问题展开。肿瘤边界判定不准确会直接影响切除彻底性、正常组织保护以及术后复发风险，因此术中高精度导航一直是肿瘤外科的重要研究方向。与近红外一区成像相比，近红外二区（NIR-II）具有更强的组织穿透能力、更低的组织自发荧光和更高的信背比，因此在术中边界显示方面具有明显优势。然而，现有多数NIR-II探针仍主要依赖荧光强度（FLI）成像，易受探针亮度、局部分布不均、组织光学差异和仪器参数设置影响，导致假阳性增加、边界显示不稳定。另一方面，荧光寿命（FLT）成像由于反映的是荧光衰减动力学参数，理论上不依赖探针浓度和拍摄条件，更适合复杂手术环境中的定量识别。但此前相关探针在代谢途径、安全性和临床转化可行性方面仍存在限制。基于此，研究人员开发了可经肾清除、具肿瘤主动靶向能力且适用于NIR-II FLT成像的小分子探针NY-07，旨在实现肿瘤边界的定量化、功能性界定。
为完成该研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先合成并表征了NY-07分子，利用质谱和核磁共振确认其结构；随后通过紫外-可见-近红外光谱、稳态/瞬态荧光光谱和时间分辨检测系统评价其光谱学性质、NIR-II亮度及荧光寿命。研究进一步结合细胞共聚焦成像、流式细胞术和CCK-8实验验证其叶酸受体α（FRα，folate receptor alpha）介导的主动靶向能力及细胞相容性；通过健康小鼠和荷瘤小鼠活体NIR-II成像分析其体内分布、经肾清除特征、肿瘤靶向性和生物安全性；最后借助自建介观NIR-II FLT显微系统，对小鼠肿瘤组织、慢性炎症模型组织以及10例患者来源肺腺癌组织样本进行了寿命成像验证。
2.1. NY-07探针的NIR-II FLI和FLT性质
研究人员首先对NY-07的理化与光学性质进行了系统评估。结果显示，NY-07由培美曲塞与ICG衍生物共价偶联而成，分子结构得到质谱与核磁共振验证。其吸收峰位于774 nm，发射峰位于795 nm，同时具有延伸至NIR-II窗口的长波尾部发射。与临床常用ICG相比，NY-07在相同浓度下具有更高的NIR-II荧光亮度。时间分辨测试表明，其NIR-II荧光寿命为480 ± 0.6 ps，与ICG相近，但明显短于稀土掺杂纳米晶，有利于缩短采集时间、提高成像效率。此外，NY-07的抗光漂白能力和储存稳定性均明显优于ICG，且在葡萄糖、盐水和PBS中均具有良好溶解性，无明显聚集或沉淀。这些结果表明NY-07兼具适宜的寿命特征、良好的稳定性和临床制剂适配性。
2.2. NY-07探针在NIR-I和NIR-II窗口中的成像深度
研究人员利用1%脂肪乳组织模拟模型比较了NY-07在NIR-I与NIR-II窗口中的穿透表现。结果表明，随着覆盖深度增加，荧光信号均逐步衰减，但NY-07在NIR-II区域的最大成像深度达到6 mm，高于NIR-I中的4 mm。定量分析显示，在各测试深度下，NIR-II成像均具有更高的信背比（SBR）和更小的半高全宽（FWHM），说明其在深部组织中的分辨能力更优。与ICG相比，NY-07在相同条件下也展现出更好的NIR-II成像深度和对比度，提示其更适用于复杂组织环境中的深层边界成像。
2.3. NY-07的体外主动靶向成像
为验证主动靶向能力，研究人员选用FRα高表达的SK-OV-3卵巢癌细胞和FRα低表达的A549细胞进行比较。共聚焦成像显示，NY-07在SK-OV-3细胞内产生强烈胞质荧光，而加入叶酸（FA）竞争阻断后信号明显减弱，在A549细胞中仅见微弱信号。流式细胞术进一步证实，SK-OV-3细胞中的平均荧光强度分别约为阻断组的1.7倍、A549组的7.4倍，表明其摄取主要依赖FRα介导。进一步的体外FLT成像显示，SK-OV-3细胞中的荧光寿命为0.75 ± 0.04 ns，显著长于A549细胞中的0.48 ± 0.03 ns，说明探针与FRα特异性结合可引起寿命延长。细胞毒性实验则表明，在0–200 μM范围内两种细胞活力均高于90%，支持其良好体外生物相容性。
2.4. NY-07的肾清除特性
在健康Balb/C小鼠体内，NY-07静脉注射后数秒内即在肾区出现明显信号，并很快在膀胱区观察到强荧光，提示其快速经肾-膀胱通路排泄。离体器官成像显示，主要荧光集中于肾脏，心、肝、脾和肺中信号很低。定量结果表明，24 h内约有56.96 ± 3.84%的注射剂量经尿液排出。相比之下，ICG主要聚集于肝脏，符合肝胆代谢特征。药代动力学分析显示，NY-07在血液中的清除半衰期（t
1/2）为2.77 min，肾清除速率常数为0.25 h
-1。这些结果说明NY-07具有快速、明确的经肾清除路径，降低了肝脏蓄积风险，也为肝功能受损或肝肿瘤患者提供了潜在替代选择。
2.5. NY-07的体内肿瘤靶向性
在SK-OV-3和A549荷瘤小鼠模型中，研究人员进一步评估了NY-07的体内肿瘤识别性能。结果显示，NY-07在SK-OV-3肿瘤部位于注射后2 h即可被清晰观察到，且随时间推移肿瘤区域SBR持续上升，6 h后已超过临床上用于肿瘤判别的阈值3，24 h达平台期，最大值为4.44。相比之下，A549肿瘤或ICG处理的SK-OV-3肿瘤，其SBR始终较低且未超过3。离体器官和肿瘤成像同样证实，NY-07在SK-OV-3肿瘤中的富集显著高于A549组和ICG组，肿瘤离体荧光强度分别为后两者的1.99倍和6.53倍。叶酸竞争阻断实验进一步证明，其体内肿瘤蓄积依赖FRα特异性靶向。与此同时，体重、主要脏器H&E染色以及肝肾功能指标均未见明显异常，表明NY-07具有较好的体内生物安全性。
2.6. 体内NIR-II FLT成像
研究的关键创新在于将NY-07用于体内NIR-II FLT成像，并与传统FLI进行直接比较。研究人员在SK-OV-3荷瘤小鼠中使用自建介观NIR-II FLT显微镜，于注射后24 h进行成像。结果表明，FLI虽可显示肿瘤区域，但信号分布不均匀，边界轮廓受局部强度差异影响明显，不利于精确判读；相对而言，FLT成像呈现更均一、更清晰的肿瘤轮廓。定量分析显示，FLT测得肿瘤面积为18.98 ± 0.17 mm
2，高于FLI的12.71 ± 0.87 mm
2；以H&E病理结果为金标准，FLT对肿瘤边界界定的准确率达到91.35%，显著优于FLI的61.34%。同时，在不同SBR阈值下，FLI显示的边界明显变化，而FLT显示基本稳定，说明FLT对成像参数变化不敏感，更适合术中实时导航。
为进一步考察特异性，研究人员将NY-07与肿瘤、肌肉、心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织共同孵育。虽然正常组织因非特异性吸附也存在一定荧光信号，但肿瘤组织荧光寿命为0.778 ± 0.029 ns，显著长于肌肉、心脏、肝脏、脾脏和肾脏，表明FLT可有效克服非特异性吸附对强度成像造成的干扰。患者来源临床癌组织中也观察到肿瘤组织寿命长于正常组织的相似结果，支持其临床适用性。
随后，研究人员构建了肿瘤邻近慢性炎症模型，以检验探针区分肿瘤和炎症组织的能力。结果显示，在FLI图像中，肿瘤与炎症区均存在荧光，难以区分；而在FLT图像中，两者边界清晰可辨，肿瘤区平均寿命为0.78 ± 0.08 ns，炎症区为0.58 ± 0.06 ns。该结果表明，NY-07介导的FLT成像能够降低炎症导致的假阳性，从而提高复杂病灶周围肿瘤边界判定的准确性。
综合全文，研究讨论部分强调，传统基于荧光强度的肿瘤导航容易受到探针剂量、组织吸收散射、局部富集不均和成像参数设定等多重因素干扰，这些局限在真实手术环境中尤为突出。NY-07通过经肾清除的小分子设计降低了肝脏背景和代谢负担，通过培美曲塞赋予FRα介导的主动靶向能力，并进一步借助NIR-II FLT这一与浓度和成像条件相对独立的成像读出方式，实现了从“看见信号”到“识别组织功能状态”的转变。研究数据一致表明，相较于FLI，FLT在肿瘤、正常组织和炎症组织之间具有更高的判别效能，尤其在边界复杂、背景异质性强的场景中展现出更稳健的定量能力。因此，该研究不仅提出了一个性能均衡、具临床转化潜力的分子探针，也验证了NIR-II FLT作为精准肿瘤外科成像工具的重要价值。
研究结论部分可译为：总之，本研究通过整合可经肾清除的探针工程、主动靶向设计与NIR-II FLT成像，建立了一种具有临床转化前景的肿瘤边界精准界定策略。该方法克服了传统基于强度的成像在复杂手术环境中的固有局限。依托于本征上不受探针浓度和组织光学异质性影响的寿命编码对比，该平台能够准确区分恶性组织、炎症组织与正常组织，从而支持可靠的术中导航与更完整的肿瘤切除。该平台表现出优异的药代动力学特征、良好的生物安全性以及实时成像能力，凸显出其重要的转化潜力。总体而言，这些发现证实了NIR-II FLT成像是精准肿瘤外科中的一种稳健工具，并为推进下一代分子探针和图像引导治疗策略的发展提供了通用框架。
