泰国肉鸡场穿梭给药程序条件下艾美耳球虫属（Eimeria spp.）的抗球虫药耐药性

球虫病是由艾美耳球虫属（Eimeria）引起的一种广泛流行的家禽疾病，并显著影响生产性能与生产力。在养殖现场，常可观察到多种艾美耳球虫种的混合感染。尽管预防性抗球虫药（anticoccidials）通常通过饲料添加用于疾病控制，但其广泛应用已导致药物耐药性的产生，尤其是在泰国肉鸡生产中穿梭给药程序（shuttle programs）被广泛使用的背景下。明确常用抗球虫药的耐药谱对于制定有效预防策略至关重要。本研究采用4种抗球虫药敏感性试验（anticoccidial sensitivity tests, ASTs）指标，评估了来自泰国肉鸡场的田间分离株柔嫩艾美耳球虫（Eimeria acervulina, E. acervulina）、毒害艾美耳球虫（E. maxima）和堆型艾美耳球虫（E. tenella）对药物的敏感性。研究首先开展剂量滴定试验，以确定有效攻毒剂量，重点考察病变诱导和增重下降，同时尽量降低死亡率。共选用112只1日龄肉鸡雏鸡，评估3种广泛使用的抗球虫药制剂：那拉菌素联合尼卡巴嗪、盐霉素和马杜拉霉素。药物敏感性评估采用4项关键指标：抗球虫指数（anticoccidial index, ACI）、最佳抗球虫活性百分比（percentage of optimum anticoccidial activity, POAA）、病变评分降低率（reduction of lesion scores, RLS）以及相对卵囊产量（relative oocyst production, ROP）。在整个试验期间，肉鸡开食料均饲喂相同组合的那拉菌素+尼卡巴嗪，而生长期饲料中添加的抗球虫药则为马杜拉霉素或盐霉素。经口接种孢子化卵囊后，E. acervulina为2 × 10⁵、E. maxima为1 × 10⁵、E. tenella为1.5 × 10⁴，无论给药感染组还是感染未给药组，其增重均显著低于未感染对照组（p < 0.05）。尽管盐霉素和马杜拉霉素处理均可较感染未给药组显著降低肠道病变评分和粪便卵囊排出量（p < 0.05），但这种降低并不完全。值得注意的是，各项计算指标得到的结果并不一致：ACI和ROP初步提示药物仍具敏感性，而POAA和RLS则提示药效下降。依据本研究采用的综合评分体系——若4项指标中有2项提示耐药，则判定为中度耐药——这些田间分离株被归类为对盐霉素和马杜拉霉素均呈中度耐药。组织病理学分析亦支持这一结论，证实尽管药物减轻了感染严重程度，但并不能完全阻止艾美耳球虫的定植。本研究首次在穿梭给药程序条件下，对泰国艾美耳球虫分离株开展系统性AST评估。研究结果提示，即使在此类结构化用药程序中，中度药物耐药性亦已出现，这对家禽产业具有重要实践意义。为维持泰国肉鸡生产的长期防控效果，亟须实施策略性轮换用药，并整合疫苗接种和生物穿梭程序（bio-shuttle strategies）等替代性控制措施。

本文发表于《Veterinary Medicine International》，围绕泰国肉鸡场穿梭给药程序下艾美耳球虫属（Eimeria spp.）田间分离株的抗球虫药耐药性展开系统研究。研究背景在于，球虫病是肉鸡生产中最重要的寄生虫病之一，可导致肠道损伤、腹泻、增重下降、饲料利用率降低，严重时甚至造成死亡。柔嫩艾美耳球虫（E. acervulina）、毒害艾美耳球虫（E. maxima）和堆型艾美耳球虫（E. tenella）是鸡群中最常见且致病意义突出的种类，它们分别寄生于不同肠段并造成部位特异性病变。长期以来，生产上主要依赖饲料中预防性添加抗球虫药控制该病，尤其是离子载体类（ionophores）和合成类药物联合或轮换使用。泰国肉鸡产业广泛采用穿梭给药程序，即同一批鸡在不同日龄阶段切换不同类型抗球虫药，以期延缓耐药性发生。然而，临床及亚临床球虫病仍持续存在，提示现有方案的防控效力可能逐步下降。与此同时，泰国现有流行病学资料显示多种艾美耳球虫混合感染较为常见，这进一步增加了防控复杂性。因此，有必要在模拟实际生产用药模式的条件下，对田间分离株进行系统药敏评估，以明确常用药物的真实敏感性状态，并为优化防控策略提供依据。

研究人员针对这一问题，收集泰国东部商业化肉鸡场粪样，分离并鉴定艾美耳球虫田间株，重点考察其在穿梭给药条件下对盐霉素和马杜拉霉素的反应。研究的核心目的并非单纯比较单一指标上的药效，而是通过抗球虫指数（ACI）、最佳抗球虫活性百分比（POAA）、病变评分降低率（RLS）和相对卵囊产量（ROP）四维指标联合判断，从而避免仅依赖增重、病变或排卵囊任一单项指标而高估药效。最终，研究人员发现，尽管两种药物均能部分降低病变并减少卵囊排出，但在综合评价体系下，泰国田间分离株已对盐霉素和马杜拉霉素表现出中度耐药。这一结论说明，即便在结构化穿梭用药程序中，离子载体类药物的长期使用仍可能带来耐药性累积，进而削弱肉鸡生产性能。

在技术方法方面，研究人员首先从泰国东部多家商业肉鸡场采集混合新鲜粪样，经2.5%重铬酸钾促孢子化后，结合卵囊形态学观察与靶向ITS1区域的多重PCR对虫种进行鉴定。随后采用单卵囊分离技术纯化虫株，并在无球虫1日龄肉鸡中开展剂量滴定试验，确定E. acervulina、E. maxima和E. tenella的适宜攻毒剂量。正式药敏试验共纳入112只Ross 308公雏，设置未感染未处理组、感染未处理组及两种穿梭给药处理组，记录增重、死亡、病变评分和粪便每克卵囊数，并辅以肠道组织病理学观察。统计分析采用单因素方差分析和Fisher确切检验。

在研究结果部分，论文首先报告了“3.1. Dose Titration Trial”。研究人员以4个不同剂量分别评估E. acervulina和E. maxima的致病性，结果显示，两种虫株感染组均未出现死亡。E. acervulina感染后，随着剂量变化可观察到病变评分与增重变化的对应趋势；E. maxima最高剂量未能产生2分病变。基于病变程度、增重抑制和不致死等标准，研究最终确定本试验所用接种剂量为每只鸡E. acervulina 2 × 10⁵个卵囊、E. maxima 1 × 10⁵个卵囊；E. tenella剂量则依据既往研究设定为1.5 × 10⁴个卵囊。该步骤为后续药敏试验建立了稳定、可比较的攻毒模型。

在“3.2.1. Growth Performance Results”中，试验期间未观察到与球虫病相关的死亡，说明攻毒强度主要体现在生产性能和肠道损伤层面。未感染未处理组增重最高，而感染未处理组在28日龄和35日龄时增重显著下降，表明混合虫种攻毒成功建立了明显的亚临床至临床损害模型。盐霉素组和马杜拉霉素组的增重均显著高于感染未处理组，提示药物具有一定保护作用；但两药处理组仍未完全恢复至未感染对照水平。进一步按GSR计算POAA后，盐霉素和马杜拉霉素的POAA均低于50%，按照作者预设判定标准应归为耐药。这意味着即使药物能够改善部分生产指标，其对感染造成的生长抑制恢复仍然不足，药效已出现实质性下降。

在“3.3. Lesion Scores”中，研究人员对十二指肠、中肠以及盲肠进行大体病变评分。未感染组未见病变，而感染未处理组各肠段病变明显增高。两种抗球虫药处理总体上均能降低病变评分，但这种抑制具有肠段差异。盐霉素对E. acervulina和E. maxima相关病变具有一定抑制作用，但对E. tenella所致盲肠病变控制不足；马杜拉霉素则对3种虫种相关病变均显示出更广泛的抑制效果，尤其在中肠段病变降低更为明显。RLS结果显示，盐霉素各肠段均低于50%，提示病变控制不足；马杜拉霉素仅在中肠段达到敏感阈值，其他部位仍表现为耐药。该结果说明，单纯从病变角度看，两种药物的临床保护均不完全，其中马杜拉霉素略优于盐霉素，但整体仍不足以实现充分控制。

在“3.4. Fecal Oocyst Shedding”中，未感染组未检测到卵囊，证明生物安全控制有效。与感染未处理组相比，盐霉素组和马杜拉霉素组粪便卵囊数均显著下降，且马杜拉霉素组数值低于盐霉素组。按ROP标准判定，两组ROP均低于15%，提示从卵囊排出抑制这一寄生虫学生物学指标来看，田间分离株对两药仍表现为“敏感”。然而，这一结果与POAA和RLS出现不一致，正是本文强调必须采用多指标综合分析的重要原因：药物虽可压低卵囊排出，却未必足以恢复生长性能或显著缓解全部肠段病变。

在“3.5. The ACI and Overall Judgment of Drug Resistance”中，作者将存活率、相对增重率、病变评分及卵囊值整合计算ACI。由于试验中无死亡发生，且两种药物在降低病变和卵囊方面存在一定效果，盐霉素和马杜拉霉素组ACI均高于160，按该单项指标可判定为敏感。然而，作者并未据此直接得出药物仍然有效的结论，而是引入累计积分式综合判定系统：四个指标中若有两项达到耐药标准，则定义为中度耐药。由于盐霉素和马杜拉霉素均在POAA和RLS上表现为耐药，而在ACI和ROP上表现为敏感，因此最终均被判定为中度耐药。该结论较单一指数更能反映现场用药的真实情形，即药物尚能维持一定临床控制，但其防控效力已发生明显削弱。

在“3.6. Histopathological Analysis”中，组织病理学为上述综合判断提供了形态学证据。未感染组肠组织中未见裂殖体或配子体，而感染未处理组在多肠段可见明显虫体内源性发育阶段。盐霉素组和马杜拉霉素组中，阳性检出频率较感染未处理组有所下降，但并未完全消失，且两处理组之间差异无统计学意义。该结果表明，两种药物虽然减轻了病变严重程度，但都未能完全阻止艾美耳球虫侵入上皮并在肠道内继续发育，进一步支持“部分有效但控制不完全”的判断。

讨论部分的核心在于，将实验结果置于泰国肉鸡产业广泛应用穿梭给药程序的实际背景下进行解释。研究人员指出，本试验设计与泰国常规商业生产相一致，即开食期使用那拉菌素联合尼卡巴嗪，生长期换用离子载体类药物，育肥末期停药以满足休药期要求。研究结果显示，这种程序并未阻止田间分离株形成中度耐药。论文进一步强调，ACI和POAA之间的分离现象提示，仅用传统综合指数可能高估药效，因为维持存活与部分病变控制并不等同于保持生产效率。研究还指出，盐霉素对盲肠病变控制较差，提示不同肠段和不同虫种对药物反应存在差异；同时，盐霉素和马杜拉霉素同属离子载体类，其对虫体离子转运的共同作用机制可能导致交叉耐药。基于此，研究人员认为，单纯依赖离子载体类抗球虫药已难以满足长期可持续防控需求，应加强常规AST监测，并将轮换用药、疫苗免疫和生物穿梭程序纳入综合防控体系。作者同时指出，本研究样本来自泰国东部高密度肉鸡产区，能够反映区域重要趋势，但耐药性具有场区特异性，未来仍需扩大地理范围并开展纵向监测。

研究结论部分可译述为：本研究通过4项综合药效指标，首次基于AST证实来源于泰国穿梭给药程序的艾美耳球虫田间分离株存在中度耐药。尽管这些分离株在临床存活方面仍维持较高水平（ACI较高），但显著的生长抑制（POAA较低）提示生产效率已发生关键性损失。为应对这一问题，泰国肉鸡场亟须开展常规AST监测，并整合药物轮换或疫苗免疫策略。尤其建议实施生物穿梭程序，即将活疫苗与针对性抗球虫药轮换结合，以降低选择压力并替代耐药田间株。这些措施对于在药物耐药性持续演化背景下保障长期生产力和实现球虫病可持续管理至关重要。