细胞基质电阻抗传感（ECIS）作为一种无标记、非侵入性技术，已广泛应用于通过各种电学参数在体外监测组织动力学。将这些参数拟合至电路模型，可深入了解细胞-基质以及细胞-细胞相互作用。本研究报道了利用ECIS技术监测复杂生物系统（即细胞侵袭动力学）方面的新进展，并探讨了对侵袭进程进行时间定量分析的可行性。研究人员利用一个人类体外植入模型，该模型允许考察胚胎滋养层细胞与子宫内膜上皮之间的相互作用。该过程涉及滋养层粘附于内膜后进行侵袭。通过监测阻抗幅值和相位对该过程进行评估。基于截止频率，通过分解阻抗谱，实现了对细胞电阻和电容的量化，从而在不同时间点追踪侵袭进程。为更好地理解滋养层侵袭动力学，研究人员将传统ECIS理论中的体外等效电路（EEC）模型扩展为一个包含电极、内膜单层和滋养层球体的三组件模型。综上所述，研究人员提出了一个多步骤的侵袭过程：1）侵袭前 - 球形滋养层与内膜单层的非接触状态；2）早期侵袭（0-6小时） - 滋养层粘附及内膜穿透；3）晚期侵袭（6-48小时） - 球体在内膜单层内变平和扩张。这项工作推进了通过细胞电学量化来监测涉及细胞和组织交错的生物过程的可能性。这不仅与胚胎植入相关，也与发育过程、炎症和肿瘤侵袭有关。
细胞侵袭是一个不同类型细胞相互交融的过程，涉及细胞迁移和组织穿透。它在诸如炎性细胞的内皮迁移、发育过程中的细胞交错以及恶性肿瘤细胞的转移等多种事件中起着关键作用。在胚胎植入过程中也会发生类似的侵袭过程。在这种情况下，包围在球形胚胎囊胚周围的滋养层细胞附着于连续的子宫内膜上皮，该上皮是衬于整个子宫腔的单层表面组织。滋养层细胞随后穿透子宫内膜上皮并侵入其下方的结缔组织层，为发育中的胚胎提供营养环境。植入失败是不孕症的常见原因。鉴于植入过程存在根本性的物种差异以及人类体外植入研究存在明显的伦理限制，因此需要体外系统来研究人类胚胎-子宫内膜相互作用的病理生理学。为此，研究人员开发了人滋养层来源的AC-1M-88细胞和激素敏感的子宫内膜Ishikawa细胞的共培养系统。为模拟覆盖滋养层的球形胚胎囊胚，研究人员制备了AC-1M-88球体，将其置于汇合的Ishikawa单层之上。这使得监测滋养层粘附及其后续穿透和侵袭内膜单层成为可能。研究人员已经证明，滋养层粘附取决于Ishikawa细胞生长的基质刚度。为了研究所有可能影响滋养层粘附和侵袭的多因素，迫切需要一个高通量分析系统来定量追踪该过程。光学成像和磁共振成像（MRI）技术最近被开发用于探测基于球体的模型中的细胞-细胞和细胞-基质相互作用。作为一种替代方案，细胞基质电阻抗传感（ECIS）已被用作一种非侵入性和无标记的技术，为连续体外检测细胞动力学和功能提供了一种经济高效且应用广泛的手段。通常，电化学阻抗谱（EIS）基于通过在宽频率范围内施加小的正弦信号（电压或电流）来扰动平衡或稳态电化学系统，并监测由此产生的正弦响应（电流或电压）。将该技术应用于培养在金属微电极上的细胞，能够对复杂生物系统进行频率依赖性的监测。细胞结构、电极和细胞培养环境可以用无源电气元件表示，从而可以构建等效电路（EEC）模型。已经开发了各种商业系统，例如Applied BioPhysics的ECIS Z-Theta工作站和Agilent的xCELLigence实时细胞分析仪，通过在培养箱内进行阻抗测量来监测时间分辨的细胞行为。在ECIS技术中，可以记录生物电界面参数，如细胞间电阻、细胞-基质电阻和细胞膜电容，这些参数可作为细胞迁移和屏障功能的指标。这些电学标记也已被用于追踪细胞凋亡过程中的形状变化。ECIS的更高级功能已通过将微流控技术集成到平台中得以展示，例如从血液样本中分选肿瘤细胞。在所有这些进展中，监测侵袭过程的检测方法仍然很少见。此类复杂检测的可视化和理论基础仍有待探索。通过确定阻抗值变化，在细胞侵袭过程中获取时间信息已经实现了良好的可靠性和可行性。然而，该技术在探测细胞侵袭动力学等多因素相互作用方面的生物电学理解和定量可能性仍然具有挑战性。因此，需要进一步研究以将此类检测方法超越传统的粘附和迁移监测。在这项工作中，研究人员利用人类胚胎植入的体外模型，通过ECIS研究侵袭动力学。阻抗谱的相位信息变化反映了母体子宫内膜单层形成与滋养层侵袭之间的差异。研究表明，通过根据各自的截止频率将ECIS谱分解为单个电阻和电容参数，可以实现该过程的量化。研究人员可以在检测中区分侵袭过程的三个阶段，即侵袭前、早期侵袭和晚期侵袭。研究人员进一步将传统的两组件ECIS理论扩展到一个包含微电极、子宫内膜单层和滋养层球体的三组件系统。该技术的建立和进一步发展将为未来在不同范式和多种细胞相互作用的病理诊断中的细胞侵袭ECIS检测铺平道路。
**2. 关键技术方法概述**
本研究主要采用了几项关键技术方法。首先，构建了人类胚胎植入的体外共培养模型，使用人滋养层来源的AC-1M-88细胞系在琼脂糖微模具中培养生成球体，并将其置于由子宫内膜腺癌细胞系Ishikawa形成的汇合单层之上。其次，核心检测技术是细胞基质电阻抗传感（ECIS），使用集成了金微电极的8孔阵列ECIS芯片，并利用恒电位仪在100 Hz至100 kHz的频率范围内进行电化学阻抗谱（EIS）测量。第三，数据分析包括通过电阻的一阶导数计算截止频率，将阻抗谱分解为电阻和电容分量进行量化分析，并引入开源软件进行等效电路（EEC）模型拟合，将传统两组件模型扩展为包含电极、内膜单层和滋养层球体的三组件模型。此外，采用了活细胞示踪剂染色结合激光扫描共聚焦显微镜进行侵袭过程的可视化追踪，以及ZO-1免疫荧光染色评估连接完整性。
**3. 研究结果分析**
**3.1 ECIS监测子宫内膜Ishikawa细胞单层形成过程**
研究人员利用标准金微电极通过ECIS对子宫内膜Ishikawa细胞单层的形成过程进行了长达72小时的动态监测，并结合光学观察控制细胞形态和活力。在细胞接种48小时后，ECIS谱中检测到整体阻抗增加。在此期间，相位谱向低频移动并接近0°相位。随后，记录到稳定的阻抗，6至100 kHz的谱图重叠，300 Hz至6 kHz之间的阻抗幅值略有增加。这些变化表明在两天后，细胞形成紧密连接，汇合单层形成。为了证明阻抗变化源于单层形成，在72小时后用胰蛋白酶解离细胞。正如预期，阻抗和相位谱均恢复到初始基线状态。通过EGTA处理进一步验证了连接介导的单层形成对细胞阻抗的相关性。
**3.2 ECIS监测滋养层球体侵袭过程**
接下来，研究人员将大小相近的滋养层球体置于汇合的Ishikawa细胞单层上。为研究ECIS方法在侵袭过程中的感应分辨率，定义了两种不同的初始球体-电极覆盖条件：低覆盖率（17±3%）和高覆盖率（65±4%）。无论初始播种位置如何，由于滋养层细胞迁移和Ishikawa细胞位移，球体最终变平区域随时间推移常超过工作电极面积。在球体放置24小时后，观察到一致的阻抗增加。在此期间，滋养层球体与电极之间的Ishikawa细胞单层仍然存在，但逐渐被穿透和迁移的球体衍生滋养层细胞所取代。值得注意的是，球体-电极覆盖率的降低与达到最大阻抗谱值所需的时间间隔延长相关。在接种6小时后，相位谱中观察到两个明显的峰值，分别位于低频（~1 kHz）和高频（~40 kHz）。由于仅Ishikawa单层时未观察到1 kHz处的电阻偏向峰，研究人员推断该峰是由球体粘附引起的。其在24小时后随后消失，表明球体已融入细胞单层。剩余的高频峰在24小时后逐渐向低频移动，表明球体完全整合进子宫内膜Ishikawa单层。为了测试阻抗变化是否与滋养层-子宫内膜相互作用的不同阶段相关，进行了显微分析。荧光标记用于分别标记滋养层和子宫内膜细胞。显微照片显示，在侵袭过程中Ishikawa细胞单层的ZO-1定位得以维持。另外的照片显示，单个AC-1M-88球体在初始转移后的48小时内侵入Ishikawa细胞单层的过程，这些荧光显微照片显示粘附的球体衍生细胞在4小时时附着于子宫内膜单层，随后穿透汇合的子宫内膜单层（8小时），并相继取代Ishikawa细胞（24和48小时）。该过程伴随着球体在上皮内扩张期间的变平。结合凋亡检测结果，研究人员可以得出结论，低频（~1 kHz）处的瞬态电阻性相位峰可作为球体粘附的指标，其消失与滋养层侵袭相关。高频峰向低频移动与滋养层整合进单层相关。
**3.3 滋养层球体侵袭的分析**
细胞阻抗分析与细胞在细胞-电极界面的生长密切相关，这会引起电阻和电容的变化。这些电学变化与细胞-基质粘附、细胞-细胞接触和细胞形态有关。为明确这些参数在侵袭检测中的频率依赖性贡献，研究人员计算了区分谱图低频和高频区域的截止频率。通常，这种转变是RC并联电路的特征，其中电流在低频范围主要由电阻器主导，而电容电抗随频率降低显著增加。在高频区域，电容器的电抗显著降低，导致电流主要流经电容路径（细胞膜），使得电容对于评估膜完整性和介电特性尤为重要。研究人员选择电阻一阶导数最大的点作为截止频率，表明电阻行为发生急剧转变。整个侵袭过程24小时内的总体截止频率被统计确定为：高覆盖率下为54.7±8.3 kHz，低覆盖率下为81.6±26.0 kHz，单层为63.3±0.0 kHz。在固定频率处也可获得阻抗量化。例如，在高覆盖率情况下，在截止频率54.7 kHz处，阻抗幅值从~1.9 kΩ（单层）增加到6小时后的~4 kΩ，再到24小时后的~8 kΩ，随后在30至48小时之间进入平台期（~6 kΩ）。在同一截止频率，阻抗相位相应地从-50°（单层）转变为6小时粘附后的-74°，并在24小时侵袭过程几乎完成时进一步变为-88°。这种电容电抗的渐进增加反映了球体的变平及其与Ishikawa细胞层的相互作用。在30小时后，相位恢复并稳定在-79°，表明侵袭过程结束，微电极上的初始Ishikawa单层被成功替代。在低球体覆盖率实验中也观察到类似趋势。在截止频率范围内，电阻表现出急剧转变，难以完全分辨电阻和电容行为。因此，研究人员选择了低频10 kHz区域和高频100 kHz区域来研究不同侵袭时间点电阻、电容和相位的频率依赖性变化。在10 kHz处，所有侵袭进程阶段的Rsum均显著增加，与阻抗相位值的显著变化一致。例如，在高覆盖率情况下，Rsum在6小时后从1.77 kΩ增加到6.37 kΩ，在24小时后达到最大值15.60 kΩ。随后略有下降并稳定在~12 kΩ左右。该现象反映了球体粘附于单层（6小时）、随后侵入（24小时）直至建立新单层（30-48小时）的过程。相反，在100 kHz处，在侵袭期间记录到Csum显著下降，相位相对稳定在-90°左右，显示出主导的电容行为。例如，在高覆盖率条件下，Csum从1.53 nF减少到24小时的0.74 nF，随后在30小时后增加到1.07 nF，并在48小时后稳定在~1 nF左右。此外，30小时后可观察到接近-90°的纯电容相位，对应于成功侵袭后新单层的重建。
**3.4 球体-单层侵袭动力学的EEC建模**
为更好地解释侵袭过程中阻抗相位图中观察到的双峰现象以及量化的电阻和电容，研究人员引入了一个代表性的三组件EEC，考虑了电极、子宫内膜单层和滋养层球体。单层和球体状态均被建模为由电阻器和电容器组成的并联RC电路。EEC模型基于所提出的侵袭状态构建。所有拟合的恒相角元件（CPE）n值均接近1（0.94），表明微电极界面具有近乎理想的电容行为。然而，在早期侵袭模型中降至0.89，表明界面复杂性和无序性，与侵袭过程中单层结构完整性变得不均匀的假设一致。在晚期侵袭阶段模型中随后上升至0.93，表明结构组织恢复，反映了新类单层状态的形成。所有情况下，从100 Hz到100 kHz的整体EEC拟合均与实验结果一致。值得注意的是，6小时侵袭后相位图中出现的双峰（图2）也在电路拟合中成功重现，验证了其作为确定早期侵袭的敏感电学标记物的功能。根据EEC模型计算了所有模型的总电阻（Rsum,fit）和总电容（Csum,fit）。具体而言，选择了10 kHz和100 kHz来代表低频和高频区域，以与实验结果进行比较。如单层建模所示，在10 kHz处，Rsum,fit从1.32 kΩ（培养基）增加到5.50 kΩ（单层）。同时，Csum,fit在100 kHz处从2.42 nF（培养基）降低到1.06 nF（单层）。在侵袭建模中，从早期侵袭到晚期侵袭，在10 kHz处观察到Rsum,fit从4.30 kΩ增加到8.31 kΩ，在100 kHz处记录到Csum,fit从0.78 nF降低到0.67 nF。拟合结果与实验提出的包括单层形成、球体粘附和侵袭在内的步骤相符。此外，在截止频率以上测量的实验相位值随时间从部分电阻性（~ -60°）增加到纯电容行为。这表明在侵袭过程中，当单层被球体取代时，高频区域表现出电容主导性。
**4. 讨论与结论总结**
**讨论部分总结**：本研究通过ECIS技术结合等效电路建模，对人类胚胎植入体外模型中滋养层侵袭的复杂动力学过程进行了时间分辨监测和定量分析。研究人员证实，ECIS能够灵敏地探测单层形成、球体粘附、穿透及最终整合进内膜层的连续事件。研究提出的三组件EEC模型成功地描述了侵袭动力学，并解释了早期侵袭阶段相位谱中出现的特征性双峰现象。研究结果表明，通过分析截止频率下的阻抗幅值、特定频率点的电阻和电容以及相位变化，可以量化侵袭的不同阶段。初始球体与电极的覆盖率显著影响信号稳定所需的时间，强调了实验中精确定位的重要性。该方法不仅为胚胎植入研究提供了新的电学检测手段，其原理也可扩展至炎症、肿瘤侵袭等其他涉及细胞与组织交错的生物过程研究。
**结论部分翻译**：这项工作提供了对细胞阻抗与细胞侵袭行为之间频率依赖性关联的更详细理解，定义了用于表征侵袭过程的定量电学标记物。作为电学标记物，在相位图中~1 kHz处观察到的峰能够清晰区分单层形成和早期球体侵袭。在晚期侵袭过程中，低频区域观察到电阻主导性显著增加，同时随着时间的推移，电容路径显著下降直至侵袭完成。这种频率依赖性信息可用于量化侵袭过程。此外，球体-电极定位的变化（决定了初始电极覆盖面积）显著影响阻抗信号的稳定。通过将阻抗谱分解为电阻和电容，研究人员引入了截止频率的概念，以区分细胞生长和侵袭过程中的低频和高频区域。对截止频率以下（例如10 kHz）和以上（例如100 kHz）的电阻（Rsum）和电容（Csum）进行了定量分析。它们的变化与单层形成和球体侵袭过程中的阻抗幅值和相应的相位偏移一致。研究人员建议量化系统的电阻和电容作为低频和高频标记物，以实现细胞-芯片和球体-细胞-芯片相互作用的频率依赖性量化。基于已建立的细胞-基质界面理论和先前的单层EEC模型，研究人员将传统的EEC模型扩展到一个三组件系统，该系统在宽频率范围（100 Hz至~100 kHz）内准确地描述了早期侵袭和晚期侵袭动力学。与实验结果一致，在复杂相位谱中观察到双峰，这可以作为早期侵袭阶段球体粘附的指标。总之，研究人员提出了一个多步骤的侵袭过程：1）侵袭前 - 球形滋养层与子宫内膜单层的非接触状态；2）早期侵袭（0-6小时） - 滋养层粘附及子宫内膜穿透；3）晚期侵袭（6-48小时） - 球体在子宫内膜单层内变平和扩张。研究结果推进了通过细胞电学量化来监测涉及细胞和组织交错的生物过程的可能性。未来的工作将专注于通过连续数据收集来完善侵袭模型，以更精确地识别中间侵袭阶段，并通过在侵袭过程中对活细胞培养物进行时间分辨、纵向的阻抗监测，引入额外的电路元件来表征多细胞结构。通过对频率依赖性阻抗信号的更深入理解，未来将开发出精确且具有空间定义性的体外读出技术。
