光捕获复合物（Light-harvesting complex, LHC）是光系统的天线系统，影响植物的光合效率。在本研究中，研究人员证实MsWRKY41直接激活参与LHC蛋白插入类囊体膜的MsAlb3和参与叶绿素生物合成的MsDVR1的表达。在苜蓿中敲低MsWRKY41导致叶片黄绿色且类囊体结构异常。MsWRKY41是MsWRKY40的下游靶基因，MsWRKY40也直接且正向调控四个LHC蛋白基因MsLHCB1/4.3/5/7的表达。过表达MsWRKY40增加了光系统II-LHCII（PSII-LHCII）超复合物的积累。MsWRKY40与锌指蛋白MsZFP1发生物理互作，该互作部分抑制了MsWRKY40靶基因的表达。在生理高水平脱落酸（Abscisic acid, ABA）条件下，该互作减弱，导致MsWRKY40靶基因表达上调。这些结果揭示了以MsWRKY40-MsWRKY41为核心的调控模块，将LHCB亚基和叶绿素的生物合成过程整合到一个基因调控网络中，从而高效调控LHCII的生物发生。
叶绿体是植物进行光合作用的主要细胞器，其类囊体膜上存在大量光合复合物，包括光系统I和II（Photosystem I and II, PSI and II）、细胞色素b6f复合物（Cyt b6f）和ATP合酶（ATPase），它们是驱动光合作用初级反应的关键组分。其中，光捕获复合物I和II（Light-harvesting complex I and II, LHCI and LHCII）作为天线捕获光能并传递至PSI和PSII反应中心，分别与PSI和PSII结合形成PSI-LHCI和PSII-LHCII超复合物。这些超复合物在植物适应不同光环境时，其组成和结构会发生动态变化，对于维持光合效率和光保护至关重要。然而，LHCII生物合成的精确调控机制，尤其是多个关键过程如何被协同调控，尚不完全清楚。WRKY转录因子（Transcription factors, TFs）是植物中最大的TF家族之一，已有研究表明拟南芥中的AtWRKY40等成员参与调控LHC基因表达，但在重要牧草苜蓿（Medicago sativa L.）中，WRKY TF如何调控LHCII生物合成及其与激素信号（如ABA）互作的机制有待深入解析。
为了阐明这一问题，研究人员以四倍体异花授粉豆科牧草苜蓿为材料，基于前期转录组数据，分离鉴定了两个WRKY TF基因MsWRKY40和MsWRKY41。通过分子生物学、遗传学、生物化学和生理学等多学科手段，研究人员系统解析了它们的功能。研究发现，MsWRKY40作为上游调控因子，能够直接结合到MsWRKY41以及四个LHC蛋白基因MsLHCB1/4.3/5/7的启动子上，正向激活它们的表达。MsWRKY41则直接正向调控参与类囊体膜蛋白插入的MsAlb3和参与叶绿素生物合成的MsDVR1的表达。这构成了MsWRKY40-MsWRKY41调控级联，整合了LHCB蛋白合成、叶绿素合成及其与LHC蛋白的结合等关键过程。进一步研究发现，MsWRKY40与一个含有EAR抑制基序的C2H2型锌指蛋白MsZFP1发生物理互作。在正常生理条件下（ABA水平较低），MsZFP1通过该互作抑制MsWRKY40的转录激活活性，从而下调下游靶基因表达。然而，当植物受到非生物胁迫（如干旱）诱导内源ABA水平升高时，高浓度的ABA会削弱MsWRKY40与MsZFP1的相互作用，解除MsZFP1对MsWRKY40的抑制，导致下游靶基因表达上调，促进更多LHCB亚基和叶绿素的合成，进而稳定LHCII功能，帮助植物适应胁迫环境。这项研究不仅揭示了苜蓿中一个高效协调的LHCII生物合成基因调控网络，也为通过遗传改良提高苜蓿光合效率和抗逆性提供了重要的理论依据和基因资源。该论文发表在《SCIENCE ADVANCES》杂志上。
本研究主要采用了以下关键技术方法：通过农杆菌介导的遗传转化获得MsWRKY41和MsWRKY40的过表达、RNA干扰及显性抑制（SRDX）转基因苜蓿植株；利用叶绿素含量测定、透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope, TEM）观察、叶绿素荧光动力学参数分析（如F
v/F
m、YII、ETRII等）以及蓝绿温和电泳（Blue Native-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, BN-PAGE）分析转基因植株的表型及光合复合物组装情况；通过酵母单杂交（Yeast One-Hybrid, Y1H）、电泳迁移率变动分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）、双荧光素酶报告系统（Dual-Luciferase, Dual-LUC）验证转录因子与靶基因启动子的直接结合及转录激活；利用酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）、双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）、Pull-down及分裂荧光素酶互补（Split-LUC）等实验验证蛋白间互作；通过定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）分析基因表达和蛋白积累水平。研究样本主要来源于栽培苜蓿品种“WL-525HQ”的植株及其转基因后代。
研究结果主要包括以下几个方面：
一、MsWRKY41参与苜蓿叶绿素生物合成与类囊体膜发育。研究证实MsWRKY41主要在叶片和叶柄中表达，编码一个具有转录激活活性的核定位蛋白。敲低MsWRKY41（RNAi植株）导致苜蓿叶片呈现黄绿色表型，叶绿素含量显著降低，类囊体膜结构发育不良，基粒堆叠异常，同时光系统II（Photosystem II, PSII）的最大光化学效率（F
v/F
m）、实际量子产额（YII）和电子传递速率（ETRII）显著下降，而光系统I（Photosystem I, PSI）受影响较小。过表达MsWRKY41（OE植株）则表现出相反的表型。这表明MsWRKY41主要调控PSII的形成与功能。
二、MsWRKY41直接激活MsAlb3和MsDVR1的表达。通过转录组分析、Y1H、EMSA和Dual-LUC等实验证实，MsWRKY41能直接结合到MsAlb3启动子上的GT1基序和MsDVR1启动子上的W-box元件，并正向激活它们的表达。MsAlb3参与LHC蛋白插入类囊体膜，MsDVR1催化叶绿素生物合成的最后一步。因此，MsWRKY41通过调控这两个关键基因，同时影响了LHC蛋白的膜定位和叶绿素合成。
三、MsWRKY40是MsWRKY41的上游直接正向调控因子。研究分离出MsWRKY40，其同样为核定位蛋白。Y1H和EMSA实验表明，MsWRKY40能直接结合到MsWRKY41启动子的G-box元件上。在MsWRKY40过表达（OE）植株中，MsWRKY41的表达显著上调；而在MsWRKY40显性抑制（SRDX）植株中则显著下调。同时，MsWRKY40-OE植株表现出叶绿素含量增加、生物量提高以及PSII-LHCII超复合物积累增多的表型。
四、MsWRKY40直接调控多个MsLHCB基因的表达。MsWRKY40能够直接结合MsLHCB1、MsLHCB4.3、MsLHCB5和MsLHCB7基因的启动子，主要结合位点为W-box元件。在MsWRKY40-OE植株中，这些基因的转录水平和蛋白积累水平（MsLHCB1/4/5）普遍增加，导致PSII-LHCII超复合物积累增多，PsaA/PsbA比值降低。
五、MsZFP1与MsWRKY40互作并抑制其转录活性。通过Y2H、BiFC和Pull-down实验证实，一个含EAR抑制基序的锌指蛋白MsZFP1与MsWRKY40在细胞核内发生物理互作。Dual-LUC实验证明，MsZFP1能够抑制MsWRKY40对MsWRKY41和MsLHCBs启动子的激活作用。当MsZFP1中的EAR基序被突变后，其抑制作用被解除，证实EAR基序是发挥抑制功能的关键。
六、ABA依赖性地解除MsZFP1对MsWRKY40的抑制。利用分裂荧光素酶互补实验发现，MsWRKY40与MsZFP1的互作强度受ABA浓度调控：生理高浓度的ABA处理能以剂量依赖的方式削弱两者的互作，但不会导致蛋白降解。在MsWRKY40-OE植株中，ABA处理能进一步上调MsLHCB4.3/7等基因的表达，并部分缓解ABA对LHCII蛋白积累的抑制作用。在干旱胁迫下（模拟内源ABA升高），MsWRKY40-OE植株的抗旱性增强，相关基因表达上调。
论文讨论部分总结指出，本研究揭示了苜蓿中一个以MsZFP1-MsWRKY40-MsWRKY41为核心的精准调控LHCII生物发生的基因网络。在正常条件下（ABA水平低），MsZFP1与MsWRKY40互作，将其靶基因（MsLHCBs、MsWRKY41、MsAlb3、MsDVR1）的表达维持在最适水平，从而平衡PSII与PSI之间的光能吸收、能量分布、量子产额和电子生成，保护光系统免受强光损伤。当植物遭遇非生物胁迫（如干旱）时，内源ABA水平升高，削弱了MsZFP1与MsWRKY40的互作，解除了抑制，进而上调靶基因表达，促进更多LHCB亚基和叶绿素的合成，以稳定LHCII功能，缓解胁迫对光合作用的抑制。该模块通过协同调控LHC蛋白的合成、插入类囊体膜以及叶绿素的合成和附着，构成了一个高效的LHCII生物合成调控网络，为植物适应多变的环境挑战提供了分子基础，并为苜蓿遗传改良提供了有价值的基因资源。
研究结论部分强调：MsZFP1-MsWRKY40-MsWRKY41构成了一个整合的基因调控网络，通过ABA依赖的动态互作机制，协调LHCII的生物合成并维持其功能稳定性，从而帮助苜蓿适应环境挑战。这一发现阐明了WRKY-光合相关核基因（PhANGs）在LHCII生物合成中的协同调控网络。
