开菲尔是一种由细菌和酵母构成的复杂共生体发酵而成的乳制品，其特征性风味通过微生物间的协调相互作用形成。本研究整合基于基因组学的预测与代谢物验证，探究了开菲尔来源的乳酸菌和酵母在开菲尔发酵过程中风味化合物的生物合成与形成机制。宏基因组学分析鉴定出Lactobacillus和Kluyveromyces是开菲尔粒和发酵牛奶开菲尔中的优势菌属。研究人员分离得到Lentilactobacillus kefiri SLAM023B和Kluyveromyces marxianus SLAM005Y，并对其在Illumina和Nanopore平台上进行了混合基因组测序。通过KEGG（京都基因与基因组百科全书）通路映射进行功能注释，揭示了包括氨基酸和脂肪酸代谢，以及醇、醛和酸的相互转化在内的特色代谢通路，这些通路参与了风味化合物的形成与生成。值得注意的是，K. marxianus SLAM005Y产生果味型杂醇，而L. kefiri SLAM023B则贡献了脂肪酸衍生的前体物质。两种菌株的共培养显著增强了酯类的合成，尤其是乙酸乙酯和乙酸异戊酯，为发酵产物赋予了果味和奶油般的感官特征。此外，辛酸乙酯和C6/C8脂肪酸的增加引入了果味和奶酪般的风味特性，同时青草味醛类的水平降低。相关性分析支持了菌株间的互补代谢作用和潜在的交叉喂养机制，有助于解释开菲尔风味的形成。总之，本研究为检验开菲尔中的协作代谢提供了基因组学和功能框架，并为改善发酵乳制品的感官特性确定了分子靶点。
开菲尔（kefir）是一种传统的发酵乳制品，通过一种复杂、共生的微生物联合体活动产生。发酵过程由开菲尔粒（kefir grains）引发，该颗粒由乳酸菌（LAB）、醋酸菌以及多种酵母种类嵌入一种称为开菲兰（kefiran）的多糖基质中构成。开菲尔微生物联合体促进乳酸和酒精的同步发酵，从而产出具有独特风味、质地和微生物丰富性的产品，这使其区别于其他发酵乳制品。近年来，由于其假定的健康促进特性，包括益生菌活性、抗菌效应和免疫调节功能，开菲尔已受到科学和工业界的显著关注。与其他乳品发酵相比，开菲尔发酵的一个标志是LAB和酵母的稳定共存。LAB主要负责乳糖代谢和乳酸生产，而酵母则贡献乙醇、二氧化碳以及一系列塑造开菲尔感官轮廓的挥发性化合物。这些代谢化合物是开菲尔感官特性的关键贡献者，并反映了联合体中细菌和酵母成员之间的功能相互依赖性。它们之间的相互作用涉及代谢物交叉喂养、协作性营养利用和环境调节，建立了一个动态的发酵生态系统，支撑着开菲尔发酵中微生物的稳定性和感官复杂性。此前的研究已经表征了开菲尔的微生物多样性和潜在的健康益处。基于培养和测序的方法揭示了开菲尔粒和所得发酵乳的分类学组成，为理解这个混合物种群落的结构和功能奠定了基础。阐明LAB与酵母之间的相互作用不仅对于理解混合培养发酵的生态动态至关重要，而且对于确定这些相互作用如何支配产品质量也十分关键。细菌和酵母之间的这些代谢交换直接调节发酵动力学、酸醇平衡以及关键风味挥发物的生物合成。对这些种间关系的深入理解可能使得理性设计明确的联合体成为可能，并促进生产具有更好一致性和功能性的开菲尔及其他发酵乳制品。此前的开菲尔研究采用了化学和代谢组学分析来确定每种微生物对风味形成的具体贡献。最近，基因组学应用作为一种新方法出现，用于阐明发酵食品研究中各种微生物的代谢能力和功能作用。基因组学工具有助于基于注释基因及其代谢通路，详细理解特定微生物如何参与风味化合物的生物合成。在实际应用中，此外，全基因组测序和多组学已被用于排除与致病性、毒性或抗微生物耐药性相关的基因，以选择功能有益的菌株。基因组规模代谢模型也被用于预测菌株特异性的代谢能力、营养依赖性和副产物形成，从而实现对风味发展的预先评估。最近整合基因组学和代谢组学的研究进一步证明，不同培养条件下的微生物代谢直接影响功能属性和风味形成为了阐明开菲尔风味发展背后的代谢相互作用，本研究调查了两种开菲尔相关物种Lentilactobacillus kefiri和Kluyveromyces marxianus之间的功能关系。通过整合基于基因组的代谢通路预测与实验代谢组学验证，研究人员鉴定了负责在发酵过程中合成关键风味化合物的互补生化途径。这种整合方法为物种特异性贡献和微生物交叉喂养相互作用如何共同塑造开菲尔复杂的风味轮廓提供了机制性见解。此外，它也为通过靶向操作微生物联合体来优化发酵乳制品的感官属性提供了概念性和实践性的框架。
研究采用的几个主要关键技术方法包括：对分离的L. kefiri SLAM023B和K. marxianus SLAM005Y菌株进行Illumina和Nanopore平台混合基因组测序，并利用KEGG数据库进行功能注释以预测代谢通路。通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC/MS）对发酵乳中的挥发性化合物进行定性与半定量分析。利用宏基因组学（针对16S rRNA V3-V4区和ITS区）分析开菲尔粒和发酵乳的微生物群落组成。所有研究样本均来源于韩国本地家庭收集的开菲尔粒。
研究结果部分，首先，通过对开菲尔粒进行形态学观察，宏观上呈现不规则的花椰菜状结构。光学显微镜和扫描电镜观察显示，细菌细胞和椭圆形酵母细胞嵌入在多糖基质和纤维状多孔网络中，形成了支持微生物共存和代谢物交换的致密聚集体。其次，宏基因组学分析显示，在开菲尔粒中，Lactobacillus kefiranofaciens占97.20%，Lentilactobacillus kefiri占2.30%；在发酵乳中，L. kefiranofaciens占56.35%，Acetobacter spp.比例显著增加。酵母方面，Kluyveromyces marxianus在开菲尔粒和发酵乳中均为优势种（分别占70.78%和42.88%）。培养分离验证了L. kefiri SLAM023B和K. marxianus SLAM005Y是关键的代表性菌株。第三，全基因组测序与注释表明，L. kefiri SLAM023B基因组大小为2.53 Mb，预测有2,549个基因；K. marxianus SLAM005Y基因组大小为11.0 Mb，预测有8,310个基因。KEGG功能注释揭示，L. kefiri SLAM023B的基因主要与代谢相关（44.2%），特别是含有脂肪酸生物合成（如fabF, fabG）和醇/醛相互转化（adh, adhE）以及蛋白水解（pepC, pepN）的基因。K. marxianus SLAM005Y的基因在遗传信息处理方面占比更高（48.1%），并含有Ehrlich通路（ARO10, PDC1, ADH1）和酯化（EHT1）相关基因。第四，基于基因组重建了风味化合物生物合成的预测代谢通路，包括杂醇产生的Ehrlich通路和C6/C8酸生成的脂肪酸生物合成途径。第五，微生物生长动态显示，在共培养发酵中，两种菌株的活菌数均有增加，但pH值下降幅度有限（从6.76降至5.96），表明该简化系统未能完全重现传统开菲尔发酵的强烈酸化作用。第六，风味化合物谱分析显示，与未接种的空白乳相比，所有发酵条件均降低了青草味醛类（庚醛、己醛）的水平。共培养显著提高了具有果味和奶油香气的酯类（乙酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯）以及中链脂肪酸（己酸、辛酸）的含量。统计分析表明，己醛等化合物的产生受菌株和交互作用的显著影响，而乙酸乙酯、异丁醇等挥发物主要受K. marxianus SLAM005Y的显著主效应影响。斯皮尔曼相关性分析进一步揭示，L. kefiri SLAM023B的丰度与庚醇、己醇正相关，而与乙醇、异丁醇负相关；K. marxianus SLAM005Y的丰度则与大多数酯类和脂肪酸正相关，表明两种菌株在发酵过程中主要利用不同的代谢途径。
讨论部分总结认为，本研究采用整合基因组注释和代谢物分析的策略，阐明了L. kefiri SLAM023B和K. marxianus SLAM005Y之间潜在的代谢相互作用。宏基因组学分析确认了Lactobacillus和Kluyveromyces是开菲尔中的优势菌属，并与开菲尔粒和发酵乳之间的生态分化一致。选择L. kefiri和K. marxianus作为模型菌株，是因为它们在培养中易于分离和维持，且在先前研究中被证实对风味发展有重要作用。该简化系统有限的酸化作用反映了所用菌株的特定代谢特性（L. kefiri是专性异型发酵菌）以及缺乏复杂微生物联合体的协作效应。基因组功能注释与代谢物谱的整合分析表明，L. kefiri SLAM023B通过其蛋白水解和脂肪酸代谢基因，可能为风味形成提供前体（如氨基酸和脂肪酸），而K. marxianus SLAM005Y则利用这些前体，通过其Ehrlich通路和酯化途径，合成主要的挥发性风味化合物（如杂醇和酯类）。然而，在共培养中，来自L. kefiri的额外氨基酸前体并未显著提升K. marxianus的杂醇产量，这表明Ehrlich通路可能已接近底物饱和或受其他因素（如细胞内氧化还原平衡）调控。挥发物分析显示，醛类向醇类的转化在单培养中占主导，而脂肪酸和酯类的形成在共培养中增强，提示两种菌株之间存在代谢角色的分工。当前框架缺乏量化动态代谢流和通路调控机制的分辨率，且单一时间点的分析限制了对前体-产物动态关系的评估。未来需要整合多组学（如转录组学、蛋白质组学）、代谢流分析（如稳定同位素示踪）以及感官评价，以构建一个更动态和可预测的风味发展模型，从而指导优化混合培养发酵策略。
结论部分翻译：本研究通过整合L. kefiri SLAM023B和K. marxianus SLAM005Y的基因组解析功能注释与代谢物分析，阐明了发酵牛奶开菲尔中风味形成的协作代谢机制。对15种代表性挥发性化合物的靶向分析表明，风味生物合成受菌株特异性代谢活动和潜在的交叉喂养相互作用共同调控。K. marxianus SLAM005Y主要介导氧化转化和酯化，而L. kefiri SLAM023B则贡献了还原性转化，表明氧化和还原途径之间存在互补的代谢活动。总之，这些发现突出了牛奶开菲尔发酵中细菌和酵母物种之间的互补代谢相互作用，并为混合培养乳品发酵中工程化和优化风味发展提供了可预测的基因组学框架。未来整合多组学方法、代谢流分析和感官评价的研究将进一步阐明牛奶开菲尔发酵中微生物相互作用和风味形成背后的动态调控机制，尤其是在更复杂的微生物群落中。
